NR2F2基因調控豬PK15細胞增殖和凋亡的研究

張萬鋒,趙天枝,李 嬌,尤紫薇,楊 陽,蔡春波,高鵬飛,曹果清,郭曉紅,李步高

(山西農業大學動物科學學院,太谷 030801)

細胞增殖是細胞重要的生命活動,也是機體生長、發育、繁殖和遺傳的基礎[1-3]。細胞增殖是一個復雜而有序的過程,主要受細胞周期因子和周期蛋白依賴激酶調控,這些基因由很多信號通路所調控,如Wnt信號通路、Notch信號通路、TGF-β信號通路,而這些通路又受到許多轉錄因子的調控[4-11]。

雞卵清蛋白上游啟動子轉錄因子2(COUP-TFII,也叫NR2F2)是核受體家族超家族成員,在1986年因直接結合于卵清蛋白的啟動子區調節其轉錄被發現[12]。在脊椎動物中,雞卵清蛋白上游啟動子轉錄因子家族由3個成員組成,核受體亞家族2組F成員1(NR2F1)、NR2F2和核受體亞家族2組F成員6(NR2F6)。雖然它們在不同的染色體上,但氨基酸序列是高度同源的[13]。NR2F2基因在組織中廣泛表達,在骨骼、肌肉、脂肪形成和代謝平衡中起重要調節作用[14-16]。NR2F2作為一種轉錄因子,通過多種機制調控下游靶基因的轉錄。NR2F2可以通過與DNA結合元件結合,直接或間接激活基因表達。NR2F2可以與Wnt家族成員10b(Wnt10b)啟動子區域結合,抑制Wnt10b的表達[17]。NR2F2可以與CCAAT增強子結合蛋白(C/EBPα)啟動子結合,抑制C/EBPα的表達[18]。NR2F2可以與維甲酸X受體(RXR)的DNA結合位點競爭性結合[19]。NR2F2還作為一種轉錄抑制劑,可與RXR和甲狀腺激素受體相互作用,抑制PPAR的表達[20]。此外,NR2F2還可以通過直接結合RXR的LBD結構域來抑制核受體的轉錄[21]。

為了確定NR2F2基因對細胞增殖的作用機制,Ma等[22]研究發現,在WJ-MSCs細胞中敲除NR2F2基因后導致CyclinD1和CDK4表達降低,細胞增殖減慢。Qin等[23]對敲除NR2F2基因的PC3細胞與正常細胞進行了轉錄組比較,通過基因富集發現,在NR2F2基因表達低時,TGF-β信號通路下游調控的基因全部富集,說明NR2F2能調控TGF-β信號通路。敲除NR2F2基因后,顯著改變了TGF-β信號通路下游基因p21、p15和CyclinD1的表達。Wang等[24]研究發現,NR2F2基因在直腸癌細胞中與PTEN、Smad4基因的表達相關,而Smad4基因是TGF-β信號通路的關鍵基因。Smad4基因主要功能是參與TGF-β信號通路的信號傳導。進一步研究發現,NR2F2蛋白能夠與Smad4蛋白結合,與突變型的Smad4不能結合,直接證明了NR2F2與Smad4之間的結合作用。表明在癌細胞中,NR2F2基因可以通過與Smad4基因相互作用,進而影響TGF-β信號通路傳導。

目前,圍繞NR2F2基因的研究主要集中在其對人類癌癥等疾病、小鼠肌肉與脂肪等組織的作用機理,針對NR2F2基因調控豬源細胞增殖的機制還未見報道。本試驗旨在探究NR2F2基因對細胞增殖、凋亡的影響,為進一步研究豬生長發育的分子機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系和質粒 本研究中使用的PK15細胞和293 T細胞來自山西農業大學動物遺傳育種與繁殖博士點實驗室。

pLenti-CMV-GFP-SV-puro、pLenti-CMV-NR2F2-GFP-SV-puro、pCMV-dR8.91、pCMV-VSV-G、pCDNA3.1-Flag、pCDNA3.1-Flag-NR2F2、pHS-CR054、pHS-CR054-sg1、pHS-CR054-sg2質粒均為山西農業大學動物遺傳育種實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 PrimeScriptTMRT Master Mix、RNAiso Plus regent和SYBR Premix Ex Taq II購于TaKaRa公司;PBS粉末、青鏈霉素混合液、胰蛋白酶購于中國索萊寶公司;FBS和DMEM購自Gibco公司;兔二抗、鼠二抗購于LI-COR公司;Lipofectamine 3000購自Invitrogen公司;CCK-8試劑盒購自Dojindo公司;EdU試劑盒、細胞周期試劑盒、細胞凋亡試劑盒購自凱基生物公司;RIPA裂解液(強)、蛋白酶抑制劑、蛋白凝膠試劑盒、NC膜、脫脂奶粉購自博士德公司;β-actin抗體購自博奧森公司;NR2F2抗體購自Abcam公司;PCNA抗體購自CST公司;siRNA購自吉瑪公司,siRNA序列見表1。

表1 siRNA序列

1.2 試驗方法

1.2.1 慢病毒包裝及轉染細胞 轉染前1 d,胰酶消化293 T細胞,接種細胞于10 cm細胞培養皿,培養1 d,當細胞濃度達到60%～80%時進行轉染。用Lipofectamine 3000將10 μg pLenti-CMV-GFP-SV-puro或pLenti-CMV-NR2F2-GFP-SV-puro質粒與7.5 μg pCMV-dR8.91、5 μg pCMV-VSV-G包裝質粒共轉染293 T細胞中,轉染6 h后,更換為完全培養基,繼續培養48、72 h后,收集293 T細胞培養液,4 ℃、1 000 r·min-1離心5 min,去除細胞碎片,0.45 μm針式濾器過濾,收集病毒液置于-80 ℃冰箱,用于感染PK15細胞。

將PK15細胞接種于6孔板中,待細胞匯合度達到50%～60%,每孔加入1 mL病毒上清液,感染6 h后,更換為完全培養基培養,感染72 h后,熒光顯微后熒光顯微鏡檢測EGFP的表達,形成穩定轉染NR2F2基因的細胞。

1.2.2 質粒和siRNA轉染 PK15細胞接種至10 cm培養皿中,使用含10%FBS和1%雙抗的低糖DMEM培養基在37 ℃,5% CO2條件下進行培養。將細胞進行消化計數,接種至6孔板中,細胞生長匯合至40%～50%即可進行轉染。利用Lipofectamine 3000脂質體分別將pHS-CR054、pHS-CR054-sg1、pHS-CR054-sg2質粒、siRNA-NC及siRNA-Smad4轉染至PK15細胞中,每組3個重復。按轉染試劑操作說明,取兩個1.5 mL離心管,分別加入125 μL DMEM培養液,然后于其中一管加入100 pmol siRNA或4 μg質粒吹打混勻;另一管加入10 μL轉染試劑吹打混勻,室溫靜置5 min后,將含有siRNA或質粒的培養液加入含轉染試劑的培養液中吹打混勻,室溫靜置20 min。將制備好的轉染溶液加至6孔板,并用DMEM加至每孔2 mL,于37 ℃,5% CO2中培養,6 h后更換為含10%胎牛血清的培養液。轉染后觀察結果并收取細胞進行后續試驗。

1.2.3 RNA提取及實時熒光定量PCR 使用RNAiso Plus提取總RNA,提取方法參照試劑盒說明書。將提取的總RNA用核酸蛋白測定儀測定其純度及濃度,OD260nm/OD280 nm為1.8～2.0的總RNA用于后續研究,采用PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒將RNA反轉錄成cDNA。

以18 S rRNA為內參基因,采用qRT-PCR對基因的表達水平進行檢測。qRT-PCR反應體系:cDNA 2 μL,2×SYBR Premix Ex TaqⅡ10 μL,上、下游引物(表2)各0.5 μL,RNAase Free ddH2O補至20 μL。反應程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,35個循環;熔解曲線程序為95 ℃ 15 s,60 ℃ 35 s,95 ℃。結果采用2-ΔΔCt法進行分析,每個樣本做3次重復。

表2 qRT-PCR引物序列

1.2.4 總蛋白提取和Western blot檢測 提取細胞總蛋白,利用核酸蛋白濃度測定儀測定蛋白濃度。取200 ng蛋白上樣,進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結束后,采用濕轉法進行轉膜,5%封閉蛋白粉室溫封閉1 h,一抗采用1∶1 000稀釋,4 ℃孵育過夜。隔天回收一抗,PBST洗膜3次,加入熒光二抗,避光室溫孵育1 h,洗膜后使用LICOR儀器曝光,使用儀器自帶軟件Image Studio計算分析條帶光密度值。

1.2.5 CCK-8、EdU試驗 將細胞接種至96孔細胞板中,每孔細胞約1 000個,在鋪板后0、1、2、3、4、5 d分別進行檢測,檢測前每孔加入10 μL的CCK-8試劑,在細胞培養箱孵育3 h后,使用酶標儀檢測450 nm吸光度。

取處于對數生長期的細胞,以每孔4 000～10 000個細胞接種于96孔板中,每孔加入100 μL EdU染液和100 μL Hoechst33342溶液,染色完畢后使用熒光顯微鏡成像。

1.2.6 流式細胞術檢測 將細胞接種至6 cm細胞培養皿,培養至細胞濃度80%～90%時,收集的細胞在70%冷乙醇中重懸,4 ℃固定過夜,復溫后加入400 μL PI染色,4 ℃避光孵育30 min,流式細胞儀檢測。

將細胞接種至6 cm細胞培養皿,培養至細胞濃度80%～90%時,PBS洗2次,收集細胞;加入500 μL的Binding Buffer懸浮細胞,加入5 μL Annexin V-APC混勻后,加入5 μL 7-AAD染液,混勻,室溫、避光、孵育15 min;流式細胞儀檢測。

1.2.7 傷口愈合試驗 將細胞接種至6孔板中,待其長滿后,用1 mL藍槍頭在六孔板內劃線,PBS清洗2次,加培養基繼續培養,觀察0、12、24、36、48 h時劃痕處細胞的生長狀態。

1.2.8 CO-IP試驗 收集轉染了過表達NR2F2且攜帶Flag標簽蛋白載體的PK15細胞,加入40 μL Flag樹脂的裂解液在4 ℃下輕輕搖晃孵育過夜,然后用500 μL細胞裂解緩沖液漂洗樹脂,混勻儀上室溫漂洗5 min,4 ℃ 500 r·min-1離心5 min,重復3次,加入50 μL洗脫緩沖液,漩渦震蕩20 s,放搖勻儀上,室溫洗脫10～15 min,漩渦震蕩20 s,4 ℃ 12 000 r·min-1離心5 min,取上清到新的離心管中,用于Western blot。

1.2.9 數據分析 應用SPSS 22.0進行統計分析。數據采用單因素方差分析和獨立樣本t檢驗進行比較,P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

2 結 果

2.1 慢病毒包裝及NR2F2基因過表達效率

病毒液感染PK15細胞48 h后,熒光顯微鏡觀察發現OE-NC組和OE組都表達了綠色熒光蛋白(圖1A)。qRT-PCR和WB檢測過表達NR2F2基因的效率,結果發現,慢病毒液感染PK15細胞后,NR2F2基因mRNA水平和蛋白水平極顯著增加(P<0.01,圖1B～D)。

A.綠色熒光蛋白EGFP表達(標尺為100 μm);B～D.過表達NR2F2基因mRNA和蛋白水平表達。“**”表示差異極顯著(P<0.01),“*”表示差異顯著(P<0.05)。下同

2.2 過表達NR2F2基因對細胞增殖、凋亡的影響

慢病毒感染PK15細胞后,結果顯示Ki67基因mRNA表達極顯著增加(P<0.01,圖2A);qRT-PCR、WB檢測結果顯示,PCNA表達量顯著增加(P<0.05,圖2A、2B、2C)。CCK-8結果顯示,過表達NR2F2基因后細胞的吸光度值隨著時間的增加極顯著上升(P<0.01),差異具有統計學意義,表明促進了細胞的增殖(圖2D)。EdU結果顯示,過表達NR2F2基因后S期細胞數量顯著增多(P<0.01),表明促進了細胞的增殖(圖2E、F)。流式細胞儀檢測過表達NR2F2基因后細胞周期變化,發現過表達NR2F2基因后,處于G1期細胞的數量顯著低于對照組(P<0.01),S期細胞的數量顯著高于對照組(P<0.01),表明NR2F2基因可以改變細胞周期,促進G1期向S期轉變,從而促進細胞增殖(圖2G、H)。通過流式細胞儀檢測過表達NR2F2基因對細胞凋亡的影響,結果發現,過表達NR2F2基因后,早凋細胞占比增多,晚凋細胞占比減少,表明NR2F2基因可以抑制細胞的凋亡(圖2I)。通過劃痕試驗檢測NR2F2基因對細胞遷移的影響,結果表明,過表達NR2F2基因后,細胞遷移速度加快,在48 h后基本匯合,而對照組細胞還未完全融合(圖2J)。

2.3 NR2F2與Smad4物理結合并調控其表達進而影響下游基因的表達

為了確定NR2F2基因調控細胞增殖的具體機制,本研究通過蛋白相互作用軟件預測了一些與NR2F2相互作用的蛋白。發現能與NR2F2互作的蛋白有15個,其中我們將關注點聚焦在Smad4蛋白上(圖3A)。進行了Co-IP分析來檢測NR2F2和Smad4之間的相互作用。用Flag標簽蛋白調取與它結合的復合物,能檢測到Smad4蛋白,說明NR2F2蛋白能與Smad4蛋白相互作用行使功能(圖3B)。

為了探究NR2F2基因是否調控Smad4基因的表達,檢測了過表達和敲除NR2F2基因對Smad4基因表達的影響,發現過表達NR2F2基因后,Smad4基因表達量升高(P<0.01,圖4A),下游基因CyclinB、CDK1、CDK4、CyclinD1表達量均顯著上升(P<0.01,P<0.05,圖4C);而敲除NR2F2基因后,Smad4基因表達量降低(P<0.01,圖4B),下游基因CyclinB、CDK1、CDK4、CyclinD1表達量均顯著下降(P<0.01,圖4D)。

A.過表達NR2F2后Smad4的表達變化;B.敲除NR2F2后Smad4的表達變化;C.過表達NR2F2后Smad4調控的下游基因的表達變化;D.敲除NR2F2后Smad4調控的下游基因的表達變化。不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01);不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),下同

挽救試驗中,在過表達NR2F2基因后,干擾Smad4基因表達,Smad4表達量顯著降低(P<0.01,圖5A),且能夠顯著緩解過表達NR2F2基因引起的Smad4下游基因CyclinD1、CyclinB、CDK1的表達的升高,降低了它們的表達量(P<0.01,P<0.05,圖5B)。通過檢測增殖相關基因的表達,結果發現,干擾Smad4基因表達,能緩解過表達NR2F2基因對細胞增殖的影響,PCNA和Ki67的表達量顯著降低(P<0.01,P<0.05,圖5C)。

A.干擾Smad4的效率;B.過表達NR2F2且干擾Smad4后下游基因表達的變化;C.過表達NR2F2且干擾Smad4后增殖基因表達的變化

3 討 論

NR2F2作為一種轉錄因子,在細胞的生命過程中起著重要的作用。嚙齒類動物的遺傳模型揭示了NR2F2基因在脂肪形成、脂質代謝、肝臟糖異生、胰島素分泌和血壓調節等生物過程中的重要作用[25-27]。本研究發現,在PK15細胞中,NR2F2基因促進細胞增殖。NR2F2基因對PK15細胞的生長促進作用是通過加速細胞周期從G1期到S期的進程來介導的。這些結果表明,NR2F2基因能促進細胞增殖。在之前的研究中,NR2F2已被證明在細胞的增殖中發揮促進作用。NR2F2在多種腫瘤細胞中高表達,促進細胞增殖,抑制細胞凋亡[28]。在腎細胞癌細胞中,下調NR2F2可通過上調BRCA1來抑制細胞增殖并誘導細胞凋亡[29]。NR2F2通過調節IGF-1表達來調節小鼠出生后小腦的生長和成熟[30]。過表達NR2F2基因可改變細胞粘附蛋白和細胞增殖的表達[31]。敲除NR2F2后,Ki67基因表達減少,細胞增殖被抑制,凋亡細胞增加[32]。NR2F2沉默后,細胞增殖和侵襲減少,細胞被阻斷在G1期[33]?？梢?NR2F2基因在細胞增殖中起著重要作用,但其具體的作用機制還需進一步研究。

NR2F2基因屬于核受體轉錄因子家族。作為一種轉錄因子,NR2F2不直接調節激酶活性。NR2F2可能通過調節其他基因的表達來調節激酶活性。在不同的細胞模型中,ERα、CEBP/α、Wnt10b已被證明受NR2F2的調控。在本研究中,通過蛋白質相互作用軟件預測了一些與NR2F2相互作用的蛋白質,發現有15個蛋白可以與NR2F2相互作用,其中,Smad4比較值得注意。本研究采用Co-IP直接驗證了PK15細胞中NR2F2蛋白與Smad4蛋白的結合。而過表達NR2F2可提高Smad4的水平。NR2F2的沉默可降低Smad4的水平。這說明NR2F2可能改變了Smad4基因的表達。

Smad4為抑癌基因,屬于Smad家族。轉化生長因子-β(TGF-β)信號可以通過以下反應激活:1)TGF-β與受體結合,然后誘導Smad2/3磷酸化;2)共同介質Smad4與磷酸化的Smads結合,然后遷移到細胞核;3)Smad復合物與各種轉錄因子相互作用,然后調節細胞的增殖和遷移。先前的研究表明,Smad4的缺失會影響細胞的增殖和遷移。敲除Smad4的細胞增殖較慢,細胞遷移減少[34-35]。miR-144可以靶向Smad4基因,降低Smad4基因的表達,從而抑制細胞增殖和遷移[36]。Smad4基因表達水平的降低增加了對DNA拓撲異構酶抑制劑的敏感性,促進細胞凋亡,從而抑制細胞增殖[37]。這些研究表明Smad4可以調節細胞周期。

TGF-β信號通路在組織發育、穩態和修復中起著重要作用,并調控細胞增殖、分化、凋亡和遷移等細胞過程[38-39]。Smad4作為唯一的通用受體和TGF-β信號通路的中介,在將受體信號轉導到核中的靶基因中起核心作用[40]。Smad4的異常表達可引起細胞中TGF-β超家族成員的異常變化,影響下游靶基因的表達,并影響細胞的生長發育。細胞增殖周期相關因子是TGF-β信號通路的下游效應因子[41]。研究發現,敲除NR2F2可以顯著下調細胞周期相關基因的表達;而過表達NR2F2可顯著上調細胞增殖周期相關基因的表達。挽救試驗中過表達NR2F2和干擾Smad4后,可以有效緩解過表達NR2F2基因的影響。這說明NR2F2通過與Smad4相互作用,影響TGF-β信號通路,從而影響細胞增殖周期相關因子的表達。因此,發現NR2F2通過影響Smad4基因的表達來影響細胞增殖。

4 結 論

過表達NR2F2基因后促進了細胞的增殖,抑制了凋亡,且NR2F2蛋白能與Smad4蛋白結合并影響Smad4基因的表達,進而影響下游基因的表達。