沙門菌分子檢測方法的研究進展

張 萍,莊林林,張 笛,董永毅,盛中偉,王成明,徐 步,竇新紅,龔建森*

(1.中國農業科學院家禽研究所,揚州 225125;2.江蘇農林職業技術學院畜牧獸醫學院,句容 212400;3.江蘇省動物疫病預防控制中心,南京 210036;4.奧本大學獸醫學院,奧本36849)

沙門菌(Salmonella)是一種常見的食源性致病菌,常寄居在人和動物體內,特別是家禽、家畜的腸道中。沙門菌主要通過污染食品進而導致人類食物中毒,因而在公共衛生方面具有重要意義[1]。全世界因沙門菌感染引起的食物中毒病例常年高居首位[2],其中非傷寒沙門菌感染約導致15.5萬人死亡,9 380萬人患病[3],中國每年的發病人數也超過300萬[4]。2015年,世界衛生組織對全球食源性疾病的調查報告顯示,沙門菌發病數在22種細菌、病毒和原蟲疾病中排名第一[5]。

沙門菌屬包含腸道沙門菌(Salmonellaenterica)和邦戈爾沙門菌(Salmonellabongori)2個種,其中腸道沙門菌種又包含6個亞種[6]。此外,不同抗原型(菌體O抗原、鞭毛H抗原和莢膜Vi抗原)的沙門菌根據疾病類型(如雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌等)或首次發現地點(如海德爾堡沙門菌、印第安納沙門菌、肯塔基沙門菌等)命名為特定的血清型(其中具有相同O抗原的血清型隸屬于同一血清群),目前報道的血清型種類已超過2 600種[7-8],沙門菌分類的復雜性無疑給檢測、分型、溯源等工作增加了難度。傳統沙門菌檢測方法包括增菌培養、選擇分離、生化鑒定和血清學分型等,通常耗時5～7 d,不利于及時發現和控制病原的流行[9]。1992年,Rahn等[10]首次根據鼠傷寒沙門菌invA基因設計引物并建立PCR檢測方法,開創了沙門菌分子檢測的先河。此后,隨著分子生物學的快速發展及基因組數據的不斷豐富,基于沙門菌特異性核酸靶點的分子檢測方法的研究報道日益增多,目前可從沙門菌屬、種、血清群、血清型等多個層面分別進行檢測[11]。

本文旨在對近三十年來國內外報道的各類沙門菌分子檢測方法(包括聚合酶鏈式反應、熒光定量PCR、多重PCR和環介導等溫擴增技術等)進行總結,并從屬、種、血清群、血清型等不同層面進行梳理歸類,以期為沙門菌分子檢測方法的廣泛應用提供參考。

1 沙門菌分子檢測的研究背景

1.1 傳統檢測方法存在的問題

沙門菌的傳統檢測采用選擇性培養結合生化分析的方法,該方法要求樣品中細菌濃度需達到20～200 CFU·mL-1以上,靈敏度偏低[12];大多數樣品還需進行增菌培養才能成功分離,操作繁瑣,周期較長;部分特殊樣品(如受高溫、高鹽、冷凍等處理)易出現“活的非可培養狀態”,難以通過傳統方法檢測;此外目前商品化的沙門菌選擇性培養基種類繁多,但每種培養基均可能存在難以培養的沙門菌血清型或菌株,因而至少需要同時使用2種以上培養基來提高分離效率,增加了檢測的難度和費用。

1.2 沙門菌血清學分型存在的問題

沙門菌血清學分型結果可以為流行病學調查、病原溯源等提供重要依據。沙門菌血清學分型依賴特異性強的分型血清進行凝集試驗,依據Kauffmann-White血清分型表可鑒定得到不同菌株的血清型[13-14]。但是該方法操作較為繁瑣復雜,效率較低,對分型血清質量要求也較高,如果血清特異性不強極易產生交叉反應,進而造成錯誤分型[15],而且血清品種不全也會影響到分型的順利開展;此外,一些特殊狀態的細菌需處理后再進行鑒定,如產生自凝的菌株,O抗原(H抗原)表達較弱的菌株等[16-17]。

1.3 沙門菌分子檢測方法的特點

基于沙門菌特異性核酸靶點建立的分子檢測方法(如常規PCR、熒光定量PCR、多重PCR、環介導等溫擴增等)已在病原快速檢測方面發揮重要作用。常規PCR技術根據沙門菌屬(型)等特異性靶點設計引物進行體外擴增,靈敏度高、特異性強,簡單快速[11]。熒光定量PCR技術可在擴增的每個循環中標記和監測PCR 產物,其檢測靈敏度和特異性優于常規PCR[18]。多重PCR技術通過在同一反應體系中加入多對特異性引物,可實現對沙門菌的高通量檢測與快速分型,進一步節省時間和成本[11,19]。環介導等溫擴增技術在恒定溫度條件下實現核酸高效擴增,相對于PCR技術,操作簡單,對設備要求低,耗時更短[20]。

2 沙門菌分子檢測方法的研究進展

2.1 沙門菌屬分子檢測方法

目前報道了很多沙門菌屬的特異性分子檢測方法(表1),此類方法的檢測靶點主要涉及沙門菌屬特有的毒力基因或看家基因,下面詳細介紹。

bcfD:沙門菌屬的一種保守菌毛基因,存在于已知所有血清型中,包括腸道沙門菌種和邦戈爾沙門菌種[60-61]。2014年,Zhuang等[24]針對bcfD設計引物建立了沙門菌屬LAMP檢測方法,對44株沙門菌的檢測結果均為陽性,而非沙門菌則全為陰性。

fim操縱子基因:fim基因簇編碼沙門菌I型菌毛,包含fimA等9個基因[62],目前,已有fimA、fimW和fimY報道作為沙門菌屬檢測靶點。fimA編碼菌毛主要亞單位蛋白,但沙門菌、大腸桿菌和克雷伯氏菌fimA基因具有同源性,1996年,Cohen等[26]對fimA基因序列進行研究,選取其中高特異性片段設計引物并建立PCR方法,能夠準確區分376株沙門菌和34株非沙門菌,從而確定了fimA作為沙門菌屬特異性靶點的應用功能。fimW和fimY都是調控基因,2014年,Zhang等[27]建立的fimW-PCR能夠將受試的68株沙門菌與12株非沙門菌進行區分;2002年,Yeh等[28]建立了fimY-PCR檢測方法,結果表明僅45株沙門菌可以擴增出特異性條帶,而20株非沙門菌不能擴增。

gyrB:是一種編碼細菌DNA回轉酶β亞基的看家基因,比16S rDNA具有更強的物種區分能力[63]。2011年,Ye等[30]通過分析gyrB基因序列,得到沙門菌特異性片段,經PCR檢測所有被檢沙門菌均可擴增得到366 bp的特異性產物。

hilA:編碼侵襲基因正調節蛋白,位于沙門菌致病性島1(SPI1),在沙門菌感染的過程中起著重要作用,在其它革蘭陰性菌中不存在[33]。2000年,Guo等[32]基于hilA設計了兩對PCR引物,其中HILA2可用于沙門菌特異性檢測。

hns:編碼DNA結合蛋白,與腸桿菌科其它屬細菌的基因序列差異較大,僅與大腸桿菌具有一定的同源性。1993年,Maciorowski等[37]在對沙門菌hns基因進行分析的基礎上,成功建立了特異性PCR檢測方法,對所有受試沙門菌的檢測均為陽性。此外還有其它多個研究也使用該基因做為檢測靶點[64-65]。

invA:編碼吸附和侵襲上皮細胞表面蛋白,1992年,Rahn等[10]首次以invA基因為靶點建立了沙門菌PCR檢測方法,通過對630株沙門菌和142株非沙門菌進行檢測發現99.4%的沙門菌能夠檢測出特異性條帶,而非沙門菌則無法擴增出相應的條帶或僅能擴增出非特異性條帶,證明了invA廣泛存在各個血清型的沙門菌中,可作為沙門菌屬的候選檢測靶點。此后該基因一直被廣泛應用于各種沙門菌分子檢測方法[38-39]。2018年,Yang等[29]對沙門菌LAMP檢測方法的統計表明,invA基因占比高達74%。

ompC:編碼外膜蛋白,是沙門菌及其它革蘭陰性菌主要的結構蛋白。1996年,Kwang等[43]根據ompC序列設計引物建立PCR檢測方法,能夠成功區分60株沙門菌和42株非沙門菌。

oriC:是DNA的復制起點,基于該基因建立的PCR檢測方法,可以將沙門菌與大腸桿菌等其它微生物進行選擇性區分,已廣泛用于沙門菌屬檢測[47,66]。Fluit等[46]利用沙門菌B群特異性單克隆抗體和基于oriC的特異性PCR引物,建立磁性免疫聚合酶鏈反應(MIPA),在大腸桿菌和鼠傷寒沙門菌濃度分別107和101CFU的情況下,仍可檢測出樣品中鼠傷寒沙門菌。

phoP:是磷酸化調節子的一部分,調節沙門菌的毒力和巨噬細胞存活相關基因的表達[49]。Li等[50]對115株腸桿菌科的phoP序列進行分析,發現沙門菌屬phoP基因序列具有特異性,進而建立了phoP-LAMP檢測方法,可準確區分66株沙門菌和73株非沙門菌。

rRNA靶點:包括16S rRNA 和16～23S rRNA靶點等。由于不同種的真細菌與古細菌間的16S rRNA基因的高度保守性,因而16S rRNA常被用于細菌的分類或種屬鑒定[67]。Lin和TSen[22,68]通過分析沙門菌16S rRNA基因保守序列,設計多條探針,其中以16S Ⅲ和16SF1為引物對,建立了能特異性檢測沙門菌的PCR方法。16S rRNA與23S rRNA的內部轉錄間隔區(internal transcribed spacer,ITS)也是一種rRNA,且不同細菌ITS長度和組成不同,因而也可以作為種屬鑒定的靶序列。2005年,Chiu等[21]通過比較沙門菌和非沙門菌ITS序列,成功設計引物建立PCR方法,并對40株沙門菌和48株非沙門菌進行準確區分。

ttrRSBCA:該基因簇包含5個基因,位于沙門菌毒力島2(SPI2)附近,ttrA、ttrB和ttrC編碼四硫代還原酶結構蛋白,ttrS和ttrR編碼雙組分調節系統的傳感器和響應調節器組件。分子雜交結果表明,該操縱子存在于所有腸道沙門菌種和邦戈爾沙門菌種的菌株。2004年,Malorny等[56]首次以ttrRSBCA為靶點建立實時PCR方法,成功區分了110株沙門菌和87株非沙門菌。

此外,還有一些沙門菌屬分子檢測方法,涉及的靶點如組氨酸轉運操縱子基因hisJ[36]、inv基因簇侵襲相關基因invE[40]、插入元件IS200[42]、質粒毒力相關基因spv[54]和腸毒素基因stn[55]等。

2.2 沙門菌種分子檢測方法

沙門菌屬包括腸道沙門菌種和邦戈爾沙門菌種[6],目前只有關于腸道沙門菌種分子檢測方法的報道。iroB是鐵調節蛋白基因,1997年B?umler等[69]通過Southern雜交發現,iroB存在于腸道沙門菌種的所有亞種中,但在邦戈爾沙門菌種和其它腸桿菌科細菌中均不存在。針對iroB建立的一種腸道沙門菌PCR檢測方法,應用于197株細菌的檢測,僅腸道沙門菌出現陽性條帶。

2.3 沙門菌血清群分子檢測方法

沙門菌根據O抗原的差異可分為46個血清群[1],其中以A、B、C、D和E群最為常見,而目前報道的分子檢測方法也主要用于鑒定以上常見血清群。沙門菌血清群檢測靶點主要針對參與合成O抗原的編碼基因,這些基因通常聚集在rfb基因簇上。

rfb基因簇:包括rfb、wzx和wzy等。rfb編碼糖基合成酶和轉移酶,用于合成和組裝O抗原。1993年Luk等[70]根據rfbJ(B)、rfbJ(C2)和rfbS(D)設計3對PCR引物,在總共123個測試的臨床分離物中準確鑒定了屬于血清群B、C2和D(A)群的所有40株沙門菌。但該方法不能鑒定血清群C1,且由于血清群A和D的靶基因僅有一個核苷酸堿基不同,同源性極高,難以區分。wzx(rfbX)編碼一種具有12個跨膜片段的膜蛋白,負責將O抗原單位從細胞質轉移至細胞周質中[71-72]。2007年Herrera-Len等[73]利用wzx-mPCR成功區分了沙門菌血清群B、C1、C2、D和E的分離株。wzy編碼O抗原聚合酶,負責將細胞周質中的O抗原單位聚合在周質表面。2007年Fitzgerald等[7]將沙門菌的rfb基因簇中的abe、wzx、wzy等基因作為檢測靶點,可以區分血清群A(D)、B、C1、C2、E和O13的菌株。

IS200/IS1351:IS200和IS1351屬于沙門菌插入基因,研究表明沙門菌D(O9)群菌株與其它血清群相比,其序列中包含一段IS200/IS1351聯合序列,因此可將該聯合序列作為D(O9)群的檢測靶點。2008年Okamura等[74]以IS200/IS1351聯合序列為靶點,成功建立了特異性檢測D(O9)群的LMAP方法。

2.4 沙門菌血清型分子檢測方法

以腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌等為代表的沙門菌血清型是目前流行最廣泛的病原,能夠感染人和各類動物,引起各種沙門菌病,造成嚴重的經濟損失,具有重要的公共衛生學意義。這里將主要介紹此類流行性較廣泛的血清型[75-100](表2)。

表2 沙門菌血清型分子檢測方法

2.4.1 腸炎沙門菌 腸炎沙門菌的相關研究較多,主要靶點如下。

prot6E:屬于沙門菌菌毛蛋白編碼基因。2006年Clavijo等[101]研究腸炎沙門菌在蛋清中存活相關基因時發現兩個腸炎沙門菌特異性基因:prot6E和SEN4287。Cornelia和Reiner[77]以prot6E為靶點建立的實時PCR,能夠準確鑒定95%(75/79)的腸炎沙門菌,而其它54個血清型(119株)非腸炎沙門菌均沒有檢出。

sdfI與lygD:sdfI編碼沙門菌差異性基因片段I,常作為靶點用于腸炎沙門菌分子檢測方法的建立[78],但該基因與都柏林沙門菌同源性較高,需要進一步截取高特異性片段作為檢測靶點。lygD是sdfI基因片段中一段高特異性序列,僅存在于腸炎沙門菌,所有非腸炎沙門菌血清型均不含有該基因,Xiong等[76]利用上述基因成功建立了區分不同D群血清型的多重PCR方法。

sefA:編碼SEF14菌毛主要亞單位結構蛋白基因。1996年,Woodward等[79]首次以該基因為靶點建立PCR法用于腸炎沙門菌的檢測。但該基因也存在于雞傷寒等少數D群血清型中,Gong等[102]建立了以該基因為靶點的LAMP法用于檢測腸炎沙門菌和雞傷寒沙門菌,進一步的區分可通過菌落形態特征。

2.4.2 鼠傷寒沙門菌 主要靶點包括蘋果酸脫氫酶編碼基因mdh和多種未知功能基因。

mdh:蘋果酸脫氫酶編碼基因,是三羧酸循環的一種酶,普遍存在于各種生物體中。1999年Lin和Tsen[84]將鼠傷寒沙門菌和其它細菌的mdh基因序列進行比較,成功建立了能特異性擴增鼠傷寒沙門菌的PCR方法。對所有鼠傷寒沙門菌均可擴增出261 bp的產物,而其它血清型和非沙門菌菌株均未出現假陽性結果。

除上述基因外,目前還報道多種未知功能基因,包括STM0159、STM4200、STM4492、STM4495、STM4497等[81-82,85-87],其中STM4497使用頻率最高。2006年Kim等[87]通過比較基因組學方法獲得10個鼠傷寒沙門菌特異性基因,分別設計引物,進行PCR驗證,最終確定STM4497特異性最高,此后該基因被多次用于鼠傷寒沙門菌的檢測靶點[4,103]。

2.4.3 雞白痢/雞傷寒沙門菌 雞白痢和雞傷寒沙門菌屬于無運動性沙門菌。由于雞白痢、雞傷寒沙門菌的cigR和flhB序列比其它血清型沙門菌短,利用該特點,以cigR或flhB為檢測靶點,可進行無運動性沙門菌的檢測[76,93-94]。此外由于雞白痢、雞傷寒沙門菌都不具有運動性,且在抗原型、病原學、流行病學和臨床癥狀等多方面具有相似性,難以通過常規的診斷或血清學方法進行區分[104],因此分子檢測方法至關重要。目前已報道了多種分子鑒別方法,涉及fimH、fliC、glgC、ratA、rfbS和speC等檢測靶點,其中基于glgC與speC可變區的二重PCR和基于ratA可變區的PCR均具有良好的特異性[104]。

2.4.4 基于fliC基因靶點的血清型檢測fliC編碼沙門菌鞭毛抗原。沙門菌屬具有兩相鞭毛抗原,第1相稱為特異相,采用小寫字母a、b、c……z1、z2、z3、……z88表示,為部分血清型特有;第2相稱為非特異相,采用阿拉伯數字1、2……7表示,為許多沙門菌共有[105]。沙門菌鞭毛基因高變區通常具有獨特的核苷酸序列,在沙門菌各血清型中呈多樣性,目前已成功應用于甲型副傷寒沙門菌、鼠傷寒沙門菌、傷寒沙門菌和豬霍亂沙門菌等的檢測[75,88,98,100]。

Zhou等[98]基于甲型副傷寒鞭毛基因fliC-a建立的PCR檢測方法檢測結果與血清檢測結果一致,但使用的樣品量僅有常規方法的一半。Pai?o等[75]根據鼠傷寒沙門菌鞭毛基因fliC-c高變區(794—1 226)設計引物,建立多重PCR方法,對所有鼠傷寒沙門菌均檢測出目的片段,而其它血清型及非沙門菌則沒有擴增條帶,表明鼠傷寒沙門菌fliC-c高變區可作為其檢測靶點。傷寒沙門菌鞭毛抗原fliC-d,基因全長1 530 bp,其中d抗原Ⅵ區(969—1 077)具有高度特異性。Song等[88]以fliC-d為傷寒沙門菌檢測靶點,建立的PCR檢測方法成功區分了傷寒病例樣本和健康者樣本。Chiu等[100]比較了豬霍亂沙門菌與其它血清型及非沙門菌屬腸桿菌科細菌的fliC基因序列,成功建立PCR檢測方法。該方法結合viaB靶點能將豬霍亂沙門菌與其它細菌進行區分。

2.4.5 其它血清型 除上述常見血清型外,其它部分血清型也成功篩選到特異性靶點并建立了分子檢測方法,如印第安納沙門菌(A7P63_09100、A7P63_13850和MG752992)[95-97]、海德爾堡沙門菌(ACF69659)[80]、傷寒沙門菌(tyv、STBHUCCB_38510、STY1599、STY2879和STY4669)[81,89-92]、乙型副傷寒沙門菌(SPAB_01124)和嬰兒沙門菌(M.sinI)等[81,99]。但這些基因的功能往往沒有得到鑒定,其應用也不夠廣泛,還需進一步研究與驗證。

3 討 論

根據沙門菌的分類特點,可將分子檢測方法分為四類,即沙門菌屬、腸道沙門菌種、沙門菌血清群和沙門菌血清型。其中沙門菌屬和沙門菌重要血清型的分子檢測方法報道最多,其應用也最廣泛。

沙門菌屬分子檢測方法的靶點主要涉及抗原決定簇、外膜蛋白、DNA結合蛋白和毒力相關基因等。這些基因中有些在個別沙門菌血清型中缺失,會引起假陰性的結果,需要特別注意,如invA[106];也有些基因普遍存在于腸桿菌科細菌中,易發生交叉反應,出現假陽性結果,如fimA和ompC[106-107]。為找到最合適的檢測靶點,多個報道曾對這些基因的特異性進行了比較與評價。如Endley等[108]比較了fimA和hns引物的特異性,結果顯示hns引物可對梭菌非特異性擴增,而fimA引物特異性更強。Malorny等[106]評估了ompC、oriC和invA等,結果表明invA在沙門菌PCR檢測方面更加有效。Shabarinath等[64]比較了hns、invA和invE,其中hns的檢測效率優于invA和invE。不同報道選擇的基因不同,使用的血清型和菌株不同,得到的最優靶點也不同,但沒有報道所選擇的全部基因均是最優靶點,因此選擇沙門菌屬特異性檢測靶點建立分子檢測方法時,可以多選幾種進行分析驗證。

沙門菌血清型分子檢測方法針對的靶點主要是基于比較基因組學方法分析所獲得,其中很多為功能未注釋的基因。本文整理了11個血清型共計36個檢測靶點,其中超過一半的基因功能未注釋。由于目前分析時所用的基因組數據量較大,往往具有較好的特異性。其中有些是經典的靶點,如鼠傷寒沙門菌的STM4497[87]。fliC是沙門菌另一比較重要的血清型檢測靶點,其編碼的鞭毛抗原是劃分沙門菌血清型的重要依據,根據高變區序列設計引物,可進行不同血清型的鑒定[75,88,98,100],但fliC單獨使用時不能區分某些具有相同O抗原的血清型(如豬霍亂沙門菌與丙型副傷寒沙門菌),此時需要結合其它靶點才能有效區分[100]。多個靶點結合使用的情況還出現在屬和型的檢測,如Khaltabadi等[109]進行鼠傷寒沙門菌鑒定時結合使用了屬特異性靶點invA和型特異性靶點mdh。因此,為進一步提高沙門菌分型的特異性與敏感性,建議可同時選擇兩種以上的檢測靶點來建立分子檢測方法。

目前關于腸道沙門菌種和血清群的分子檢測方法報道數量有限。由于邦戈爾沙門菌常見于冷血無脊椎動物,很少引起溫血動物沙門菌病例[110],因此相關研究較少,目前僅報道了針對iroB靶點的腸道沙門菌種特異性分子檢測方法[69]。而沙門菌血清群的分子檢測方法主要針對幾種參與合成O抗原的編碼基因(如rfb、wzx和wzy等)[7,70-71]。

自2003年人類基因組計劃完成之后,基因測序技術發展迅猛,尤其當2005年第一臺高通量測序儀454推出后,全基因組測序技術飛躍發展,細菌全基因組測序也在不斷完成[111]。采用比較基因組學方法發掘新檢測靶點的研究應運而生,并發現了越來越多的沙門菌新檢測靶點[96,112]。相信隨著分子生物學研究的持續深入,更多、更可靠的沙門菌分子檢測方法將會應用于臨床檢測中。