納米抗體及其在獸醫領域的研究現狀

胡湘云,曹艷紅,呂玲燕,劉 征,黃發才,吳柱月,肖正中

(廣西農業職業技術大學 廣西家畜遺傳改良重點實驗室,南寧 530007)

20世紀90年代,科學家先后在駱駝和鯊魚體內發現了一種獨特的抗體,它們天然缺失輕鏈和重鏈第一恒定區(constant region 1,CH1),故將其命名為重鏈抗體(heavy chain antibodies,HCAbs)[1-2]。后續研究發現,重鏈抗體的重鏈可變區(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody,VHH)是HCAbs結合抗原的主要功能域,克隆此結構域后所形成的VHH是具有完整抗體功能特性的最小抗體,其大小可達到納米級,所以也稱之為納米抗體(nanobodies,Nb)。特殊的結構賦予其優越的抗原結合力、穩定性、組織穿透力等性能,隨著Nb在獸醫領域研究的逐步深入,也逐漸展現出優秀的應用前景。本文重點對Nb的結構、特性、篩選與表達策略以及在獸醫領域的研究現狀進行綜述,分析其在動物疫病防控、動物產品檢驗等方面的應用前景和發展方向,以期對深化和推廣Nb在獸醫領域的應用提供參考。

1 納米抗體的結構

Nb晶體為橢圓形,由3個互補決定區(complementarity-determining region,CDR)和位于其兩側的4個骨架區(framework region,FR)構成,大小為2.5 nm×4 nm,分子量為12～15 ku。傳統抗體、HCAbs和Nb的結構示意見圖1,傳統抗體重鏈可變區(variable region of the heavy chain of conventional antibodies,VH)和VHH的結構示意見圖2。

圖1 各類抗體結構示意圖

圖2 VH、VHH結構示意圖

1.1 CDR結構域

VHH的CDR1和CDR3普遍比VH更長,VHH CDR3平均長度有16～18個氨基酸,而VH僅為9～13個氨基酸,VHH長CDR3區形成一個大的指狀凸環結構嵌入抗原分子的裂隙,增加與抗原接觸面積,使VHH具有更強的抗原結合能力[3]。此外,其 CDR1、CDR3區存在一個半胱胺酸殘基形成的額外二硫鍵,呈現凸環結構以固定CDR3區,該結構也可以結合抗原結構中的裂隙,增加VHH識別表位的多樣性[4]。

1.2 FR2結構域

VH FR2區高度保守的疏水氨基酸Val37、Gly44、Leu45和Trp47參與和輕鏈的相互作用,而VHH為適應缺失輕鏈,使用更親水的氨基酸Phe或Tyr37、Glu44、Arg45和Gly47替代,且部分FR2被CDR3形成的凸環所覆蓋,這顯著增加了VHH的親水性和穩定性[5]。

2 納米抗體的理化特性

納米抗體特殊的結構賦予了其優于傳統抗體的諸多優良理化特性,突破了傳統抗體免疫原性高、生產成本較高、組織穿透力弱、穩定性低等瓶頸。

2.1 低免疫原性

免疫原性與分子量呈正相關,分子量越大,免疫原性越高,Nb分子量僅為傳統抗體的10%,使其引起體液或細胞免疫應答的幾率大大降低。此外,Nb缺少可結晶段(fragment crystallizable,Fc)避免了補體反應,而且在駱駝科動物中編碼Nb的基因與人類VH家族3系和4系基因序列同源性高達80%,因此Nb對人的免疫原性低,且具有較好的生物相容性,在人類和其他動物試驗中,Nb的重復給藥均未引起機體體液和細胞免疫應答,目前尚無Nb免疫原性造成不良反應的報道[6-8]。

2.2 易于制備與表達

傳統抗體表達時容易形成包涵體,Nb因其 FR2區氨基酸性質的改變具有更強的親水性和溶解性,可以在多種表達系統進行高效表達且產物多為可溶性,也易于利用外源親和標簽進行純化[9]。這降低了研發和生產成本,解決了傳統抗體難以低成本規模化制備的難題。

2.3 高抗原結合性

雖然Nb遠小于傳統抗體,但卻擁有與其相當的抗原結合活性,這得益于Nb長CDR3區形成凸環結構能識別傳統抗體無法到達的靶抗原內部、深處狹小裂隙處,可以結合半抗原、酶活性位點,具有廣泛抗原結合能力,并有助于發現傳統抗體無法識別的藥物新靶點[10-11]。

2.4 組織穿透性強

Nb憑借體積小、分子量小的優勢,擁有更強的組織穿透能力,能到達傳統抗體不可及的病灶組織,如實體瘤;還能穿透血腦屏障為腦部給藥,為大腦疾病研究提供新途徑;同時易被腎組織快速濾過,避免腎毒性;在血液中清除速度快且半衰期短,當Nb進入組織時,多余未結合的Nb能快速被清除,可結合成像技術用于體內疾病的無創傷診斷[12]。

2.5 高穩定性

Nb內部的二硫鍵使其具有耐熱性和蛋白水解抗性。溫度高于65 ℃會令常規抗體喪失變性后的可逆性(復性作用),失去抗體原有功能;而Nb具備高溫耐受性,在90 ℃高溫下擁有可逆的去折疊能力,在37 ℃孵育1周后有80%結合抗原能力[13]。利用Nb在室溫下長期儲存仍能保有活性的特點,有望解決傳統抗體需冷鏈運輸和儲存的難題。而Nb在非生理條件pH、蛋白酶、離液劑環境仍能保持穩定構象[14]。這表明Nb可以實現口服或霧化方式給藥,在治療動物胃腸道和呼吸道疫病上具有良好應用前景。

2.6 易于基因工程改造

Nb為單域結構,基因序列簡單,可作為一種理想的構建單元,根據不同的需求構建多價、多特異性或融合性Nb(與牛血清白蛋白、IgG-Fc、放射性同位素等結合),并增強其對目標的特異性和功能性。

3 納米抗體的篩選與表達

根據不同試驗目的選擇相應文庫技術進行建庫和Nb靶向篩選,再選擇適宜的表達系統表達,使得Nb的制備正逐漸成為一個技術成熟、高效、成本可控的標準化過程。

3.1 納米抗體文庫的類型

根據獲得的Nb基因來源分為免疫、天然和合成Nb文庫,其在建庫方法、庫容量和特點上存在差異,Nb文庫的類型和特點如表1所示。

表1 納米抗體文庫的類型和特點

3.2 納米抗體的篩選策略

主要利用噬菌體展示、酵母展示、酵母雙雜交、核糖體展示和高通量測序等技術篩選Nb,其中噬菌體展示技術是應用最廣泛的體外Nb篩選技術。噬菌體展示技術通過將抗體基因序列插入噬菌體外殼蛋白結構基因中,使抗體與噬菌體外殼蛋白形成融合蛋白,并隨著子代噬菌體的重新組裝展示在噬菌體表面,實現表型與基因型的統一[17]。

3.3 納米抗體的表達策略

與傳統單克隆抗體需要進行繁瑣的細胞培養相比,Nb的優勢在于可以在原核宿主(大腸桿菌系統)、真核宿主(酵母、真菌、昆蟲細胞、哺乳動物細胞)及植物宿主(植物細胞)中表達。大腸桿菌表達系統是最常用的表達平臺,其操作簡便、生產成本低,但存在部分表達產物會形成包涵體、缺乏翻譯后修飾、胞內形式不利于二硫鍵形成等缺點;酵母表達系統可以產生高水平的Nb,其胞外氧化環境有利于對抗體進行翻譯后折疊、修飾和分泌,促進二硫鍵的形成,但可能存在過度糖基化的問題;植物表達系統具有低成本和安全性,并且能夠進行翻譯后修飾,常使用本氏煙草葉和擬南芥種子進行高效表達[18]。

4 納米抗體在動物疫病防控的應用

多克隆抗體和單克隆抗體已經在動物疫病防控上得到廣泛應用,但這兩種抗體均各有局限性。如上所述,Nb具有多種優于傳統抗體的優良特性,使其成為傳統抗體的有力補充,有望成為新的防控動物疫病的有效手段。

4.1 用于動物疫病的預防

防控動物疫病的關鍵在于控制傳染源、切斷傳播途徑和保護易感動物,Nb在被動免疫、構建疫苗載體、監測疫苗質量上極具發展潛力。

4.1.1 被動免疫 被動免疫是提前給易感動物注射抗體以起到免疫保護作用,Nb與IgG或IgA的Fc融合能預防動物疫病[19]。例如將產腸毒素大腸桿菌(EnterotoxigenicEscherichiacoli,ETEC)的Nb與球蛋白IgA的Fc融合,并在擬南芥和畢赤酵母中大規模生產,制備成口服飼料對仔豬被動免疫,可以有效抑制菌毛黏附,防止仔豬感染ETEC[20-21]。再如將針對鞭毛和外膜蛋白的抗彎曲桿菌Nb融合到雞IgA和IgY的恒定結構域,在本氏煙草葉子和擬南芥種子中表達,可以抑制彎曲桿菌的定植,未來可以將Nb制備成飼料添加劑預防彎曲桿菌[22]。

4.1.2 構建疫苗載體 針對黏膜表面受體的疫苗可以有效誘導腸道病原體黏膜免疫反應,但口服遞送的亞單位疫苗在腸上皮細胞存在吸收不良、運輸效率低下和免疫反應較弱的問題,成為黏膜疫苗接種的重要瓶頸。制備靶向豬氨肽酶N (porcine aminopeptidase N,pAPN)的Nb與鼠IgG2a的Fc融合形成二價融合蛋白,給豬只口服后在豬腸道上皮細胞中顯示體內內化,能夠引發全身和黏膜抗體反應[23]。證明了Nb作為腸道病原體疫苗抗原遞送載體的巨大潛力。

4.1.3 監測疫苗質量 Nb具有高抗原結合能力,能精準識別蛋白質表面裂隙、蛋白質結構域和亞基,可以用于監測蛋白質構象。蛋白質納米粒子構象狀態分析是疫苗質量控制的關鍵步驟,布魯菌LS蛋白(Brucellalumazine synthase,BLS)是通用疫苗載體,將僅識別BLS天然構象的Nb作為分子探針,可以在基于BLS平臺的疫苗制備過程中監測疫苗質量[24]。再如,FMD疫苗的功效主要取決于完整病毒粒子(146 S)的含量,在疫苗制造、配制和儲存過程中,146 S可能分解成12 S亞基,降低了疫苗效力,通過篩選能廣泛識別146 S的Nb,制備雙抗體夾心ELISA(double antibody sandwich ELISA,DAS-ELISA)進行抗原定量,可以監測疫苗完整衣殼的數量和穩定性,從而評估疫苗質量[25]。

4.2 用于動物疫病的診斷

早期、快速、正確的診斷對于動物疫病防控至關重要,臨床上各種動物病原體混合感染或繼發感染的情況已成常態,目前動物重要疫病的診斷技術已經比較豐富,然而還存在操作復雜、便利性差等缺點。

4.2.1 ELISA檢測 在生產診斷中,目前使用常規抗體制備的ELISA檢測試劑需要冷鏈運輸和儲存,不利于臨床診斷,而Nb的高穩定性則有望改變這一局面,基于辣根過氧化物酶、生物素等標記Nb建立的酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA),在豬、禽、牛等動物病毒病的診斷上已取得較大進展(表2)。

表2 基于納米抗體的ELISA檢測方法

4.2.2 體內定位和成像 Nb對分子靶標的穩定性、親和力和特異性高,靶向性和穿透性強,在腎組織能被快速清除,具有構建不同形式(放射性核素、磁性離子、量子點標記)抗體的靈活性,可以作為良好的靶向示蹤分子應用于體內定位和成像。通過從免疫Nb文庫中獲得靶向O型口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,FMDV)的病毒顆粒或豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、豬瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)結構蛋白的Nb,與量子點結合構成納米探針,可以在細胞內進行病毒示蹤和病毒成像;Nb也可以與超順磁性納米珠共軛,構建用于分離病毒的免疫磁性納米珠,可以從臨床樣品中分離病毒或在體外捕獲病毒粒子[40-42]。

4.3 用于動物疫病的治療

抗體在對抗病毒、細菌等感染方面都能發揮重要的天然防御作用,其應用于動物疫病的治療已有數十年的歷史,但傳統抗體因尺寸大不易穿透組織影響治療效果、生產步驟繁瑣且成本高限制其發展。作為傳統抗體的有利替代品,Nb擁有的小尺寸、強抗原結合能力、組織穿透性強等優勢為研發高效治療方法提供新選擇。

4.3.1 抗病毒治療 Nb是中和抗病毒試劑的主要來源,其通過抑制靶標與受體間相互作用治療動物病毒病。筆者分別以新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)HN蛋白和F潛在中和表位為靶標,篩選具有良好反應活性和中和活性的Nb,其中靶向HN的Nb能識別NDV感染的細胞[43-44]。Zhang等[45]在畢赤酵母體內將靶向豬呼吸與繁殖障礙綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV) nsp9的Nb與豬IgG Fc融合表達,之后發現該嵌合抗體通過內吞作用進入宿主細胞體內并發揮抗病毒作用。而將PRRSV nsp9的Nb與細胞穿膜肽(cell penetrating peptide,CPP)融合表達也能進入宿主細胞,可以減弱PRRSV感染后引起的癥狀,發揮抗病毒功能[46]。以上,Nb有望成為治療動物病毒病的新型工具。

4.3.2 抗菌素治療 臨床上使用口服或靜脈注射抗生素治療細菌病,但抗生素濫用和耐藥菌的出現給細菌類疾病的治療帶來難題。Nb的特異性和靶向性能夠靶向細菌表面蛋白,通過拮抗細菌黏附宿主細胞等方式治療細菌感染。炭疽芽胞桿菌(Bacillusanthracis)能引起急性人畜共患細菌病,篩選靶向其S-層蛋白Sap的Nb經表達純化后通過皮下注射給炭疽病小鼠模型,結果顯示炭疽芽胞桿菌的增殖被抑制,小鼠模型中的病原菌被清除[47]。這證實了Nb的抗菌治療能力。

5 納米抗體在動物產品檢驗中的應用

5.1 檢驗食源性病原體

動物源性食品中常存在各類細菌和真菌毒素,這導致食源性疾病嚴重影響人類健康,而保障食品安全最重要的措施是建立快速有效的檢測方法。近年來,Nb應用于動物產品檢驗的研究多有報道,研究人員針對動物產品(牛奶、肉等)中的食源性致病菌,篩選其特異性高、反應性好的Nb作為識別元件,并基于抗原抗體特異性反應開發出各類檢驗方法,表3列出了用于檢驗動物產品中食源性病原體的Nb,這為準確高效檢測食源性病原體提供了新思路,有助于提高動物產品的質量安全水平。

5.2 檢驗獸藥殘留

在規模化和集約化養殖條件下,為追求養殖利益,生產中常用抗生素和殺菌劑來防控動物疫病,用激素和促生長劑來提高動物生長性能和飼料利用效率,這可能會導致動物源性食品中存在藥物殘留,對人類健康造成潛在危害。發展快速、準確的獸藥殘留檢驗技術是防范其危害的最后一道防線,而Nb的出現帶來了新技術力量。

孔雀石綠是一種殺菌劑,曾被廣泛應用于水產養殖業,但其進入人體后代謝產物具有高殘留和致畸、致癌、致突變等毒性,已被我國列入《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》,但實際生產上仍存在濫用的現象。目前檢驗孔雀石綠的方法為液相色譜-質譜聯用方法,但其檢測成本高,操作復雜且耗時長。通過從免疫的孔雀石綠文庫中篩選Nb,以此制備膠體金免疫層析檢測試紙條,其檢測時間僅需15 min,檢測限為0.5 ng·mL-1,判定速度快,靈敏度高[55]。

萊克多巴胺(ractopamine,RAC)是一種苯酚胺類的β-腎上腺素興奮劑,鹽酸克倫特羅(clenbuterol hydrochloride,CL)是一種β2型腎上腺素受體激動劑,兩者均會對人體產生毒副作用,眾多國家都已禁止將兩者用于畜禽養殖。已經成功從天然Nb庫中靶向篩選出對RAC、CL反應性良好的Nb,這為后續研發基于Nb技術的藥殘檢測方法奠定基礎[56-57]。

6 研究展望

綜上所述,Nb因其特殊結構展現出了低免疫原性、易于制備與表達、高抗原結合性、組織穿透性強、高穩定性和易于改造等諸多優良理化特性,同時其制備技術成熟、成本可控,有潛力成為替代傳統抗體應用于動物疫病預防、診斷、治療以及動物產品食源性病原體和藥物殘留檢驗等領域的優秀迭代產品。隨著研究的深入,Nb此前的一些局限性也正在逐步得到修正和彌補,例如通過CRISPR-Cas9技術將駱駝基因轉入小鼠,可以獲得能產生Nb的小鼠,解決了駱駝類和鯊魚類等試驗動物不易獲得、免疫操作困難等問題,為Nb的建庫提供了新選擇[58];又如通過構建多聚化Nb或與Fc融合、聚乙二醇化等方法,可以解決Nb體積和分子質量小導致半衰期短,影響治療時效的問題,從而提高其在體內的治療效果,但這一做法會增加Nb尺寸,可能會減弱Nb活性,未來要繼續探索最佳構建方案,增加融合Nb在體內作用時間和作用效果。

筆者認為,Nb在獸醫領域的應用場景廣泛、前景明朗,下一步,一是可以加強Nb與其他新興技術(生物傳感器、微流控芯片、高通量測序、單顆粒冷凍電鏡技術等)的協同研究和應用,最大限度發揮Nb的優良特性,并不斷優化和彌補其局限性;二是要建立和推廣商用Nb篩選和制備技術,推動Nb應用商品化。廣西屬于養豬大省,近年來,豬腸道冠狀病毒病的發生制約著本地養豬產業的發展,筆者團隊致力于研發能實現豬口服給藥的納米抗體,為新時代獸醫發展提質增效帶來新動能。