冷凍電鏡平臺3＋X運行模式的探索與思考

吳航軍，韓 琴，肖桂鳳，林趙肖楠，戎 葉

（1.浙江大學醫學院，杭州 310058；2.杭州師范大學基礎醫學院，杭州 311121）

0 引 言

1931 年，德國科學家Max Knoll 和Ernst Ruska 發明了世界上第一臺透射電子顯微鏡，使人們可以觀察到超顯微細胞結構，發現了各種重要的細胞器。然而，利用傳統電子顯微鏡觀察生物樣本存在明顯的技術瓶頸：①電鏡的高真空環境難以維持生物樣本的水環境；②高能電子輻射會損傷生物樣本；③生物樣本需要進行重金屬染色后成像，難以獲得高分辨結構圖像。為了解決這些瓶頸問題，以瑞士洛桑大學的Jacques Dubochet教授、美國哥倫比亞大學的Joachim Frank 教授和英國劍橋MRC 分子生物學實驗室的Richard Henderson教授為代表的科學家在樣本制備方法、圖像三維重構技術和數據收集相機等方面做出開創性工作，為實現冷凍電鏡技術（cryo-electron microscopy，Cryo-EM）奠定了堅實基礎，讓冷凍電鏡成為解析生物大分子結構的利器，他們3 人因此共同獲得了2017 年諾貝爾化學獎。經過多年的發展，冷凍電鏡技術已與X 射線晶體學（X-ray crystallography）、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）成為結構生物學研究的三大主流技術。相比其他技術，冷凍電鏡技術優勢顯著：無須結晶、樣本接近天然狀態、所需樣本量極少、適用廣泛。近十多年來，冷凍電鏡技術已成功解析了眾多其他技術手段難以解析的重要生物大分子復合物，包括剪切體［1-3］、離子通道［4-11］、線粒體呼吸鏈超復合體［12］、光系統超復合體［13-15］、藻膽體［16］、G 蛋白偶聯受體（GPCR）［17-22］和新冠病毒相關蛋白結構［23-30］等。

中國生物電鏡技術研究起始于20 世紀80 年代，隨后在90 年代開啟了國內冷凍電鏡技術研究新篇章。2008 年，清華大學購置了亞洲第1 臺300 kV 冷凍電鏡Titan Krios，建立了國內第一個冷凍電鏡平臺，隨后中國科學院生物物理所和國家蛋白質中心（上海）也分別組建了冷凍電鏡平臺。浙江大學歷時4 年于2017 年5 月成功建立了國內第4 個、浙江省第1 個冷凍電鏡平臺。

以2017 年諾貝爾化學獎的授予和冷凍電鏡技術在多個領域的應用發展為契機，國內各大高校、科研院所掀起了冷凍電鏡平臺建設的熱潮。截至2022 年5月，國內已有15 個省市34 家單位建成冷凍電鏡平臺，已安裝或購置的300 kV 冷凍電鏡共有69 臺（見圖1），近半數分布在北京和上海，全球范圍內300 kV 冷凍電鏡的數量已經超過400 臺。自2014 年起，國內不斷涌現出利用冷凍電鏡技術獲得的突破性成果，截至2022 年5 月，累計發表在Cell、Nature、Science 期刊上的高水平論文近150 篇。自2019 年以來國內大部分冷凍電鏡平臺均已成熟穩定運行，每年支撐的高水平論文約占全球20%（見圖2），居世界前列水平，這得益于近些年我國在冷凍電鏡平臺設施建設的大力投入以及我國科研工作者研究水平的大幅提升。浙江大學冷凍電鏡中心配備了1 臺300 kV 冷凍電鏡，2019 年至今，累計支撐發表了13 篇Cell、Nature、Science 期刊論文，充分體現了中心支撐高水平科研成果的高效性。

圖1 國內300 kV冷凍電鏡分布

圖2 自2010年以來利用冷凍電鏡發表CNS文章國內外分布情況

1 冷凍電鏡平臺的建設

2013 年，我校開始籌建冷凍電鏡中心，相關人員先后赴清華大學、中科院生物物理所和國家蛋白質中心（上海）等地調研學習冷凍電鏡平臺建設和運行的經驗，經過近4 年的籌措組建，配備了300 kV 冷凍電鏡的冷凍電鏡中心于2017 年5 月正式運行。冷凍電鏡中心（以下簡稱中心）旨在建成基于冷凍電鏡技術、常規生物電鏡技術、三維大尺度掃描電鏡技術和光電關聯顯微鏡技術的跨尺度高端生物電鏡中心，為結構生物學、細胞生物學、神經生物學和材料學等學科研究提供技術服務，具體儀器架構如圖3 所示。中心組建了學術委員會、教授管理委員會和技術團隊：學術委員會由國內電鏡領域知名專家組成，對中心的中、長期發展規劃提出咨詢和審議意見；教授管理委員會由校內多個學院電鏡相關的專家或用戶組成，對中心日常運行的重大事項進行審議決策；技術團隊由浙江大學求是特聘教授和浙江大學求是講座教授領銜、13 名技術人員組成（博士4 名、碩士9 名，其中事業編制6 人，項目聘用6 人，退休返聘1 人），分別負責冷凍電鏡技術、細胞／組織結構分析技術（常規及免疫電鏡、電子斷層成像、光電關聯）、臨床輔助診斷技術和儀器維護與技術開發。

圖3 冷凍電鏡中心儀器架構

2 探索3＋X創新運行模式

冷凍電鏡中心的建設和運行需有充足的經費持續性支撐，一個完備的冷凍電鏡中心初期建設經費需近1 億元，規模較大的則超過2 億元，日常運行、設備的耗材更換以及后期維保費用，是冷凍電鏡中心運行的主要支出，如若沒有源源不斷的經費注入，將會給中心運行帶來巨大的壓力，這也是國內外冷凍電鏡平臺面臨的最主要問題之一。中心自建成運行以來，積極探索創新運行模式，在確保提供高質量技術服務的前提下，大力擴展業務，力求實現收支平衡。

2.1 3＋X技術支撐體系

中心成立后，力求以夯實冷凍電鏡、常規電鏡和大尺度掃描電鏡三大技術作為對外服務的根基，積極探索開發并完善各項技術的應用領域，逐步形成3＋X的技術服務體系。

（1）免疫電鏡技術的完善和應用。免疫電鏡技術是透射電鏡技術重要的補充，可對蛋白質實現精確定位，是生物電鏡技術中難度較大的一類，其難度在于保持抗原活性同時還需保證良好的細胞超微結構，中心經過多年的探索和完善，現該技術已成熟應用在生命科學領域多個學科的蛋白定位。

（2）光電關聯技術的建立。光電關聯是一種光學顯微鏡結合電子顯微鏡開展研究的技術體系，電子顯微成像技術在成像特點、分辨率及應用范圍等方面與光學顯微成像技術存在很大的互補性。通過技術關聯彌補各自短板、突破單一技術的限制，獲得更多的樣本信息［31］。因此，在同一樣本的分析中結合兩種或多種成像技術的模式使用越來越普遍。針對不同樣品或實驗條件，中心不斷孵化新型光電關聯技術，實現在細胞、組織和冷凍等條件下實施關聯技術，現已初步建成光電關聯技術體系。

（3）發展電鏡臨床輔助診斷技術。相比常規病理科診斷所用的熒光顯微鏡，電鏡在分辨率上有極大的優勢，為充分發揮醫院醫療資源優勢和冷凍電鏡中心設備與技術資源優勢，2018 年浙大冷凍電鏡中心聯合浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院簽署合作框架協議，設立“電鏡診斷研究中心”，在臨床科研和臨床診斷等方面開展全面的合作，同年與浙江省人民醫院生殖科簽訂合作協議，共同探索電鏡技術在生殖健康研究和臨床輔助診斷方面的應用。此外，冷凍電鏡中心也與多家醫院達成合作，將電鏡技術應用在腎病、口腔疾病、血液病及神經系統疾病等領域的臨床輔助診斷，擴展電鏡技術應用的同時，也更好地將高校儀器設備服務于社會。

（4）冷凍電鏡技術應用的拓展。冷凍電鏡技術能瞬間將樣品固定在接近天然的狀態下，是研究樣品天然狀態的最佳技術之一，除了應用在生命科學領域的結構與功能研究，在藥物結構、新能源材料、生物高分子等輻射敏感材料的高分辨成像也能受益于冷凍電鏡技術的應用。

2.2 開放服務模式

為了確保中心有序運行，向用戶提供最優質高效的技術服務，中心嘗試完善對外開放模式，并不斷探索新的運行模式。

（1）信息化平臺搭建用戶與中心的橋梁。以中心網站和公眾號為主體，實現信息化管理，集合信息發布、培訓講座、儀器預約與管理、數據傳輸、門禁關聯和監控等功能，提升用戶與中心的交互性，實現中心管理集約化、運行高效能。

（2）加強教學培訓實行分類管理。教學方面，為研究生開設《研究生科研技能》課程，通過理論和上機實操講授電子顯微鏡技術、冷凍電鏡技術和科研圖片的獲取與處理等課程及上機實操，穩固研究生的實驗技術基礎；培訓方面，針對各類儀器，定期開展小班培訓，提高學生的儀器操作能力，經過初級培訓的用戶可以獲得普通資格，能預約工作時間段的儀器；對于已熟練掌握儀器理論知識及儀器操作能力的學生，經考核通過后獲得資深資格，可預約任意時間段，不受非工作時間限制，且儀器使用費大幅優惠。通過預約權限導向和收費標準導向，對用戶進行適度分流，避免工作時間段的擁擠，并有效提升儀器非工作時間利用率，實現儀器開放最大化。自運行以來，累計受益學生超1 200人次。

（3）技術傳承與技術人才培養。中心每年為校內勤工儉學的學生設立多個助管崗位，為學生減輕經濟負擔，也讓學生在實踐中得到歷練、獲得實驗技能，為后續深造或工作提供幫助；中心與河南化工技師學院建立長期合作關系，作為實習基地，對口培養電子顯微鏡技術專業的學生，為中心和國內其他兄弟單位輸送電鏡技術人才；中心也為國內兄弟院校的技術人員提供了技術培訓服務。擁有熟練實驗技能的助管或實習生，均可作為中心技術隊伍的一部分，為用戶提供優質的技術服務。

（4）適度保障應急需求。部分使用率較高的儀器無法在工作時間滿足測試需求，對于只有普通資格且有緊急使用需求（如文章修回補實驗等）的用戶，中心不斷摸索新的工作模式，鼓勵工作人員在非工作時間加急完成測試服務，并為其提供調休或加班津貼，該模式仍在摸索階段，將在實踐中不斷完善。

3 運行成效

3.1 創新模式下運行效率大幅提升

在“3＋X”運行模式下，中心對外服務量及機時逐年增長，服務范圍涵蓋校內外科研、臨床診斷、制藥等領域。截至2021 年12 月，已經為校內500 多個課題組和250 多個校外單位提供了高水平的科研技術服務，對外服務機時累計424 623 h，用戶服務評測滿意率超95%。中心的業務不斷拓展，范圍覆蓋校內、國內高校和科研院所、醫院、企業，用戶來自生命、醫藥、農學、材料、化學、能源、環境、臨床等學科。2018～2021 年，中心儀器平均校外機時占25.6%，校外測試收入占37.4%。此外，通過業務拓展和優化管理，一部分使用率低的老舊設備使用效率得到了極大提升，2000 年購置的100 kV透射電子顯微鏡，在2017 年納入中心管理后，拓展電鏡臨床輔助診斷技術應用，擴大對外服務，運行效率大幅提升，服務機時數和樣本量攀升了3 倍。測試收入大幅提升，為中心的運行提供了有力的保障（見圖4）。中心運行收入主要來自對外測試服務（占76.3%）、學校補貼（占13.2%）和共建單位支持（占10.4%），主要支出包括設備維保與維修（55.1%）、人員費（占29.9%）和試劑耗材及辦公（占15.0%）等，至2021 年，中心已經基本實現收支平衡，實現良性循環。

圖4 單臺透射電子顯微鏡運行效率大幅提升

3.2 服務成效顯著

冷凍電鏡中心的運行，為學校的發展提供了重要的支撐作用：吸引了包括海外優青、浙江省千人、浙大百人等19 人加盟；2017 年成立以來支撐發表高水平論文超過50 篇，其中Science、Nature 和Cell 論文13篇，支撐獲得多個獎項，包括2019 年全國十大科學進展1 項、2021 年中國科技十大突破1 項，浙江大學2021 年度突出學術貢獻獎1 項、浙江大學2021 年度十大科學進展2 項；成立以結構生物學為重點的生物物理學系，與臨床醫學、基礎醫學、生物學、農學等學科展開廣泛的交叉合作。

3.3 助力獲得突破性成果

中心技術團隊不斷發展新技術、改進現有技術條件，突破技術瓶頸、解決技術難題、提升設備效率，提高技術支撐水平，通過中心的技術支持，在醫學、結構生物學、神經科學、植物學等多個領域取得了突破性進展，包括人源甲狀旁腺激素受體結構與動力學研究［32］、抗癲癇、高血壓藥物靶點解析［33］、瑞德西韋抗新型冠狀病毒基礎藥理研究［34］、古老綠硫細菌光合作用反應中心解析［14］、GPCR 激活以及配體識別的結構解析［35］、細菌鞭毛馬達結構、組裝與扭矩傳輸機制研究［36］、大麥葉綠體光系統超大復合物三維結構解析［15］、昆蟲納米分辨率完整三維結構重建［37］等。

4 面臨的問題

（1）儀器和技術的更新。結構生物學領域研究競爭激烈，很大程度上依賴于冷凍電鏡的性能和前沿的冷凍電鏡技術。隨著冷凍電鏡技術的發展，電鏡光源、直接電子探測器、能量過濾器等硬件性能的提升，冷凍電鏡技術得到了進一步突破，可以實現接約0.1 nm（1 ?）的近原子分辨率［38］，新的冷凍電鏡將會助力解決更多生命科學及其他領域的問題；隨著冷凍電子斷層掃描技術（cryo-electron tomography，Cry-ET）的成熟，基于原位結構解析的冷凍電鏡技術將在生命科學領域發揮更重要的作用；電鏡領域大部分儀器設備國產率低，特別是冷凍電鏡主體、直接電子探測器和數據收集及分析軟件均依賴進口，主要由美國的Thermo Fisher和Gatan公司壟斷。電鏡樣品制備相關的部分設備已經實現國產化或者在研制中，相信在未來，國產化的比例將會越來越高。

（2）運行和發展的壓力。冷凍電鏡技術在國內普及已有近5 年時間，隨著冷凍電鏡技術的發展，前期配置的冷凍電鏡的硬件性能已落后于主流型號，儀器零部件故障率大幅增加，儀器的維修維護以及迭代更新，都需要大量、持續的經費投入，這對于國內大部分冷凍電鏡平臺的運行將會有較大的壓力。除了提高自我造血能力、維持收支平衡、確保良性運行，新型冷凍電鏡等儀器的購置仍需學校、社會和國家層面的大力支持。

（3）技術支撐隊伍的穩定與發展。國內已建成超過30 個冷凍電鏡平臺，部分在企業，然而，因對技術人員專業要求高、培養周期長等因素導致人才一直緊缺。同時受編制、待遇和職業發展等因素影響，不少技術人員仍缺乏歸屬感和穩定性，中心培養的技術人員不斷流失，已有6 人先后離職，這對中心的技術服務和長遠發展極其不利。

5 結 語

高校和科研院所冷凍電鏡中心的建成和運行，讓多個學科收益頗豐，在相關領域的結構和功能研究上取得了一系列具有國際影響力的突破性成果，并將持續產出。技術發展上，冷凍電鏡技術將向更高分辨率發起沖擊，實現接近0.1 nm 超高分辨率結構解析能力，解決諸如藥物設計、新能源材料、無機高分子材料和納米光子學等領域的瓶頸問題，促進多學科交叉會聚，實現從0～1 的突破；以冷凍電子斷層掃描技術（Cryo-ET）為主體的原位結構生物技術將會逐步得到完善和應用，實現在細胞和組織原位解析生物大分子復合物的高分辨三維結構，揭示物質的結構與功能關系。平臺運行方面，探索冷凍電鏡平臺收支平衡的運行模式至關重要，建立完善的電鏡技術體系，實現自我造血；人才隊伍建設方面，加強人才隊伍建設，完善晉升和績效考核機制，切實提高技術人員待遇，提升技術人員的歸屬感，設立實驗技術研究專項基金，有助于平臺技術體系的完善和服務水平的提高；建立一支穩定、高水平的技術隊伍，引育高層次技術人才，以技術提升和高水平服務為導向，實現從儀器操作到功能開發的轉變，從服務科研到引領科研的轉變，體現技術人才的價值。此外，冷凍電鏡相關設備主要依賴進口，需要國內相關專家共同努力，重點研制冷凍電鏡關鍵部件，早日實現自主研發生產，解決這一領域的“卡脖子”問題。