響應(yīng)面法優(yōu)化蕎麥花黃酮提取工藝研究*

李 湘，文 瑤

(廣東藥科大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

苦蕎(Fagopyrumtataricum(L.)Gaertn)，起源于我國西南部，在贛、川等地方有廣泛種植。苦蕎不僅富含蛋白質(zhì)及維生素，而且含有黃酮類、萜類、山奈酚[1]等多種多樣的天然化學(xué)成分。多項研究表明[2-5]，苦蕎中具有高含量的黃酮，常食苦蕎具有降血糖、清除自由基的作用，具有較高的藥用和保健價值。但是，蕎麥花中含有的黃酮含量并不高，要通過一系列技術(shù)才能提高蕎麥花總黃酮的提取率。本研究選擇響應(yīng)面法，精確研究各因子與響應(yīng)值關(guān)系，為蕎麥花黃酮大規(guī)模生產(chǎn)和開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 儀器

酶標(biāo)儀、離心機、超聲機、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、萬分之一天平。

1.2 試劑

蕎麥花，由亳州吉興堂藥業(yè)公司(中藥批發(fā))提供；乙醇(天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)、NaOH(天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)、亞硝酸鈉(天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)、硝酸鋁(天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)。

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立參考文獻(xiàn)[6]并做修改。配制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法，在 510 nm 處測吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為Y=4.1801x+0.0107，r2=0.9971，表明蘆丁在0.0452～0.1888 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，可用于蕎麥花總黃酮含量的測定。按以下公式計算蕎麥花總黃酮提取率：

(1)

其中，ρ為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得的蕎麥花總黃酮的質(zhì)量濃度，mg/mL；N為稀釋倍數(shù)；V為提取液體積，mL；m為蕎麥花干粉的質(zhì)量，g。

2.2 單因素實驗

以蕎麥花總黃酮提取率為指標(biāo)，采用控制變量法分別考察超聲溫度(40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃)、液料比(10 mL/g、15 mL/g、20 mL/g、25 mL/g、30 mL/g)、超聲功率(160 W、200 W、240 W、280 W、320 W)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(20%、40%、60%、80%、100%)和超聲時間(20 min、40 min、60 min、80 min、100 min)對蕎麥花總黃酮提取率的影響。

2.3 響應(yīng)面分析法優(yōu)化蕎麥花總黃酮提取工藝

運用Expert-design 8.0進(jìn)行3因素3水平Box-Behnken試驗設(shè)計，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時間作為考察因素，以黃酮提取率為響應(yīng)變量，進(jìn)行響應(yīng)面法實驗設(shè)計，篩選最佳提取條件。

3 結(jié)果與討論

3.1 提取單因素實驗考察結(jié)果

3.1.1 溫度對蕎麥花總黃酮提取率的影響

由圖1可知，提取率在 60 ℃ 之前隨著溫度的增加而增加，當(dāng)溫度升至 70 ℃～80 ℃ 時，總黃酮提取率下降。這可能是前期提取時隨著溫度升高，分子運動加劇，細(xì)胞破裂速度加快，有利于蕎麥花總黃酮的溶出；而當(dāng)溫度達(dá)到 60 ℃ 后溫度繼續(xù)升高，過高的溫度會把蕎麥花總黃酮的黃酮分子結(jié)構(gòu)破壞。因此，溫度選擇控制在 60 ℃。

圖1 提取溫度對蕎麥花總黃酮提取率的影響

3.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對蕎麥花總黃酮提取率的影響

由圖2可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%時，蕎麥花總黃酮提取率最優(yōu)，乙醇體積分?jǐn)?shù)升至100%時，總黃酮提取率反而減少。其原因可能是總黃酮包括黃酮及其苷類化合物在內(nèi)，在乙醇體積分?jǐn)?shù)較低時表現(xiàn)出水的極性，具有羥基的苷類化合物先溶出；隨著乙醇濃度逐漸提高，極性降低，疏水性的結(jié)構(gòu)便逐漸被溶出，降低提取率。因此，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%作為響應(yīng)面中心點。

圖2 料液比對蕎麥花總黃酮提取率的影響

3.1.3 料液比對蕎麥花總黃酮提取率的影響

由圖3可知，蕎麥花總黃酮提取率在料液比為 1∶25(g/mL)后達(dá)到巔峰，1∶25后料液比再繼續(xù)上升，提取率就開始下降。原因可能是料液比小于1∶25(g/mL)時，體系內(nèi)少量溶劑無法將蕎麥花粉末完全浸濕導(dǎo)致蕎麥花總黃酮溶出不完全；而當(dāng)料液比達(dá)到1∶25(g/mL)時，體系內(nèi)的總黃酮溶出完全，之后總黃酮提取率降低可能是因為體系中含有的過量乙醇導(dǎo)致蕎麥花總黃酮的損失，導(dǎo)致提取率降低。故選取料液比為1∶25(g/mL)作為響應(yīng)面的中心點。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對蕎麥花總黃酮提取率的影響

3.1.4 超聲功率對蕎麥花總黃酮提取率的影響

由圖4可知，超聲功率達(dá)到 280 W 時提取率達(dá)到最大，隨后逐漸降低。原因可能是超聲波功率較小時體系中溶解的蕎麥花總黃酮較小，加大超聲波功率能使更多的總黃酮溶出，但是當(dāng)總黃酮溶出到達(dá)體系的飽和值時，加大超聲波的功率則會使更多雜質(zhì)溶出，從而影響蕎麥花總黃酮的提取率。因此，超聲功率選擇控制在 280 W。

圖4 超聲功率對蕎麥花總黃酮提取率的影響

3.1.5 超聲時間對蕎麥花總黃酮提取率的影響

如圖5顯示，超聲時間較短時蕎麥花總黃酮提取率較低。隨著超聲時間延長，蕎麥花總黃酮提取率穩(wěn)步上升。沒有下降趨勢，可能是時間因素對蕎麥花總黃酮提取率損耗的影響不大。在保證總黃酮提取率的基礎(chǔ)上，考慮到節(jié)約生產(chǎn)時間和生產(chǎn)成本問題，選擇 40 min 為響應(yīng)面中心點。

3.2 響應(yīng)面法優(yōu)化實驗結(jié)果

1)統(tǒng)計分析及模型的適應(yīng)性

通過響應(yīng)面的星點設(shè)計，得到17個因素不同的試驗組，結(jié)果如表1所示。表2為回歸模型的方差分析。由表2可知，建立的蕎麥花總黃酮提取率的模型顯著性明顯(P<0.05)，即建立的模型有意義；決定系數(shù)為7.6867，變異系數(shù)為12.22%，說明實際值與預(yù)測結(jié)果擬合度較好，誤差低；失擬項P值差異不顯著(P>0.05)，顯示模型值可替代實際實驗值對結(jié)果進(jìn)行分析。模型一次項A、二次項A2和交互項BC對響應(yīng)值的影響較達(dá)顯著水平，其余項對總黃酮的提取效率均不明顯。由F值可知，蕎麥花總黃酮提取實驗兩因素交互影響大小為：BC>AC>AB；3個因素對響應(yīng)值的影響依次為A(乙醇體積分?jǐn)?shù))>B(液料比)>C(超聲時間)。

表1 響應(yīng)面分析方案及實驗結(jié)果

表2 回歸模型方差分析

2)響應(yīng)曲面分析

應(yīng)用Design-Expert 12軟件，可直觀地得出各因素對響應(yīng)值影響的響應(yīng)面圖和等高線圖。從圖6～圖8可知，響應(yīng)面曲線變化越陡峭和等高線圖越接近橢圓，響應(yīng)值變化就越大，說明各因素對響應(yīng)值影響較大。通過觀察3個交互因素形成的曲面陡峭程度，料液比與超聲時間的交互影響最大，其次是乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲時間的交互影響，再到乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比二者的交互影響。

圖6 交互作用AB對蕎麥花總黃酮得率的影響

圖7 交互作用AC對蕎麥花總黃酮得率的影響

圖8 交互作用BC對蕎麥花總黃酮得率的影響

3.3 響應(yīng)面實驗驗證

響應(yīng)面法優(yōu)化得蕎麥花中總黃酮超聲輔助醇提取工藝的最適條件為：超聲時間 59 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)63%、料液比為1∶21(g/mL)。通過平行實驗驗證得到的優(yōu)化工藝后的提取率為：3.01、3.06、3.08 mg/g，取其平均值得 3.05 mg/g。與水浸提法得到的提取率 1.56 mg/mL 相對比，優(yōu)化工藝后得到的提取率比水浸提法的提取率高96%。

4 結(jié)論

實驗得到蕎麥花總黃酮最佳提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)63%、料液比1∶21(g/mL)、時間 59 min。比普通提取水浸提法高達(dá)96%。