李 湘，文 瑤

(廣東藥科大學 藥學院，廣東 廣州 510006)

苦蕎(Fagopyrumtataricum(L.)Gaertn)，起源于我國西南部，在贛、川等地方有廣泛種植。苦蕎不僅富含蛋白質及維生素，而且含有黃酮類、萜類、山奈酚[1]等多種多樣的天然化學成分。多項研究表明[2-5]，苦蕎中具有高含量的黃酮，常食苦蕎具有降血糖、清除自由基的作用，具有較高的藥用和保健價值。但是，蕎麥花中含有的黃酮含量并不高，要通過一系列技術才能提高蕎麥花總黃酮的提取率。本研究選擇響應面法，精確研究各因子與響應值關系，為蕎麥花黃酮大規模生產和開發利用提供理論依據。

1 材料與儀器

1.1 儀器

酶標儀、離心機、超聲機、旋轉蒸發儀、萬分之一天平。

1.2 試劑

蕎麥花，由亳州吉興堂藥業公司(中藥批發)提供；乙醇(天津致遠化學試劑有限公司)、NaOH(天津致遠化學試劑有限公司)、亞硝酸鈉(天津致遠化學試劑有限公司)、硝酸鋁(天津致遠化學試劑有限公司)。

2 方法

2.1 標準曲線的建立

蘆丁標準曲線的建立參考文獻[6]并做修改。配制蘆丁標準品，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法，在 510 nm 處測吸光度。以蘆丁質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得標準曲線線性回歸方程為Y=4.1801x+0.0107，r2=0.9971，表明蘆丁在0.0452～0.1888 mg/mL 范圍內線性關系良好，可用于蕎麥花總黃酮含量的測定。按以下公式計算蕎麥花總黃酮提取率：

(1)

其中，ρ為根據標準曲線得的蕎麥花總黃酮的質量濃度，mg/mL；N為稀釋倍數；V為提取液體積，mL；m為蕎麥花干粉的質量，g。

2.2 單因素實驗

以蕎麥花總黃酮提取率為指標，采用控制變量法分別考察超聲溫度(40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃)、液料比(10 mL/g、15 mL/g、20 mL/g、25 mL/g、30 mL/g)、超聲功率(160 W、200 W、240 W、280 W、320 W)、乙醇體積分數(20%、40%、60%、80%、100%)和超聲時間(20 min、40 min、60 min、80 min、100 min)對蕎麥花總黃酮提取率的影響。

2.3 響應面分析法優化蕎麥花總黃酮提取工藝

運用Expert-design 8.0進行3因素3水平Box-Behnken試驗設計，以乙醇體積分數、料液比、超聲時間作為考察因素，以黃酮提取率為響應變量，進行響應面法實驗設計，篩選最佳提取條件。

3 結果與討論

3.1 提取單因素實驗考察結果

3.1.1 溫度對蕎麥花總黃酮提取率的影響

由圖1可知，提取率在 60 ℃ 之前隨著溫度的增加而增加，當溫度升至 70 ℃～80 ℃ 時，總黃酮提取率下降。這可能是前期提取時隨著溫度升高，分子運動加劇，細胞破裂速度加快，有利于蕎麥花總黃酮的溶出；而當溫度達到 60 ℃ 后溫度繼續升高，過高的溫度會把蕎麥花總黃酮的黃酮分子結構破壞。因此，溫度選擇控制在 60 ℃。

圖1 提取溫度對蕎麥花總黃酮提取率的影響

3.1.2 乙醇體積分數對蕎麥花總黃酮提取率的影響

由圖2可知，當乙醇體積分數達到80%時，蕎麥花總黃酮提取率最優，乙醇體積分數升至100%時，總黃酮提取率反而減少。其原因可能是總黃酮包括黃酮及其苷類化合物在內，在乙醇體積分數較低時表現出水的極性，具有羥基的苷類化合物先溶出；隨著乙醇濃度逐漸提高，極性降低，疏水性的結構便逐漸被溶出，降低提取率。因此，選擇乙醇體積分數為80%作為響應面中心點。

圖2 料液比對蕎麥花總黃酮提取率的影響

3.1.3 料液比對蕎麥花總黃酮提取率的影響

由圖3可知，蕎麥花總黃酮提取率在料液比為 1∶25(g/mL)后達到巔峰，1∶25后料液比再繼續上升，提取率就開始下降。原因可能是料液比小于1∶25(g/mL)時，體系內少量溶劑無法將蕎麥花粉末完全浸濕導致蕎麥花總黃酮溶出不完全；而當料液比達到1∶25(g/mL)時，體系內的總黃酮溶出完全，之后總黃酮提取率降低可能是因為體系中含有的過量乙醇導致蕎麥花總黃酮的損失，導致提取率降低。故選取料液比為1∶25(g/mL)作為響應面的中心點。

圖3 乙醇體積分數對蕎麥花總黃酮提取率的影響

3.1.4 超聲功率對蕎麥花總黃酮提取率的影響

由圖4可知，超聲功率達到 280 W 時提取率達到最大，隨后逐漸降低。原因可能是超聲波功率較小時體系中溶解的蕎麥花總黃酮較小，加大超聲波功率能使更多的總黃酮溶出，但是當總黃酮溶出到達體系的飽和值時，加大超聲波的功率則會使更多雜質溶出，從而影響蕎麥花總黃酮的提取率。因此，超聲功率選擇控制在 280 W。

圖4 超聲功率對蕎麥花總黃酮提取率的影響

3.1.5 超聲時間對蕎麥花總黃酮提取率的影響

如圖5顯示，超聲時間較短時蕎麥花總黃酮提取率較低。隨著超聲時間延長，蕎麥花總黃酮提取率穩步上升。沒有下降趨勢，可能是時間因素對蕎麥花總黃酮提取率損耗的影響不大。在保證總黃酮提取率的基礎上，考慮到節約生產時間和生產成本問題，選擇 40 min 為響應面中心點。

3.2 響應面法優化實驗結果

1)統計分析及模型的適應性

通過響應面的星點設計，得到17個因素不同的試驗組，結果如表1所示。表2為回歸模型的方差分析。由表2可知，建立的蕎麥花總黃酮提取率的模型顯著性明顯(P<0.05)，即建立的模型有意義；決定系數為7.6867，變異系數為12.22%，說明實際值與預測結果擬合度較好，誤差低；失擬項P值差異不顯著(P>0.05)，顯示模型值可替代實際實驗值對結果進行分析。模型一次項A、二次項A2和交互項BC對響應值的影響較達顯著水平，其余項對總黃酮的提取效率均不明顯。由F值可知，蕎麥花總黃酮提取實驗兩因素交互影響大小為：BC>AC>AB；3個因素對響應值的影響依次為A(乙醇體積分數)>B(液料比)>C(超聲時間)。

表1 響應面分析方案及實驗結果

表2 回歸模型方差分析

2)響應曲面分析

應用Design-Expert 12軟件，可直觀地得出各因素對響應值影響的響應面圖和等高線圖。從圖6～圖8可知，響應面曲線變化越陡峭和等高線圖越接近橢圓，響應值變化就越大，說明各因素對響應值影響較大。通過觀察3個交互因素形成的曲面陡峭程度，料液比與超聲時間的交互影響最大，其次是乙醇體積分數與超聲時間的交互影響，再到乙醇體積分數與料液比二者的交互影響。

圖6 交互作用AB對蕎麥花總黃酮得率的影響

圖7 交互作用AC對蕎麥花總黃酮得率的影響

圖8 交互作用BC對蕎麥花總黃酮得率的影響

3.3 響應面實驗驗證

響應面法優化得蕎麥花中總黃酮超聲輔助醇提取工藝的最適條件為：超聲時間 59 min、乙醇體積分數63%、料液比為1∶21(g/mL)。通過平行實驗驗證得到的優化工藝后的提取率為：3.01、3.06、3.08 mg/g，取其平均值得 3.05 mg/g。與水浸提法得到的提取率 1.56 mg/mL 相對比，優化工藝后得到的提取率比水浸提法的提取率高96%。

4 結論

實驗得到蕎麥花總黃酮最佳提取工藝為：乙醇體積分數63%、料液比1∶21(g/mL)、時間 59 min。比普通提取水浸提法高達96%。