低共熔溶劑對菹草中黃酮、多酚和多糖類化合物的提取*

劉 盼，崔艷雨，岳 琳，商書波，王愛麗

(德州學院，德州市食品加工高濃度有機廢水處理及資源化利用工程實驗室，德州市環境友好功能材料工程研究中心，山東 德州 253023)

菹草是一種特殊的冬春季生活型沉水植物，莖葉比較發達，有較大的比表面積，能有效去除水中的污染物[1-3]。當菹草衰亡沉積到水底時，被微生物分解，消耗溶解氧并向水中釋放一些污染物，造成水體二次污染[4-6]。有研究表明，菹草中含有豐富的黃酮和多酚類化合物[7]。黃酮和多酚類化合物，作為具有生物活性和醫療功能的天然化學產物，具有清除人體內多余的自由基、減緩衰老、增強人體免疫力等功效[8-9]。

關于菹草中黃酮、多酚和多糖類化合物的提取，已有一定的研究，不同的提取溶劑和提取方法對黃酮和多酚類化合物的提取率影響較大。例如，蔡榮榮等[7]采用90%的乙醇提取菹草中的黃酮和多酚類化合物，用石油醚和乙酸乙酯對提取物進行萃取。近年來，低共熔溶劑(DESs)已被用于天然產物中活性成分的提取(如黃酮、皂苷、多糖、生物堿、醌類、酚酸、揮發油等)、分離、色譜分析等。低共熔溶劑(DESs)是由氫鍵受體與氫鍵供體通過氫鍵結合形成的一種低共熔混合物，具有低熔點、低成本、低毒性、易制備、可生物降解、溶解性能好[10-11]等獨特的物理化學性質，被認為是一種新型的綠色溶劑。有研究表明，DESs不僅能增加生物活性成分的溶解性，還對不穩定生物活性成分具有良好的增穩作用[12-13]。本文選用綠色高效的天然低共熔溶劑對菹草中黃酮、多酚和多糖類化合物進行提取，開發菹草新的應用價值，不僅可以減少環境污染，還可以實現生物資源的再利用，達到以廢治廢的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1)菹草，采于山東省德州市岔河，在實驗室內用清水洗凈，去除雜質，低溫烘干后粉碎為粉末狀，置于陰涼干燥處備用。

2)DESs的合成。按照1∶2的物質的量比稱取 27.926 g 氯化膽堿(作為氫鍵受體)和 24.8 g 乙二醇(氫鍵供體)，放入燒杯中；利用磁力攪拌器攪拌，控制油浴溫度 80 ℃，加熱 1 h ，直至形成均一透明的液體[14]。臨用前，分別將DESs與水按照一定體積比配制的含水量為0(純DESs)、30%、40%、50%、60%、80%、90%和100%的DESs(純水)。

1.2 儀器和試劑

循環水真空泵(SHZ-D(Ⅲ)型，鞏義市予華儀器有限責任公司)；集熱式型恒溫加熱磁力攪拌器(85-2，菏澤市鑫源儀器儀表有限公司)；紫外-可見分光光度計(752型，上海菁華科技儀器有限公司)；粉碎機(XTP-100型，浙江永康市紅太陽機電有限公司)；旋轉蒸發儀(N-1100型，上海愛朗儀器有限公司)。

氯化膽堿、乙二醇、沒食子酸、葡萄糖、蘆丁標準品、氫氧化鈉、乙酸乙酯、苯酚、濃硫酸、無水碳酸鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁，均為分析純試劑；福林酚為生物試劑。

1.3 有效成分的提取

稱取8份 1.0 g 干燥的菹草粉末，量取8份 10 mL 不同含水率的DESs，分別混合。將混合物置于 50 mL 的圓底燒瓶中，控制油浴溫度60～65 ℃，用磁力加熱攪拌器加熱攪拌 1 h 。提取完畢后，抽濾，得到8份提取液，記錄每份提取液的體積。

1.4 有效成分的測定

1.4.1 黃酮類化合物的測定

黃酮類化合物的測定參考劉景煜的方法[15]。分別取 1.00 mL 提取液，稀釋10倍。各取 1.00 mL 稀釋液到 10 mL 比色管中，加5%亞硝酸鈉溶液 0.30 mL，搖勻，放置 6 min；加10%硝酸鋁溶液0.30 mL，搖勻，放置 6 min；加 1 mol/L 氫氧化鈉溶液 4.00 mL，再用無水乙醇稀釋至刻度，放置 15 min 后；以去離子水作參比，在 510 nm 處測定其吸光度。

1.4.2 多糖類化合物的測定

多糖類化合物的測定參考周偉娥的方法[16]。分別取 1.00 mL 提取后的樣品，稀釋50倍。取稀釋后的 2.00 mL 樣品置于 10 mL 比色管，另取 2.00 mL 去離子水作空白對照。向上述各試管中加入 1.00 mL 6%苯酚溶液，搖勻；滴加 5.00 mL 濃硫酸后加水至 10 mL，搖勻；靜置 15 min；以去離子水作參比，于 490 nm 處測定吸光度。

1.4.3 多酚類化合物的測定

多酚類化合物的測定參考陳曉明的方法[17]。分別取 1.00 mL 稀釋10倍后的樣品到 10 mL 比色管中，加入 1.00 mL 50%的FC(福林酚)溶液和 2.00 mL 15%碳酸鈉溶液；用超純水定容至刻度線，充分混勻后，室溫下避光放置 1 h；以蒸餾水作參比，在 760 nm 處測定其吸光度。

實驗中發現，DESs樣品中溶劑干擾多酚的測定，采取如下方法消除干擾：分別取 1.00 mL 樣品放入圓底燒瓶中，分3次加入 6.00 mL 乙酸乙酯進行萃取；然后旋轉蒸發。旋干液體后用 6.00 mL 蒸餾水沖洗燒瓶，再用蒸餾水定容至 10 mL，重復上述步驟。

多酚在溶液中是解離狀態和分子狀態并存，并且溶液pH的大小會影響多酚的存在形態，進而影響多酚萃取效率[18-19]。實驗對比研究了pH的影響，先用pH試紙測定含DESs樣品的pH；如果樣品pH小于等于4，則不再調pH；如果樣品pH大于4，需用硫酸調節pH為4，其余步驟同上。

1.4.4 提取率的計算

根據公式(1)計算菹草中黃酮、多酚和多糖類化合物的提取率。

(1)

式中：T為菹草中黃酮、多酚和多糖類化合物的提取率；X為稀釋樣品中黃酮、多酚和多糖類化合物的質量濃度(mg/mL)；D為稀釋倍數；V為菹草樣品抽濾體積(mL)；m為菹草樣品質量(g)。

2 結果與討論

2.1 黃酮、多糖、多酚類化合物標準曲線

黃酮、多糖和多酚類化合物標準曲線見表1。

表1 黃酮、多糖和多酚類化合物的標準曲線

2.2 DESs含水量對黃酮化合物提取效果的影響

黃酮普遍存在于各種植物和水果中，能夠加快血液循環速率，降低膽固醇和心腦血管疾病的發病率。DESs含水量對菹草黃酮提取效果的影響見圖1。

圖1 不同含水量的低共熔溶劑對菹草中黃酮類化合物提取效果的影響

由圖1可知，隨著DESs中含水量的增加，DESs對菹草中黃酮類化合物的提取效率先升高后降低的趨勢，當提取溶劑含水量為40%時，提取效率最高為1.718%。當提取溶劑含水率低于40%時，可能是因為DESs的黏度變大，導致組分流動性弱，分子難以擴散，提取后樣品難以過濾，因此提取效果不佳。當提取溶劑含水量超過40%時，隨著含水量的增大，DESs的優勢減弱，溶劑主要呈現水的性質。基于相似相溶原理，黃酮作為有機組分，在水中溶解度較低，因此提取效率最低。

本實驗在含水量為40%的DESs的提取菹草中黃酮類化合物的提取效率為1.718%，即含量為 17.18 mg/g。張云麗等[20]測得山東產半枝蓮中黃酮類化合物(野黃岑苷和木犀草素)含量為 12.331 mg/g，唐森等[21]的研究中得到刀豆殼中總黃酮最大提取量為 2.330 mg/g。相比半枝蓮和刀豆殼中的黃酮類化合物，菹草中的黃酮類化合物含量較高，可研究開發菹草的藥用功能。

不同的提取溶劑對菹草中黃酮類化合物的提取效率不同。例如，蔡榮榮等[7]以90%的乙醇為溶劑，分別用石油醚和乙酸乙酯對菹草中的黃酮類化合物進行萃取，測得菹草中總黃酮含量分別為0.1235%和0.0760%，明顯低于本實驗中含水量40%的DESs 作為提取溶劑時的提取率。

2.3 DESs含水量對多糖類化合物提取效果的影響

不同含水量的DESs對菹草多糖類化合物提取效果見圖2。

圖2 不同含水量的低共熔溶劑對菹草中多糖類化合物提取效果的影響

由圖2看出，隨著DESs中含水量的增加，DESs菹草中多糖類化合物的提取效率先升高后降低：

1)純DESs(0含水量的DESs)對多糖類化合物的提取效率最低，可能是因為純DESs為透明膠狀液體，DESs含量高時黏度較大，分子擴散弱。

2)隨著含水量的增加，DESs黏度降低，樣品在溶液中分散度增大，相應的接觸面積也增大，使得菹草樣品能得到充分的溶解融合，從而DESs溶劑對菹草中的多糖類化合物提取率呈上升趨勢。當 DESs的含水量為80%～90%時，對多糖類化合物的提取率高達1.976%。

3)100%含水量即純水對菹草中多糖類化合物的提取較低，可能是因為多糖類化合物大部分是大分子化合物，在水中的溶解度有限。

因此提取多糖類化合物宜采用含水量為80%～90%的DESs溶劑。本實驗中菹草的多糖含量為1.976%，徐輝等[22]測得烏龍頭的粗多糖含量為 3.4 g/kg，海力茜·陶爾大洪等[23]測得蕪菁多糖平均含量為8.99%。相比烏龍頭和蕪菁，菹草中多糖含量較少。

2.4 DESs含水量和提取溶液pH對多酚類化合物提取效果的影響

由于測定多酚類化合物時，提取溶劑DESs對測定有干擾，為避免此干擾，采取了萃取的方法。萃取時，多酚類化合物為分子狀態時萃取效果較好。為使多酚類化合物以分子態為主，應使溶液保持弱酸性，因此在萃取前先用硫酸調節溶液pH為4[18-19]，同時做未調pH組進行比較。由于含水量為90%的DES樣品液和含水量為0的DESs(即純DESs)樣品液pH為4，符合弱酸性的條件，因此沒有再調pH。

不同含水量的低共熔溶劑和提取溶液pH對菹草多酚類化合物提取效果的影響如圖3所示。

圖3 不同含水量的低共熔溶劑和提取溶液pH對菹草中多酚類化合物提取效果的影響

由圖3看出，含水量60%的 DESs和含水量80%的DESs對菹草中多酚類化合物的提取效率較高。提取多酚類化合物萃取前對溶液pH進行調節，對提取效率影響較大。調節pH的提取效率明顯高于未調節pH的，其中含水量為80%的 DESs調節pH的提取率是未調節pH的7.53倍。再一次證實了pH對多酚類化合物存在形態的影響。

3 結論

采用不同含水量的DESs對菹草中的黃酮、多糖和多酚類化合物在油浴溫度為 60 ℃，加熱回流提取 1 h 時，得到如下結論：

1)隨著DESs中含水量的增加，DESs菹草中黃酮類化合物的提取效率先升高后降低；當提取溶劑為含水量40%的DESs時，提取效率最高，為1.718%。

2)隨著DESs中含水量的增加，多糖類化合物的提取效率先升高后降低；含水量為80%的 DESs對多糖類化合物的提取率最高，提取率為1.976%。

3)提取多酚類化合物萃取前對溶液pH進行調節對提取效率影響較大；調節pH的提取效率明顯高于未調節pH的，其中含水量為80%的 DESs調節pH的提取率是未調節pH的7.53倍。

4)測得菹草中黃酮類化合物含量較高，多糖和多酚類化合物含量較低，可進一步開發菹草藥用價值。