過表達組蛋白甲基轉移酶ASH1L對牛卵丘細胞增殖和凋亡的影響

王婉潔,陳南珠,鄒惠影,周心儀,郝海生,龐云渭,朱化彬,趙學明,余大為,杜衛華

(中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所,北京 100193)

卵巢卵泡是決定雌性哺乳動物生殖壽命、不可再生的基本功能單位[1]。在卵泡中,卵丘細胞(cumulus cells,CCs)是包裹卵母細胞的重要體細胞,屬于顆粒細胞(granulosa cells,GCs),對卵巢發育、卵母細胞成熟和胚胎發育有重要調控作用[2]。CCs與卵母細胞形成卵丘-卵母細胞復合體(cumulus-oocyte complex,COCs),通過縫隙連接進行物質交換來調控卵母細胞的成熟,為早期胚胎的發育提供物質基礎[3]。CCs的增殖與卵泡發育密切相關,凋亡可引起卵泡閉鎖,其增殖和凋亡之間的相對平衡對卵巢發育和卵母細胞成熟有至關重要的影響[4]。

在細胞生長和分化過程中,存在廣泛的表觀遺傳修飾。組蛋白甲基化作為一種重要的表觀調控機制,在基因的表達及沉默、細胞分化、異染色質形成、基因印跡等方面發揮著重要作用[5]。組蛋白甲基化也參與卵泡發育和卵母細胞成熟的調控[6-7],可以改變卵泡的發育命運。缺失的、小的、同源異形1(absent,small,or homeotic 1-like,ASH1L)是組蛋白賴氨酸甲基轉移酶,由位于染色體帶1q22的ash1 l基因編碼,首次發現于果蠅[8],因其基因突變導致的同源異形的表型與三胸腔結構蛋白(trithorax,Trx)的突變體相似而被歸類于TrxG蛋白家族[9]。牛ASH1L蛋白含有2 965個氨基酸,包含SET(su(var)3-9,enhancer-of-zeste and trithorax)、AWS(associate with SET)、Post-SET、Bromo和BAH(bromo adjacent homology)等已知結構域,其中SET域具有催化功能,負責將一個甲基從S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine,SAM)輔助因子轉移到賴氨酸底物[10]。在哺乳動物中,ASH1L可特異性催化H3K36甲基化,是染色質的激活標記[9,11]。在果蠅的活性基因中,ASH1能通過干擾核小體上多梳抑制復合體2(polycomb repressive complex2,PRC2)的活性來抑制H3K27甲基化,從而促進基因表達[12]。Ash1 l突變導致部分仔鼠出生后死亡,存活的突變小鼠則存在小鼠附睪(雄性)和子宮(雌性)發育缺陷導致的生長不足和不育[13]。在牛CCs中,下調ASH1 L表達可降低H3K36 me1/2/3水平,抑制細胞增殖,誘導細胞凋亡[14]。在小鼠中,Ash1 l通過調控Hox(Homebox gene)和Smad3(drosophila mothers against decapentaplegic protein 3)基因的表達調節骨髓間充質干細胞的成骨分化,促進細胞的生長發育[15]。通過調節小鼠減數分裂前期I中p63和p-CHK2的表達,Ash1 l可保護卵母細胞基因組的完整性,清除具有嚴重DNA損傷的卵母細胞;過表達Ash1 l可通過調節DNA損傷而誘導細胞凋亡,進而導致胎兒中卵母細胞的急劇丟失和原始卵泡池的容量減少[16]。

綜上所述,ASH1L甲基轉移酶的相關研究主要集中于果蠅、小鼠及人,而其在調控家畜細胞分化和胚胎發育方面的作用還未被揭示。本研究以牛CCs為試驗對象,研究ASH1L過表達對牛CCs中H3K36甲基化狀態、細胞增殖和細胞凋亡的影響,為深入研究組蛋白甲基化酶ASH1L對牛CCs生長的調控作用提供依據,為卵泡發育、卵母細胞成熟和胚胎發育提供重要的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

如無特殊說明,本研究所用試劑均購自西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司;DMEM/F12培養基、TCM199、0.25%胰酶、血清和DPBS購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司;ASH1L兔多克隆抗體購自Bethyl Laboratories公司;辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋公司;高靈敏度化學發光液測試試劑盒購自北京聚合美生物科技有限公司;H3K36 me1/2/3兔多克隆抗體購自艾博抗(上海)貿易有限公司;AlexaFluor 488標記的山羊抗兔IgG購自Cell Signaling Technology(CST)公司。

1.2 ASH1L過表達載體的構建

參考Xia等[17]的報道,ASH1L SET結構域具有甲基轉移酶功能;本試驗按照NCBI提供的牛ASH1L基因的編碼序列(登錄號:NC_037 330.1),擴增包括SET結構域的第2 141位氨基酸到終止密碼子的ASH1L片段,長度為2 478 bp。根據目的片段設計攜帶kozak(GCCACC)、起始密碼子(ATG)及NheI(CTAGCTAGC)和NotI(ATAGTTTAGCGGCCGC)酶切位點的引物,由北京六合華大基因科技有限公司合成,引物序列見表1。以牛CCs的cDNA為模板,采用PCR擴增目的片段,PCR反應條件為:98 ℃預變性5 min;98 ℃變性10 s,60 ℃退火1 min,68 ℃延伸1.5 min,35個循環;68 ℃延伸5 min,4 ℃保持。擴增產物經酶切后,鑒定獲得序列長度符合預期的片段。T4連接酶將該片段連接到經NheI/NotI雙酶切的pcDNA3.1載體上,轉化細菌,并挑菌測序。測序正確的質粒命名為pcDNA3.1+ASH1L,并用去內毒素質粒DNA提取試劑盒(OMEGA,美國)提取、純化質粒,-20 ℃保存,用于后續試驗。

1.3 牛CCs的體外培養

參照Wang等[18]的文獻,從當地屠宰場收集牛卵巢,用含100 IU·mL-1青霉素和100 mg·mL-1硫酸鏈霉素(1% PS)的30 ℃生理鹽水洗滌,2～3 h 內運回實驗室。從2～6 mm卵泡中抽出COCs,用含10%血清(FBS)、0.01 IU·mL-1卵泡刺激激素(FSH)、1 IU·mL-1黃體生成素(LH)、1 μg·mL-1雌二醇(E2)、10 μg·mL-1肝素(HP)、40 ng·mL-1胰島素生長因子(IGF)和50 ng·mL-1上表皮生長因子(EGF)的TCM199配制成的成熟液于38.5 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養22 h。用0.1%透明質酸酶消化成熟后的COCs,2 min后加入預熱、含10% FBS的TCM199終止消化。將CCs懸浮液移入離心管,1 000 r·min-1離心5 min,棄上清。用DPBS離心洗滌兩次后,DMEM/F12培養基(含10% FBS和1% PS)重懸細胞沉淀,混勻移入六孔板,于38.5 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養。

1.4 細胞轉染

六孔板中接種的細胞生長至70%～80%匯合度時進行細胞轉染。先用Opti-MEMTM培養基稀釋LipofectamineTM3 000試劑,充分混勻后室溫靜置5 min;同時用Opti-MEMTM培養基稀釋質粒DNA,制備DNA預混液,添加P3000TM增強劑,充分混勻;然后按1∶1的比例混和已稀釋的LipofectamineTM3000和質粒DNA,形成DNA-脂質復合物,室溫孵育10～15 min。隨后將DNA-脂質復合物加入細胞培養孔中,于38.5 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養,6 h后更換為DMEM/F12培養基(含10% FBS和1% PS),24 h收集細胞用于后續試驗。轉染pcDNA3.1+ASH1L載體的細胞為過表達組(ASH1L-OE),未轉染載體的細胞為對照組(Control)。

1.5 熒光定量PCR(quantitative RT-PCR,RT-qPCR)

載體質粒轉染后24 h,分別收集對照組和過表達組細胞,參照動物細胞RNA提取試劑盒說明書(QIAGEN,德國)提取RNA,并反轉錄成cDNA,利用CFX96TM實時熒光定量PCR儀(BIO-RAD,美國)進行基因表達水平的定量檢測。選擇的基因包括牛ASH1 L、BCL-2、BCL-2相關X蛋白(BCL-2 associated X,BAX)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase,CASPASE-3)、增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、細胞分裂周期蛋白42(cell division cycle 42,CDC42)、周期素D2(cyclin D2,CCND2)和GAPDH。以上基因的引物參考Tian等[19]的研究,并由北京六合華大基因科技有限公司合成,引物序列見表1。反應體系為20 μL:上、下游引物各0.4 μL,cDNA模板2 μL,TB green Premix EX Taq(Tli RNaseH Plus)10 μL,ddH2O 6.8 μL,ROX Reference Dye II 0.4 μL。反應程序為:95 ℃預變性30 s;95 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s,共40個循環。每個樣品重復3次,以GAPDH為內參基因,采用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量,ΔΔCt=[(Ctgene-CtGAPDH)]過表達組-[(Ctgene-CtGAPDH)]對照組。

1.6 免疫熒光染色

將細胞預先接種到細胞共聚焦培養皿中,細胞匯合度達到70%～80%時轉染過表達載體質粒,24 h后將對照組和過表達組細胞進行免疫熒光染色。用DPBS清洗細胞3次,4%多聚甲醛室溫固定1 h,并于0.2% Triton X-100中通透40 min。用含1% BSA的DPBS(DPBS+1% BSA)清洗3次,每次5 min,細胞于DPBS+1% BSA中37 ℃封閉1 h。用含0.02% Triton X-100和1%BSA的DPBS清洗3次后,細胞于一抗(兔來源H3K36 me1/2/3抗體的稀釋比例為1∶200,兔來源ASH1L抗體的稀釋比例為1∶50)中4 ℃孵育過夜;清洗3次,于二抗(Alexa Fluor 488標記的山羊抗兔IgG稀釋比例為1∶1 000)中37 ℃孵育1 h。清洗3次后,細胞于1.5 μg·mL-1DAPI液中室溫、避光孵育5 min;清洗后,于激光共聚焦顯微鏡(Leica,德國)下觀察,并收集圖像。采用Image J軟件對免疫熒光圖片的信號進行分析。每個試驗至少進行3次重復,數據值的平均值即為該組的熒光強度值。以對照組熒光強度值為參考,采用歸一法進行相對熒光強度分析。

1.7 蛋白免疫印跡(western blotting,WB)

載體質粒轉染后24 h,分別收集對照組和過表達組細胞,加入200 μL含1%抑制劑PMSF的細胞裂解液,冰上靜置20～30 min,振蕩使細胞充分裂解,細胞懸液于4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min,利用BCA蛋白濃度測定試劑盒(金浦來,中國)測定蛋白濃度。取上清與緩沖液(1∶5)混合,震蕩混勻,100 ℃變性10 min。變性蛋白經4%～15%梯度SDA-PAGE凝膠電泳分離,之后300 V、200 mA將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上。用5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h,濾膜于兔源ASH1L一抗(稀釋比例1∶1 000)中4 ℃孵育過夜;TBST清洗3次后,濾膜于HRP標記的二抗(稀釋比例1∶5 000)中37 ℃孵育1 h,TBST清洗3次后,用ECL發光液試劑盒顯影,于化學發光儀(天能,中國)中曝光,拍照保存。

1.8 細胞增殖檢測

根據CCK-8試劑盒(碧云天,中國)說明書,貼壁CCs用0.25%胰酶消化、DPBS洗滌后,按照2×103個·mL-1的密度,把細胞接種到96孔板中。培養24 h后,將pcDNA3.1+ASH1L質粒轉染CCs,并分別于轉染0、24、36、48、72 h,每孔加入10 μL WST-8試劑,避光孵育2 h,用酶標記儀(Tecan,瑞士)檢測450 nm處的吸光值。對照組細胞也進行同樣處理,記錄各時間段的吸光值。

1.9 細胞凋亡檢測

采用Annexin V-FITC/碘化丙啶(Propidium iodide,PI)熒光雙染細胞凋亡檢測試劑盒(碧云天,中國)進行凋亡分析。載體質粒轉染后24 h,將對照組和過表達組CCs用0.25%胰酶消化,終止消化后收集細胞懸液,1 000 r·min-1離心5 min。PBS洗滌細胞,離心獲得的細胞用Annexin V-FITC/PI室溫染色10 min。采用FACSVerse流式細胞儀(Becton Dickinson,美國)進行活細胞率、壞死細胞率、早期凋亡率和晚期凋亡率的計算分析,凋亡率為早期凋亡率與晚期凋亡率之和。

1.10 統計分析

每個試驗至少重復3次,試驗結果以“平均數±標準差(SD)”表示。所有數據均采用SPSS 22.0軟件進行顯著性分析,用單因素方差分析(One-way ANOVA)判斷不同處理間的差異顯著性,P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

2 結 果

2.1 ASH1L過表達載體的構建和鑒定

牛ASH1L cDNA全長接近9 kb,構建攜帶該基因全長序列的過表達載體較為困難。通過對ASH1L各結構域的位置和功能分析(圖1A),本研究擬從其SET結構域的起始氨基酸位點(第2 141)開始,終止密碼子氨基酸為終點,擴增ASH1L基因片段,替代ASH1L全長序列。以牛CCs cDNA為模板,PCR擴增獲得包含牛ASH1L基因片段(長2 487 bp)、kozak序列、雙酶切位點及其保護堿基的序列(長2 512 bp,圖1B),并將其連接于pcDNA3.1載體。成功連接的載體經NheI/NotI雙酶切,獲得長度分別為5 351和2 512 bp的兩條片段(圖1C),與預期結果一致;對酶切鑒定正確的載體進行測序,序列正確的載體即為成功構建的ASH1L過表達載體,命名為pcDNA3.1+ASH1L,全長7 838 bp(圖1D),可用于后續試驗。

A.牛ASH1L蛋白的氨基酸序列及包含的結構域;B.以牛CCs cDNA為模板,PCR擴增目的片段,長2 512 bp;C.過表達載體pcDNA3.1+ASH1L雙酶切鑒定,泳道1、2、3、5為載體酶切后獲得的兩條片段,泳道4為未能被酶切的載體;D.過表達載體pcDNA3.1+ASH1L構建策略

2.2 牛CCs中ASH1L過表達效果的驗證

為評估轉染效率,將上述pcDNA3.1+ASH1L質粒和pmaxGFP質粒共轉染牛CCs。24 h后,鏡下可見綠色熒光(圖2A),通過流式分選出陽性細胞的比例約為75.83%(圖2B),可見轉染效率較高。pcDNA3.1+ASH1L轉染CCs,24 h收集過表達組細胞(ASH1L-OE);同時收集常規培養的CCs作為對照組(Control),采用RT-qPCR、WB和免疫熒光染色檢測細胞中ASH1L mRNA及其蛋白的表達。結果顯示,過表達組細胞中ASH1L mRNA水平極顯著高于對照組(P<0.01,圖2C)。與內源性ASH1L蛋白的分子量不同,外源ASH1L蛋白的分子量約為92 ku,過表達組細胞中可檢測到92 ku的目的蛋白條帶,而對照組則沒有檢測到(圖2D),說明過表達組細胞中有外源ASH1L蛋白的表達。此外,過表達組細胞中ASH1L蛋白的免疫熒光信號強度顯著升高(P<0.05,圖2E)。可見,本試驗構建的pcDNA3.1+ASH1L載體能在CCs中表達,可用于后續試驗。

A.質粒pcDNA3.1+ASH1L和pmaxGFP共轉染牛CCs 24 h后可觀察到綠色熒光;B.轉染24 h后流式分選出陽性細胞;C.過表達載體轉染后,ASH1L mRNA表達水平;D.過表達載體轉染后,ASH1L蛋白表達量;E.過表達載體轉染后,ASH1L甲基轉移酶的熒光染色及相對熒光強度。*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01),下同

2.3 過表達ASH1L對CCs中H3K36甲基化狀態的影響

ASH1L過表達載體轉染牛CCs 24 h后,細胞中H3K36 me1/2甲基化水平顯著升高(P<0.05,圖3A,3B),H3K36 me3水平高于對照組,但差異不顯著(P>0.05,圖3C)。

A,B,C.過表達ASH1L后,牛CCs中H3K36me1/2/3甲基化的熒光染色及其相對熒光強度

2.4 過表達ASH1L對CCs增殖的影響

ASH1L過表達載體轉染CCs 24和36 h后,細胞增殖率顯著高于對照組細胞(P<0.05);但在轉染48 h時,兩組間的細胞增殖率差異不顯著(P>0.05,圖4A)。ASH1L表達上調后,細胞增殖相關基因PCNA、CCND2 mRNA表達水平均顯著高于對照組細胞(P<0.05,圖4B、4C);而CDC42表達水平在兩組間差異不顯著(P>0.05,圖4D)。

2.5 過表達ASH1L對CCs凋亡的影響

ASH1L過表達組的活細胞率((91.85±1.25)%)顯著高于對照組((87.39±1.71)%),而細胞凋亡率((8.08±1.21)%)則顯著低于對照組((12.51±1.72)%,P<0.05)(圖5A)。相應地,過表達組細胞中促凋亡基因BAX和CASPASE-3 mRNA表達水平分別極顯著(P<0.01)和顯著地(P<0.05)低于對照組,而抗凋亡基因BCL-2 mRNA表達水平則極顯著地高于對照組(P<0.01,圖5B)。

3 討 論

一般組蛋白甲基轉移酶均包含SET結構域,可催化組蛋白氨基酸的甲基化修飾。ASH1L首次發現于果蠅,具有保守的SET結構域,屬于三胸腔結構蛋白(TrxG)家族,能催化H3K4和H3K36甲基化激活基因表達[20],從而調節細胞生長、胚胎發育及自身免疫應答等過程[21]。本試驗通過構建過表達載體上調牛CCs中ASH1L表達,并對細胞中組蛋白甲基化修飾、細胞凋亡與增殖,及其相關基因表達的變化進行深入研究。

據報道,小鼠ASH1L蛋白SET結構域中第2 212位氨基酸的突變能破壞其甲基轉移酶活性,導致H3K4甲基化水平降低,成骨和軟骨形成受阻,所以ASH1L SET結構域催化H3K4甲基化活性對于成骨和軟骨細胞分化是不可或缺的[22]。另外,含有Ash1L SET結構域片段的載體能達到過表達的效果,并誘導H3K4甲基轉移酶活性,增強去泛素化酶的表達,抑制白細胞介素-6和腫瘤壞死因子的產生[17];然而,ASH1L SET結構域的抑制劑AS-99在白血病細胞中表現出了顯著的抗白血病活性,可顯著阻斷人白血病細胞增殖,誘導細胞凋亡和分化[23]。通過擴增ASH1L C端的部分片段(1 892～2 969aa)成功構建了ASH1L過表達質粒來替代人的ASH1L的全長載體[24]。以上研究表明,ASH1L蛋白甲基化修飾的活性是由其中的SET結構域來維持的。所以,為了克服由于牛ASH1L cDNA較長而難以構建全長載體的問題,本研究擴增了含有SET結構域的牛ASH1L基因片段,構建了ASH1L過表達載體。該載體導入牛CCs后,細胞中H3K36甲基化水平和細胞增殖率升高,細胞凋亡率降低,與已有的研究結果一致。可見,牛ASH1L基因中SET結構域的片段可代替全長序列用于基因過表達研究。

ASH1L在哺乳動物神經系統的正常發育[25]、肌肉萎縮癥發病機制[21]和免疫細胞發育[26]等方面均發揮重要作用。組蛋白賴氨酸的甲基化修飾與基因的轉錄調控密切相關。在果蠅和哺乳動物中,ASH1L可甲基化轉錄激活標記H3K36,調控發育基因的表達[21]。在人的分化神經祖細胞(neuroepithelial cells,NPC)中,ASH1L能催化H3K36me2甲基化,其缺失降低了參與大腦發育的基因表達,這表明受損的神經發育相關基因表達可能是連接ASH1L的關鍵分子機制[27]。在人的前列腺癌細胞中過表達ASH1L顯著增加了H3K36me2的總體水平,但對H3K4me2/3水平沒有顯著影響[24]。ASH1L已被確定為驅動混合譜系白血病(Mixed linkage leukemia,MLL1)的致癌復合物的關鍵成分。在這種惡性腫瘤中,ASH1L被H3K36me2標記,這些標記被讀取蛋白(如晶狀體上皮衍生生長因子)“讀取”,導致關鍵白血病驅動因素(如HOX基因)的激活[28]。作為轉錄延伸因子,果蠅TrxG家族的KISMET與基因激活有關,其通過促進ash1l催化H3K36me2/3甲基化,從而激活轉錄發生[29]。在利什曼原蟲中,多諾瓦尼乳桿菌能可通過Ash1L介導的H3K4甲基轉移酶調控宿主的巨噬細胞極化;在感染后的巨噬細胞中敲低Ash1L基因表達顯著抑制了H3K4me3活性和細胞增殖,顯著減緩了炎癥發生[30]。在MLL-AF9誘導的白血病中,ASHIL可通過直接結合基因啟動子,并修飾局部組蛋白H3K36me2水平來激活MLL-AF9靶基因的表達[31]。此外,ASH1L基因的低表達導致了牛CCs中H3K36me1/2/3甲基化水平均顯著降低以及PRC2蛋白相關亞基EZH2和SUZ12基因表達量的升高[32]。本研究過表達ASH1L基因后,牛CCs中H3K3單甲基化、二甲基化水平均顯著升高,三甲基化水平也升高但不顯著,說明ASH1L可調控H3K36甲基化修飾,與之前的研究結果一致。

ASH1L廣泛表達于大腦、心臟和腎臟等多種組織器官[33]。在小鼠骨質疏松的骨骼中,Ash1 l表達水平顯著降低;野生型(wild type,WT)小鼠中敲降Ash1 l基因可導致小鼠關節炎,并抑制小鼠成骨和軟骨形成[22]。ASH1L表達下調導致MLL白血病細胞凋亡和生長停滯,并在體內終止了MLL白血病的發展[34]。在人中,ASH1L通常位于細胞核和細胞間緊密連接處,通過甲基化組蛋白H3K4和H3K36促進基因表達,并拮抗由Polycomb蛋白介導的基因沉默。敲低ASH1L誘導了前列腺癌細胞的周期停滯和凋亡[24]。同樣地,牛CCs中ASH1L基因的表達下調后,促凋亡相關基因CASPASE-3和BAX表達量、細胞凋亡率均顯著升高,說明ASH1L表達的缺失可促進細胞凋亡[14]。相反地,在小鼠的生殖系統中,Ash1l過表達導致DNA雙鏈斷裂修復的缺失,卵母細胞減數分裂前期中p63和磷酸化檢查點激酶2(p-CHK2)異常上調,誘導細胞凋亡導致卵母細胞大量丟失;而凋亡抑制劑則可以挽救過表達Ash1l引起的卵母細胞丟失[16]。本試驗過表達ASH1L顯著降低了牛CCs中CASPASE-3及BAXmRNA表達量、細胞凋亡率,顯著升高了BCL-2 mRNA表達量和活細胞率,所以上調ASH1L表達促進細胞生長,抑制細胞凋亡,但具體的作用機制還有待于進一步研究。

細胞增殖參與生物體的生長、發育、繁殖等許多重要的生命活動[35]。在卵泡發育過程中,PCNA表達水平的升高是顆粒細胞增殖的最早標記物[36]。細胞周期蛋白D2(cyclin D2,CCND2)的缺乏會阻礙卵巢中的顆粒增殖和卵泡生長,導致雌性小鼠不育[37]。上調細胞分裂周期蛋白42(cell division cycle protein 42,CDC42)可抑制雞GCs細胞凋亡,促進細胞增殖[38]。ASH1L過表達增強了乳腺癌和肝癌細胞的增殖,并導致侵襲性疾病的突發[34,39]。ASH1L基因表達與人和小鼠成肌細胞的融合呈正相關,其缺失會導致肌肉細胞中選擇性成肌細胞融合缺陷,不利于骨骼肌組織的形成、生長和修復[21]。在受傷小鼠中,ASH1L的突變使其表達異常升高后,會導致表皮細胞分化紊亂,角質細胞過度增殖,傷口愈合缺陷及皮膚增生[40]。本研究結果表明,上調牛CCs中ASH1L表達,則細胞增殖率、增殖相關基因PCNA、CCND2 mRNA表達量均顯著升高,與已有的研究結果一致。

4 結 論

本研究成功構建了牛ASH1L過表達載體,并建立過表達細胞模型。在牛CCs中,過表達ASH1L顯著提高了H3K36me1/2甲基化水平,促進細胞增殖,抑制細胞凋亡,為揭示ASH1L甲基轉移酶在家畜CCs生長和卵泡發育中的功能和調控機制提供了理論基礎。