基于代謝組檢測的草莓果實香氣物質的比較分析

馮 佳， 李 莉，范婧芳， 張建軍，楊 雷*，楊 莉*

（1.河北省農林科學院 石家莊果樹研究所，河北 石家莊 050061；2.河北省植保植檢總站，河北 石家莊 050035；3.河北省農林科學院，河北 石家莊 050051）

0 引言

水果的香氣是通過嗅聞感受到的揮發性物質，可以客觀地反映果品的成熟度、風味等品質，在吸引消費者和增強果品市場競爭力方面發揮了重要作用。草莓果實風味獨特，被認為是香氣物質種類最豐富的水果之一［1-2］。雖然草莓鮮果重中的揮發性物質含量占比僅為0.001%～0.01%，但對草莓香氣的形成有極重要的作用［3］。目前，草莓果實中已被鑒定到的揮發性代謝物有千余種［4］。Zhang等［5-9］研究發現，在大部分草莓品種中，酯類揮發性化合物的種類最為豐富、含量也最多，其次為醇類和醛類，另外還包括酮類、酸類、酚類、烷烴等。這些揮發性代謝物氣味各異，在草莓果實中通過協同或拮抗的相互作用，最終形成獨特的香氣。

影響草莓香氣的因素有很多，主要包括品種、光照、溫度、水肥、管理方式等［10-15］。不同的草莓品種表現出不同的香氣，例如京桃香具有特別濃的桃香味，源于京桃香中γ-癸內酯的濃度最高；而白雪公主的菠蘿香氣則由其特有物質2-甲基丁酸甲酯以及特征香氣物質丁酸甲酯、乙酸芐酯、丁酸乙酯、己酸甲酯、己酸乙酯、(E)-2-己烯醛、DMMF等共同作用形成［16］；通過研究紅顏不同發育時期的果實揮發性代謝物，推測出呋喃酮和己烯醛是紅顏果實的特征香氣物質［17］。光照對草莓香氣的形成有重要作用，通過遮陰處理，即光照強度減弱時，草莓的香氣物質種類明顯增加［18］；而用不同顏色的塑料薄膜對草莓進行遮蓋處理時，主要有透明、紅色、黃色、綠色、藍色和紫色等6種處理，結果顯示，經過紅膜遮蓋處理過的草莓果實中揮發性代謝物種類最多，其香氣濃度顯著增加［19-20］。科學的水肥管理、植株管理等措施也會促進草莓香氣的形成［21］。氮素營養可以影響草莓香氣物質的形成，在增加氮素的施加量以后，草莓中的一些香氣物質成分含量呈先上升后下降的變化趨勢，因此合理施用氮肥可以增加草莓的香氣濃度［22-23］。疏葉疏果等植株管理措施對草莓果實香氣物質的形成也有一定的影響。摘除葉子的同時會提高果實中酸類、醛類等物質的含量，而酯類和DMMF等一些主要香氣物質的相對含量會顯著下降，致使果實的香氣變淡；而隨著疏果的進行，主要香氣物質的含量會呈現上升趨勢，果實的香氣也會更加濃郁［24-25］。倪溢楠［26］將16種草莓果實的特征香氣成分分為5種類型：菠蘿香、果香、柑橘香、桃香和花香。付磊等［13］研究發現，青草香主要來源于醇類物質和醛類物質，也有研究表明果香味和花香味受到酯類和內酯類物質的影響，呋喃類物質則會形成焦糖味，玫瑰香味來源于沉香醇和DMMF等［27-29］。

本文選取冀香、冀九、紅顏3個香氣迥異的草莓品種作為研究對象，檢測草莓果實在不同發育時期的揮發性物質代謝譜，結合對3個品種的感官評價，以期探究影響草莓果實獨特香氣的關鍵物質，為開展草莓果實香氣的后續研究、篩選優質草莓品種等提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗于河北省農林科學院石家莊果樹研究所展開。選取的草莓品種包括：河北省石家莊果樹研究所自育優良品種冀香(JX)和冀九(JJ)以及本地栽培面積較為廣泛的日本品種紅顏(HY)。以上3個品種均栽植于河北省農林科學院石家莊果樹研究所草莓試驗基地日光溫室，統一進行常規的田間管理。采樣果實均為大小一致的二級果，摘取不同發育時期的新鮮果實后，立即進行液氮速凍，保存于-80 ℃的超低溫冰箱。每個樣品5個果實，每個品種3個重復。

1.2 草莓香氣風味的感官評價方法

按照《感官分析方法風味剖面檢驗》 (GB/T 12313—1990)的方法，從石家莊鐵道大學中選15名在讀本科生（7男8女）組成評價小組，進行香味感官描述詞的描繪統計。具體流程為：將成熟度相同且具有品質屬性代表性的草莓果實提供給評價員，每個品種提供3個果實；要求評價員進行嗅聞并對樣品的香氣盡可能多地選取詞匯進行描述；統計評價員對草莓果實香氣的描述詞匯，去除低頻詞匯和不準確詞匯，最終得到3個草莓品種的果實香氣描述詞匯。

獲得描述詞匯后，對草莓果實香氣進行感官評價。將3個不同品種的草莓果實樣品隨機提供給15位評價員，要求評價員對各香氣屬性的強度進行評分。采用定量評分法進行評分（5分：香氣特濃；4分：香氣較濃；3分：有香氣；2分：香氣較淡；1分：幾乎沒有香氣）。每輪評價完成后休息3 min，提供純凈水消除殘留余味和感官疲勞。

1.3 揮發性代謝物的測定方法

1.3.1 樣品提取 從-80 ℃冰箱中取出樣品進行液氮研磨，渦旋混合均勻，每個樣本稱取約1 g（液體1 mL)于頂空瓶中；分別加入飽和NaCl溶液、10 μL（濃度為50 μg/mL)內標溶液；采用全自動頂空固相微萃取(HS-SPME)進行樣本萃取，以供GC-MS分析。

1.3.2 色譜質譜采集 HS-SPME 萃取條件：在60 ℃恒溫條件下，震蕩5 min，120 μm的DVB/CWR/PDMS萃取頭插入樣品頂空瓶，頂空萃取15 min，于250 ℃高溫下解析5 min，然后進行GC-MS分離鑒定。采樣前萃取頭在250 ℃ Fiber Conditioning Station 中老化5 min。新萃取頭萃取前先在Fiber Conditioning Station中老化2 h；并且采用的是SPME Arrow，其靈敏度可達傳統SPME纖維頭的10倍。

色譜條件：DB-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm, Agilent J&W Scientific, Folsom, CA, USA)，載氣為高純氦氣（純度不小于99.999%），恒流流速為1.2 mL/min，進樣口溫度250 ℃，不分流進樣，溶劑延遲3.5 min。程序升溫：40 ℃保持3.5 min，以10℃/min的加熱速度升至100 ℃，再以7 ℃/min升至180 ℃，最后以25 ℃/min升至280 ℃并保持5 min。

質譜條件：電子轟擊離子源(EI)，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，質譜接口溫度280℃，電子能量70 eV，掃描方式為選擇離子檢測模式(SIM)、定性定量離子精準掃描(GB 23200.8—2016）。

1.4 數據處理

通過軟件Qualitative Analysis Workflows B.08.00打開瀏覽質譜分析后的下機原始數據，并用于定性分析。采用MassHunter定量軟件打開樣本下機質譜文件，進行色譜峰的積分和校正工作。

2 結果與分析

2.1 3種草莓果實香氣的感官評價

選取15人組成評價小組，對冀九、冀香、紅顏果實的香氣進行評價，統計結果后繪制成雷達圖（圖1）。結果顯示，冀九、冀香、紅顏3個品種的草莓果實風味各異，香氣濃郁。冀九的得分為花香5分，果香5分，甜香3分；紅顏表現為花香5分，還具有較濃的脂香和甜香，得分均為4分，果香3分。冀九和紅顏的香氣類型較為接近，且均是花香較為突出；冀香的香氣種類主要為果香、花香和青香，其中得分最高的是果香，為5分，花香和青香均為4分，酸香3分。因此，可將這3個品種初步分為2個類別：香甜濃郁、花香四溢的冀九和紅顏，果香濃郁且酸甜爽口的冀香。

圖1 3個品種草莓果實香氣的感官評價圖

2.2 3種草莓果實的揮發性代謝物分析

冀九、冀香、紅顏這3個品種的草莓果實表現出不同的香氣風味。為了進一步分析草莓果實形成不同香氣的原因，分別取各品種綠果期（授粉后13～15 d，G)、白果期（授粉后19～21 d，W)、轉色期（授粉后24～26 d，T)和成熟期（授粉后33～35 d，R)。通過揮發性代謝組共檢測到674種代謝物。從物質種類上看，萜類物質種類最多，有137種，其次為酯類物質，有116種，另外還包括雜環化合物、醇類、酮類、芳烴類、醛類、酚類、酸類等物質（圖2）。

圖2 3種草莓果實中揮發性代謝物質的種類占比圖

獲得代謝組結果后進行了主成分分析，以便初步了解各組樣本之間的總體代謝差異和組內樣本之間的變異度大小。由圖3可知，各樣本的3個生物學重復較好地聚集在一起，表明樣本的重復性較好。3個品種綠果期、白果期和轉色期的樣本較為聚集，與成熟期的樣本分散開來，表明在未成熟的果實中，不同品種間不同時期的代謝物差異相對較小，而到了成熟期，揮發性代謝物含量發生較大變化。在成熟期的果實樣本中，紅顏和冀九較為聚集，表明這2個品種成熟果實間的揮發性代謝物種類較為相近，而與冀香相距較遠，其揮發性代謝物差異較大，這一結果很好地驗證了感官評價的結果。

圖3 3種草莓果實樣本間的PCA分析

2.3 3種草莓果實不同發育時期代謝物的差異分析

隨著草莓果實的逐漸成熟，果實的香氣愈加濃郁。從熱圖分析結果來看(圖4），隨著3個品種果實的成熟，大部分代謝物的含量逐漸增多。火山圖（圖5）顯示了3個品種不同時期代謝物質的差異。由圖5可知，冀香白果期有84種揮發性代謝物，含量與綠果期相比差異顯著，其中的60種物質含量上升，24種物質含量下降；冀香轉色期的揮發性代謝物含量相較于其白果期，有61種物質含量顯著上升，沒有顯著下調的物質；冀香成熟期的揮發性代謝物含量相較于其轉色期，有277種物質含量發生顯著變化，其中有233種物質含量顯著上調。紅顏和冀九在不同時期果實中代謝物含量的變化規律與冀香表現一致，從綠果期到轉色期含量差異顯著的揮發性代謝物種類較少，而從轉色期到成熟期，含量發生顯著變化的種類急劇上升，且大多數物質的含量顯著上調，這表明從轉色期到成熟期，草莓果實中的香氣物質迅速且大量地積累，此為香氣形成的關鍵時期。在從轉色期到成熟期顯著上調的揮發性物質中，萜類和酯類物質種類最多，例如在冀香果實中（表1），萜類物質有61種，占總上調物質種類的27.6%，酯類物質有53種，占總上調物質的23.9%，綜上表明酯類物質和萜類物質是草莓果實香氣形成的關鍵物質。

表1 3種草莓果實成熟期顯著上調物質的種類及數量

圖4 3個品種草莓果實不同發育時期的揮發性代謝物含量

圖5 3個草莓果實品種不同發育時期差異代謝物火山圖

鑒于成熟期是草莓果實香氣形成的關鍵時期，本文著重分析了3種草莓果實從轉色期到成熟期的物質變化情況。由圖6a可知，在冀香中，上調最明顯的物質分別為反式-1-硝基-1-丙烯、(1S，4S，4αS)-1-異丙基-4,7-二甲基-1,2,3,4,4α、5-六氫萘、4,5-二氫-2-甲基-1H-咪唑、7,9-二甲基-十六烷等，4-(4-羥基-4-甲基戊基)-3-環己烯-1-甲醛、(Z，E)-3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯-1-醇、3-羥基-2-丁酮、丁酸丁酯等物質僅在冀香中呈現差異表達； 冀九中上調最明顯的物質分別為氧化石竹烯、順-5-十二碳烯酸、(1S，4S，4αS)-1-異丙基-4,7-二甲基-1,2,3,4,4α、5-六氫萘、反式-β-金合歡烯、丁酸乙酯等，其中丁酸乙酯、2,5-二丁氧基-2,5-二氫呋喃、(1R，4R，4αS，8αR)-4,7-二甲基-1-（丙烯基）-1,2,3,4,4α、5, 6,8α-八氫萘等物質僅在冀九中呈現差異表達(圖6b)；紅顏中上調最明顯的物質分別為(E)-2-己酸、(2E，4S，7E)-4-異丙基-1,7-二甲基環癸-2,7-二烯醇、氧化石竹烯、順-5-十二碳烯酸、順-3-己烯基苯甲酸酯等(圖6c)。這些物質的大量積累對草莓果實獨特香氣的形成起到了關鍵作用。

圖6 3種草莓品種果實成熟期差異（上調、下調）最顯著的前10種物質

利用 K均值（K-Means）聚類分析，進一步分析了冀九、冀香、紅顏3種草莓果實發育成熟進程中各種揮發性代謝物的變化趨勢，將揮發性代謝物的積累情況分為了5個簇（圖7）。由圖7可知，簇1、簇2、簇5中的物質在冀九、冀香、紅顏3種草莓果實中的變化規律基本一致。在簇5中共包含139種揮發性代謝物，這些代謝物的含量從綠果期到白果期再到轉色期緩慢積累，從轉色期到成熟期急劇上升，這與草莓果實香氣的形成過程一致。比如，簇5中的萜類物質芳樟醇、酯類物質乙酸甲酯、酚類物質苯酚、酮類物質2,6,6-三甲基雙環［3.2.0］庚-2-烯-7-酮，簇2中的醇類物質（2E，4S，7E）-4-異丙基-1,7-二甲基環癸-2,7-二烯醇、萜類物質α-石竹烯醇、酯類物質順-3-己烯基苯甲酸酯、酮類物質2-庚酮等含量在綠果期、白果期、轉色期極低，而在成熟期非常高，可猜測出這些物質對草莓果實香氣的形成至關重要。簇1中的物質含量在3個草莓品種果實中的變化趨勢一致，均隨著果實的發育成熟呈下降的趨勢，這與草莓果實中香氣積累的變化過程不一致，因此簇1中的這些物質對草莓果實香氣的形成影響甚微。

圖7 3種草莓果實發育成熟進程中各種揮發性代謝物的K均值聚類分析

2.4 不同草莓果實品種間的差異代謝物分析

簇2和簇5中的代謝物含量隨著果實的發育成熟逐漸積累，進一步分析發現，簇5中的代謝物質在冀香成熟期的積累量顯著高于紅顏和冀九的。其中，3-戊烯-2-醇在冀香成熟期果實中的相對含量最高，分別是紅顏和冀九成熟期果實中的3倍和7.4倍。其次分別是萜類芳樟醇、酯類乙酸甲酯、含氮物質反式-1-硝基-1-丙烯、酚類物質苯酚。同樣的設置條件下，冀香果實成熟期的揮發性代謝物含量是紅顏、冀九的2倍，通過篩選共獲得56種物質，其中萜類物質14種，酯類物質12種，雜環化合物12種(圖8a)。3-戊烯-2-醇、反式-1-硝基-1-丙烯、4,5,6,7-四氫-3,6-二甲基-苯并呋喃、(R)-(-)-香芹酮、乙酸對甲酚酯這5種物質的相對含量較高，2-（1-甲基丙基）-苯酚、2,3-二甲基-三環［2.2.1.0（2,6）］庚烷-3-甲醇這2種物質僅在冀香中大量積累。結合冀香的獨特香氣，可推測這些物質對果香、青香和酸香的形成較為關鍵。

圖8 3種草莓品種果實成熟期不同香氣物質統計

冀九表現出濃烈的花香和淡淡的果香、甜香、脂香，并且冀九中含量較高的物質主要集中在簇2中。冀九中含量最高的是醇類：(2E，4S，7E)-4-異丙基-1,7-二甲基環癸-2,7-二烯醇，其次為酯類：丁酸辛酯、萜類α-石竹烯醇和氧化石竹烯、酸類順-5-十二碳烯酸、酯類3-甲基-丁酸-1-乙基-1,5-二甲基-4-己烯酯。同樣的設置條件下，冀久果實成熟期的揮發性代謝物含量是紅顏、冀香的2倍，共得到90種物質，種類最多的為萜類28種，其次是酯類25種(圖8b)。在這些物質中，含量最高的是（2E，4S，7E）-4-異丙基-1,7-二甲基環癸-2,7-二烯醇，分別是冀香、紅顏中的2.61倍、3.06倍。另外，乙酸癸酯、α-石竹烯醇、氧化石竹烯、十三烷醛、3-甲基-丁酸-1-乙基-1,5-二甲基-4-己烯酯等物質在冀九中含量也非常高。己二酸二乙酯、2,2′-異亞丙基雙（5-甲基呋喃）這2種物質僅在冀九中大量積累。以上這些物質可能對冀九香氣的形成有重要貢獻。

紅顏的果實香氣與冀九更為相近，與冀香相比，紅顏的甜香、脂香、花香香型較為突出，因此挑選了在冀九和紅顏的成熟果實中積累較多而在冀香中含量較少的物質(圖8c)。共48種物質，其中酯類物質14種，萜類物質7種，芳烴類物質6種。這些物質分布于除簇5以外的其他分組，簇2中有24種，簇4中有17種。酮類物質異佛爾酮、4′-羥基-3′-甲氧基苯乙酮含量最高，其次為萜類物質（2S，3S，6S）-6-取代基-3-甲基-2-（丙烯基）-3-甲苯環己酮、［1S-(1α，4β，5α)］-1,8-二甲基-4-（1-甲基甲苯）-螺環［4.5］癸烯、α-法呢烯等。這些物質可能對甜香、脂香、花香的香型形成貢獻較大。

3 討論

果實香氣是影響消費者偏好和購買欲的重要品質。果實中揮發性物質的種類和含量是果實香氣形成的關鍵因素。本研究利用揮發性物質代謝組檢測獲得了冀香、冀九和紅顏3個不同草莓品種在不同發育時期的揮發性物質代謝譜，并結合果實香氣的感官評價展開了分析。基于15人感官評價小組的感官評價結果，冀香的主要香氣類型為果香、酸香和青香，而冀九與紅顏的香氣類型較為接近，主要為花香、甜香和脂香。不同研究對相同草莓品種香氣類型的劃分存在一定的差異。王娟等［16］的研究表明，紅顏的主要香型為花香，與本研究結果較為一致；倪溢楠［26］的研究結果表明，紅顏的主要香型為果香，與本文研究結果不一致，這可能與研究方法、栽培環境等因素的差異有關。

筆者采用揮發性代謝組手段共檢測到674種揮發性代謝產物，數目上顯著高于以往的研究［12,16］，體現出了代謝組學的優越性。其中，萜類物質最多，其次為酯類物質、雜環化合物、酮類、醇類、醛類等，相較于前人的研究，萜類物質、雜環化合物的種類數量明顯提高。冀香、冀九和紅顏這3種草莓果實中的揮發性代謝物均在果實成熟期時大量積累，表明成熟期是草莓果實香氣形成的關鍵時期。王娟等［16,29］研究表明，在草莓果實中，酯類物質的種類和含量最豐富，是形成草莓香氣的主要物質。本研究結果顯示，在草莓果實成熟期，萜類和酯類物質的上調積累最顯著，因此，研究認為除了酯類物質外，萜類物質對草莓香氣的形成也有較大作用。

基于成熟期是草莓香氣形成的關鍵時期，本研究著重對比了3個草莓品種果實轉色期與成熟期揮發性代謝產物的差異。其中，(2E，4S，7E)-4-異丙基-1,7-二甲基環癸-2,7-二烯醇、丁酸辛酯、α-石竹烯醇、氧化石竹烯、3-甲基-丁酸-1-乙基-1,5-二甲基-4-己烯酯等物質在3個草莓品種成熟期的果實中含量都非常高，表明這些物質是草莓香氣形成的關鍵物質。一些酯類物質可以使草莓散發果香味，如丁酸乙酯、乙酸甲酯、己酸乙酯這3種物質具有菠蘿香味，丁酸甲酯具有蘋果香味等。在冀香、冀九和紅顏中，乙酸甲酯、丁酸乙酯、丁酸辛酯、己酸甲酯、辛酸丁酯、丁酸丁酯、戊酸芳樟酯、異丁酸香葉酯等多種酯類物質大量積累，形成了這3個品種的草莓果實果香味，并且這些物質在冀香和冀九中的含量是紅顏的2倍以上，因此在感官評價結果中，冀香和冀九的果香味比紅顏的更濃一些。芳樟醇表現為花香味，在冀香和紅顏中含量均非常高，且成熟期含量極顯著高于轉色期，但是在冀九中并沒有檢測到芳樟醇，表明芳樟醇是冀香和紅顏花香的主要成分，而冀九的花香則來源于其他物質，比如萜類物質α-石竹烯醇等。

利用K均值（K-Means）聚類分析將揮發性代謝物分為5類，簇1中的物質含量在3個品種中隨著果實的成熟均呈下降趨勢，這與草莓果實香氣的形成趨勢相反，表明這些物質不參與最終果實香氣的形成。簇2中的物質隨著果實的成熟逐漸積累，并且這些物質在冀九中的含量顯著高于冀香和紅顏。例如己二酸二乙酯、2,2′-異亞丙基雙（5-甲基呋喃）這2種物質僅在冀九中大量積累，（2E，4S，7E）-4-異丙基-1,7-二甲基環癸-2,7-二烯醇、乙酸癸酯、α-石竹烯醇、氧化石竹烯、十三烷醛、3-甲基-丁酸-1-乙基-1,5-二甲基-4-己烯酯等物質在冀九中的含量是冀香和紅顏的2倍以上，因此可認為簇2中的物質對冀九香氣的形成有較大貢獻。同樣，簇5中的物質在冀香果實成熟期的積累量顯著高于冀九和紅顏的，這些屬于冀香獨特的香氣物質，即對果香、青香和酸香的形成十分重要。簇3中的香氣物質含量在冀九和冀香中均呈現先上升后下降的變化趨勢，但在紅顏中隨著果實的成熟逐漸積累，猜測這些物質對紅顏香氣的形成有重要貢獻。而簇4中的物質僅在冀九和紅顏中隨著果實的成熟逐漸積累，是冀九和紅顏香氣成分的共有物質，即對花香、甜香和脂香的形成較為重要。

4 結論

利用代謝組共檢測到674種揮發性代謝物，其中萜類物質和酯類物質的種類最多，是影響草莓香氣形成最重要的2類物質。簇5中發現有3-戊烯-2-醇、芳樟醇、乙酸甲酯等139種物質在冀香果實成熟期時大量積累，對冀香果實中果香、青香和酸香的形成較為關鍵；冀九果實表現出濃烈的花香和淡淡的果香、甜香、脂香，發現有194種物質（簇2）在冀九果實中大量積累，包括己二酸二乙酯、2,2′-異亞丙基雙（5-甲基呋喃）等，對冀九香氣的形成極為重要；而簇3中有73種物質在紅顏香氣的形成過程中發揮了重要作用。