蓖麻毒素A 鏈（RTA）和RTA-4D5 scFv 的穿膜改造探究

許嘉文

（華東理工大學魯華生物技術研究所，上海 200237）

1 文獻綜述

許多植物都可以產生被稱為核糖體蛋白失活蛋白（RIPs）的蛋白毒素，RIPs 的主要功能是作為保護免受微生物入侵的工具[1]。蓖麻毒素是二型核糖體蛋白失活蛋白的一種，由二硫鍵連接的A 鏈和B 鏈組成。蓖麻毒素被細胞內吞后，絕大多數內化的蓖麻毒素被轉運回細胞表面，剩余部分被運送到溶酶體并被降解，最終只有很小一部分被運輸到高爾基體網絡[2]。而蓖麻毒素A鏈需要穿過細胞膜，通過逆向轉運途徑進入胞漿中才能發揮毒性用，導致細胞凋亡。因此蛋白毒素在胞內的定位是展現其細胞毒性的關鍵[3]。研究人員在蛋白質末端添加短肽改善其穿膜或定位能力，這種短肽被稱為信號肽。

KDEL 是一種最常見的內質網定位肽，由四個氨基酸殘基組成，通常存在于哺乳動物和植物細胞中，一般只有在蛋白質的C 端才能發揮蛋白質的內質網定位作用。而DEKKMP 是 E3/19K 蛋白的C 端末尾的6 位殘基，同樣也是一種內質網保留信號。如今更多的新型穿膜肽正在被發現，其中一種很有潛力的穿模肽來自乙型肝炎病毒（HBV）編碼的X 蛋白。Xentry 由X 蛋白中的7 個氨基酸殘基組成，序列為LCLRPVG，該短肽能夠滲透多種癌細胞系，包括HepG2、H441、BT474[4]。由于許多不同的細胞類型表達多配體蛋白聚糖，特別是高水平表達多配體蛋白聚糖的上皮細胞，Xentry 可用于將藥物遞送至疾病治療中的組織。[5]

蓖麻毒素作為抗腫瘤藥物，已被研究人員廣泛而深入地研究，其抗腫瘤作用已在許多實驗模型中得到證實，如人腫瘤細胞移植到裸鼠體內的實驗[6]，但是蓖麻毒素自身對腫瘤細胞并沒有特異性，使用蓖麻毒素同樣會殺傷正常細胞。為了解決蓖麻毒素對腫瘤細胞的特異性問題，近年來蓖麻毒素和其A 鏈被用于合成靶向性腫瘤治療的免疫毒素，并顯示出良好的特異性抗癌活性[7]。

本實驗利用內質網定位信號肽，使單鏈A 鏈蓖麻毒素在沒有B 鏈的輔助下依舊能夠高效逆向運輸，細胞內化蓖麻毒素后將蓖麻毒素快速引導至內質網，從而增強細胞毒性。同時利用4D5 scFv 對特定腫瘤細胞的高特異性，減輕其對正常細胞的殺傷力。由于蓖麻毒素和4D5 連接后蛋白分子量較大，在細胞內化過程中不易被細胞攝入，所以在蛋白中插入一段穿膜肽以輔助蛋白毒素的內化。通過以上改造，希望構建的蛋白毒素能用于臨床腫瘤治療。

2 實驗方法（過程）

2.1 引物設計

使用Snapgene 軟件，依據PCR 和重疊PCR 的原理設計引物。

2.2 質粒構建

2.2.1 PCR 反應

質粒pET-28a-SUMO-RTA-KDEL（質粒1）、pET-28a-SUMO-RTA-4D5-KDEL（質粒2）由實驗室保存，用來作為本實驗的PCR 模板；使用設計好的引物S1primer，primer2 和質粒1 進行PCR，獲得SUMO-RTA-KDEL3（RK3）片段；使用設計好的引物S1primer，primer3 和質粒2進行PCR，獲得SUMO-RTA-4D5-KDEL3（R4K3）片段；使用設計好的引物S1primer，primer4 和質粒2 進行PCR，獲得SUMO-RTA-4D5-DEKKMP（R4D）片段；將上述PCR 反應產物進行核酸電泳驗證，并使用OMEGA 公司的Cycle Pure試劑盒回收PCR 片段。

表1 引物

以質粒2 為模板，分別使用設計好的引物S1primer，primer5 和primer6，primer4 進行PCR，獲得SUMO-Xentry和Xentry-RTA-4D5-DEKKMP；對PCR 產物核酸電泳，并用OMEGA 公司的Gel Extraction 試劑盒切膠回收目標片段。

以回收的PCR 產物為重疊PCR 模板，加入S1 primer，primer4，PCR獲得SUMO-Xentry-RTA-4D5-DEKKMP（XR4D），進行核酸電泳驗證并用OMEGA 公司的Cycle Pure 試劑盒純化。

2.2.2 PCR 產物的連接

將上述所有PCR 產物和pET-28a 用限制性核酸內切酶Nco Ⅰ和Xho Ⅰ在37℃下水浴酶切2 小時。使用T4 連接酶將回收的PCR 酶切產物與酶切pET-28a 質粒連接，22℃，4h 或16℃過夜。

2.3 重組質粒轉化和驗證

將由PCR 連接的產物及DH5α 感受態細胞冰浴10 min 使其融化。再將10μL 的PCR 連接產物加入DH5α，并繼續冰浴30min。后迅速以42℃金屬浴熱激90s，并及時放回冰浴，持續降溫2min。最后加入1mL 的普通LB 培養基，于37℃孵育1h。孵育完成后，4000rpm離心90s，棄去上清，加入150μL 的普通LB 培養基重懸菌體，然后將其涂布在含有卡那抗性的LB 培養基平板上，于37℃搖床倒置，過夜培養。本實驗采取菌落PCR 以及核酸電泳驗證轉化結果，將PCR 產物進行核酸電泳，并觀察電泳結果，若電泳結果顯示PCR 產物大小與目的片段大小一致，則表明重組質粒轉化初步成功。將驗證成功的菌液加入0.5mL 的含有卡那霉素的LB培養基中后，置于37℃搖床中培養6h 并測序。使用試劑盒將測序正確的菌液培養并抽提質粒，將質粒轉化入BL21 感受態細胞中，獲得重組表達菌株。

2.4 誘導蛋白表達

取1.5 mL 菌液分別加入3 個200mL 卡那抗性的LB搖瓶中，37℃搖床中培養4 小時，加入50μL 1M 的IPTG誘導，放入18℃搖床中誘導表達，誘導時間為16h～20h左右。

2.5 蛋白純化

2.5.1 鎳柱純化

誘導表達結束后，去除上清LB 培養基，加入40mL PBS 緩沖液重懸菌體，利用超聲破碎儀進行細胞破碎，并取上清倒入干凈的離心管。將上清先通過0.45nm 孔徑的濾膜過濾，然后將上清通過鎳柱使其與鎳柱結合。分別用50mM、100mM、200mM 以及500mM 濃度的咪唑溶液對鎳柱洗脫，并收集洗脫液。分別將上樣流穿液和各濃度咪唑洗脫液取出30μL，加入10μL4×蛋白上樣緩沖液，制成蛋白樣。SDS-PAGE 電泳檢驗目標蛋白所在洗脫區間。

2.5.2 透析、濃縮、SUMO 酶切和再純化

用SUMO 蛋白酶對目的蛋白進行酶切，以獲得單獨的RK3、R4K3、R4D 和XR4D 蛋白。蛋白透析液采用20 mM 的PBS 緩沖液，將純化的蛋白裝在透析袋中用夾子夾好，然后放在PBS 緩沖液中進行透析。將蛋白通過10kDa 的超濾膜濃縮至10mL，并加入1mL 的SUMO 酶4℃過夜酶切。酶切產物通過鎳柱純化，并進行蛋白電泳檢測純化結果。

2.6 蛋白抗腫瘤活性檢測

采用MTT 法檢測目的蛋白對正常細胞及SKOV3 腫瘤細胞的毒性。先將80%鋪板率的細胞消化，制成單個懸浮的細胞液，再用血球計數板計數10μL 的細胞液。將細胞懸浮液稀釋到每1mL 含1×105 個細胞，每孔100μL 接種到96 孔板上，在37℃、5%CO2的環境下培養24h，讓細胞貼壁。細胞貼壁后，去除孔板中的完全培養基，用維持培養基將蛋白稀釋成不同濃度，加入孔板中培養72h。每孔加入10μL MTT 溶液，再培養4h。棄去上清液，每孔加入100μL 二甲基亞砜，在酶標儀上振蕩5min，然后讀取490nm 處的吸光度。然后再棄去上清，每孔加入100μL DMSO 溶液，在酶標儀上震蕩5min 后，使用酶標儀測定490nm 處的吸光度。

3 實驗結果與結論

由表2 的實驗結果可知，RK3 蛋白對H460 細胞和SKOV3 細胞有相似的抑制率，RK3 對正常細胞和腫瘤細胞均有一定的殺傷性且對正常細胞殺傷性略大于腫瘤細胞。R4K3 蛋白對正常細胞H460 幾乎沒有殺傷性，但對SKOV3 腫瘤細胞具有顯著的抑制能力。

表2 不同蛋白對H460 和SKOV3 的細胞抑制率

R4D 蛋白對正常細胞H460 幾乎沒有殺傷性，但對SKOV3腫瘤細胞具有顯著的抑制能力。與R4K3蛋白相比，R4D 蛋白對細胞的抑制能力基本相同。

XR4D 蛋白對正常細胞H460 幾乎沒有殺傷性，但對SKOV3 腫瘤細胞具有顯著的抑制能力。與R4K3 和R4D蛋白相比，R4D 蛋白對細胞的抑制能力基本相同，但達到最大抑制效果所需的蛋白濃度有所下降。

4D5 scFv 片段在提高蛋白毒素對腫瘤細胞的特異性方面有顯著的功效。但同時由于4D5 scFv 片段蛋白較大，可能是導致含有該片段的蛋白毒素相較于RTAKDEL 對腫瘤細胞殺傷性有所下降的原因。帶有Xentry穿膜肽的蛋白毒素由于其穿膜能力較強，所以達到最大毒性所需要的蛋白濃度相較沒有穿膜肽的蛋白毒素更低。帶有KDEL3 或DEKKP 內質網保留信號肽的蛋白毒素在蛋白毒性上相較于沒有內質網保留信號肽的RTA蛋白更強，說明內質網保留信號肽可以增強蓖麻毒素的細胞毒性。

4 展望

蓖麻毒素A 鏈是免疫毒素的研究熱點，本實驗通過添加4D5 scFv 片段提高了RTA 蛋白對腫卵巢癌瘤細胞的特異性，通過添加內質網保留信號KDEL、KDEL3、DEKKMP 提高了其蛋白毒性，通過添加Xentry 穿膜肽降低了達到最大細胞抑制率所需的蛋白濃度。但是DEKKMP 和Xentry 的作用機理并沒有進行深入探究，雖然已有文獻對這兩個信號肽做出機理的解釋，但都并非是在RTA 蛋白毒素方面的研究。在今后的實驗中，可以嘗試利用流式細胞儀測量細胞凋亡的早期和晚期比例，同時用激光共聚焦法觀察DEKKMP 和Xentry 影響下的RTA 蛋白在細胞中的分布，以進一步研究其作用機理。