漿液性卵巢癌患者的斯鈣素2表達水平及其與預后的關系

吳文娟，陳歷排，張東輝，高春輝

廣州醫科大學附屬腫瘤醫院婦科腫瘤外科1、病理科2、重癥醫學科3，廣東 廣州 510095

根據2020年癌癥統計，全世界每年約有313 959例卵巢癌新發病例和207 252 例卵巢癌相關的死亡病例[1]。卵巢上皮性腫瘤為最常見的卵巢腫瘤，多數確診時已是晚期，轉移及復發率高，因此卵巢癌治療仍存在巨大挑戰[2]。斯鈣素2 (Stanniocalcin 2，STC2)屬于高度保守的分泌型糖蛋白激素家族。人類的STC2是由302個氨基酸組成，廣泛表達于腎、卵巢、骨、神經及肌肉等組織中，并具有廣泛的促瘤作用[3]。本文基于公共數據庫TCGA及GTEx的轉錄組數據，對STC2在泛癌中的差異表達、預后意義進行了分析，進而在高級別漿液性卵巢癌及正常卵巢組織中，采用免疫組化檢測STC2的表達，并且分析STC2的表達水平與患者預后的相關性，為后續的分子及機制的研究提供臨床基礎。

1 材料與方法

1.1 泛癌中的STC2 數據來源于TCGA (The Cancer Genome Atlas，癌癥基因組圖譜)及GTEx(Genotype Tissue Expression)數據庫中level3 HTSeq-FPKM格式的RNAseq 數據，將其轉成TPM 格式并進行log2轉化。統計分析及可視化主要使用的是R(3.6.3版本)軟件的ggplot2(3.3.3 版本)。本文分析了STC2 在TCGA 的腫瘤組織及對應的GTEx 正常組織中的差異表達。Tumor Immune Estimation Resource(TIMER，http://timer.comp-genomics.org/)可用于分析泛癌中的免疫浸潤情況，包括TCGA數據中的32種癌癥10 897例樣本的基因表達、臨床預后、體系突變、體細胞拷貝數的改變以及腫瘤免疫系統的特征[4]。采用TIMER 2.0在線分析了STC2 在泛癌中的免疫浸潤情況?；赥CGA 的臨床信息，分組為0～50vs50～100，使用R 語言的survival 包(3.2～10 版本)用于生存資料的統計分析；survminer 包(0.4.9 版本)用于可視化。分析STC2在泛癌中的預后意義。

1.2 材料與主要試劑 收集2012 年1 月至2019年5月在廣州醫科大學附屬腫瘤醫院婦瘤科手術并經病理確診為漿液性卵巢癌的102例患者的卵巢腫瘤組織，以及2011年3月至2019年7月因非卵巢部位良性病變行卵巢切除的26 例正常卵巢組織。標本離體后經石蠟包埋固定保存。所有患者術前均簽署知情同意書并獲得廣州醫科大學附屬腫瘤醫院倫理委員會批準。術后根據病理結果接受化療、靶向治療等規范治療。STC2 抗體購自abcam(ab262857)，使用安捷倫公司的Dako Omnis 全自動免疫組化儀進行免疫組織化學染色，顯色試劑使用DAKO GV800。

1.3 免疫組化測定 采用免疫組織化學法(Immunohistochemistry，IHC)檢測STC2 在漿液性卵巢癌及正常卵巢組織中的表達。所有待測樣本經石蠟包埋固定連續切片備用，切片厚度為3 μm，經HE染色確診為腺癌后進行常規免疫組化染色。各步驟嚴格遵照試劑盒說明書進行操作。具體方法：使用免疫組化專用防脫玻片，60℃烘烤1 h，上機；脫蠟2 min；抗原修復，使用tris-EDTA(PH9.0)抗原修復液進行標本抗原修復，條件為97℃、30 min；修復完畢的切片在染色單元進行全自動染色，一抗孵育條件為32℃、30 min，HRP 標記的多聚物二抗孵育20 min，DAB 顯色反應5 min，蘇木素襯染5 min。染色完畢的切片進行脫水干燥，使用環保封片劑封片，鏡下觀察。結果由至少兩名病理科醫生判讀：染色的評分主要考慮著色強度及陽性細胞的百分率，著色強度分為無色(0 分)、淡棕色(1 分)、棕黃色(2 分)、棕褐色(3 分)；陽性細胞百分率：＜25% (1 分)，26%～50% (2 分)，51%～75% (3 分)，＞75%(4 分)，兩者得分相乘，＞4 分判定為高表達，否則為低表達。

1.4 隨訪 根據患者病歷上登記的聯系方式，使用電話或者門診進行隨訪，隨訪開始時間為手術時間，隨訪結束時間為隨訪截止時間或術后死亡時間，隨訪時間截止至2019 年7 月16 日。無進展生存時間(progression free survival time，PFS)指手術時間至首次復發或轉移時間或隨訪截止時間?？偵鏁r間(overall survival，OS)指手術時間至全因死亡時間或隨訪截止時間。

1.5 統計學方法 基于公共數據庫的差異表達分析，數據來源于UCSC XENA (https://xenabrowser.net/datapages/)經Toil流程[5]統一處理的TCGA和GTEx的TPM 格式RNAseq 數據。計數資料使用頻數(百分率)表示，比較STC2 在漿液性卵巢癌及正常對照組中的表達采用χ2檢驗或Fisher's 精確檢驗。差異基因表達分析時兩組間的差異比較，若滿足正態性檢驗，方差齊選用獨立樣本T檢驗，方差不齊選用Weltch t'test；若不滿足正態性檢驗使用Mann-WhitneyU檢驗。Kaplan-Meier 生存曲線用于預后分析，組間比較采用Log-rank檢驗。預后分析采用COX回歸模塊。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 STC2 在泛癌中的表達差異 基于STC2 在TCGA 及GTEx 數據庫中的表達差異分析顯示，STC2在多種癌種中存在差異表達，如圖1 所示，與正常對照組比較，STC2在腎上腺皮質癌、膽管癌、結腸癌、腎透明細胞癌、卵巢癌等24 個癌種中均高表達，在胰腺癌、腎乳頭狀細胞癌、肺腺癌、甲狀腺癌等6 個癌種中均低表達。

圖1 STC2在泛癌中的表達差異Figure 1 Differential expression of STC2 in Pan-cancer

2.2 STC2 在泛癌中的預后價值 STC2 在泛癌中的預后分析提示，在腎上腺皮質癌、膀胱尿路上皮癌、宮頸癌、結腸癌等21個癌種(圖2展示了20個癌種)中，STC2表達的高低與患者的預后相關，除在腎透明細胞癌中，在其余的20 個癌種中STC2 表達高的患者預后更差。

圖2 STC2在泛癌中的預后價值Figure 2 Prognostic value of STC2 in Pan-cancer

2.3 泛癌中STC2 與免疫浸潤的相關性 STC2在泛癌中的表達水平與免疫浸潤的相關性分析顯示，在婦科腫瘤如卵巢癌、宮頸癌、子宮內膜癌，消化道腫瘤如肝癌、食管癌、胃癌、直腸癌以及呼吸道腫瘤如肺腺癌及鱗癌等21個癌種中STC2的表達與腫瘤的免疫浸潤相關(圖3)。

圖3 泛癌中STC2與免疫浸潤的相關性Figure 3 Correlation between STC2 and immune invasion in Pan-caner

2.4 STC2在漿液性卵巢癌組織及正常卵巢組織中的表達 采用免疫組化檢測STC2在漿液性卵巢癌組織與正常卵巢組織中的表達(圖4)，102 例漿液性卵巢癌組織中STC2 高表達33 例(32.35%)，低表達69 例(67.65%)，26 例正常卵巢組織中STC2 高表達僅1 例(3.85%)，其余25例(96.15%)均為不表達或者表達量很低，且兩組間比較差異有統計學意義(P=0.002 3)，提示STC2可能是漿液性卵巢癌的診斷標志物。

圖4 STC2在漿液性卵巢癌及正常卵巢組織中的表達(SP)Figure 4 Expression of STC2 in serous ovarian cancer and normal ovarian tissue(SP)

2.5 STC2表達水平與漿液性卵巢癌患者生存預后的關系 對收取的102例漿液性卵巢癌患者進行隨訪(8 例患者失訪)，中位隨訪時間為18.94 個月，使用Kaplan-Meier 生存分析顯示：與STC2 低表達的患者比較，STC2 高表達的患者生存時間更長，預后更好(圖5A)，兩者差異具有統計學意義(P＜0.001)。基于公共數據庫中探針203438_at 以及203439_s_at 的預后數據，使用Kaplan-Meier Plotter 在線數據庫(https://kmplot.com/analysis/)，對STC2 在卵巢癌中漿液癌這一病理亞型中的預后進行分析，結果顯示，在漿液性卵巢癌中STC2高表達組的生存時間更長，預后更好，差異有統計學意義(P=0.022、0.006 4)，見圖5B、5C。

圖5 STC2在漿液性卵巢癌中的預后意義Figure 5 Prognostic significance of STC2 in serous ovarian cancer

3 討論

STC 是一種最早在硬骨魚鰓中發現的糖蛋白激素，其作用在于通過影響鈣離子內流來降低細胞內鈣的濃度，從而調節鈣磷穩態[6-8]。后來，在人類及其

他哺乳動物中證實STC 由STC1 和STC2[9-10]組成，并廣泛分布于多種組織中。人類STC1 位于染色體8p11.2-p21，STC2 位于染色體5q33 或5q35[11-12]。其中STC2 在脊椎動物中高度保守，根據The Human Protein Atlas 數據庫顯示，STC2 廣泛表達于腎、卵巢、骨骼、神經元和肌肉等多種組織，并在維持礦物質穩態和促進腫瘤生長的過程中發揮重要作用，目前已在多種癌癥中發現STC2 存在差異表達，且這種差異表達對患者的預后具有預測價值[3，13-16]。

本研究基于公共數據庫對STC2 在多種癌種中的差異表達、預后及免疫浸潤進行分析發現，STC2在24個癌種中均為高表達狀態，且其高表達狀態與20個癌種的患者更差的預后相關，進一步分析提示，STC2的表達水平與21個癌種的免疫浸潤狀態相關，以上數據提示，STC2 在腫瘤的發生發展中可能起著重要的作用。本文重點對STC2在卵巢癌樣本中表達水平進行了驗證，結果提示STC2 在卵巢癌的表達明顯高于正常組，這與前文泛癌分析結果基本一致，從而互相印證。進一步的預后分析顯示，在卵巢癌中STC2 高表達的患者生存時間更長，預后更好，提示STC2對患者的預后有預測價值。

文獻報道，STC2 與卵巢癌上皮間質轉化相關，其可增加乏氧卵巢癌細胞的遷移和侵襲，與患者的生存時間呈負相關關系[14]。此外，STC2 可下調E-cadherin的表達，上調N-cadherin、Vimentin 以及基質金屬蛋白MMPs-2 和9 的表達，并且通過調控缺氧誘導因子HIF-1促進卵巢癌細胞的增殖[15]。Law等[17]報道STC2在卵巢癌細胞系SKOV3、OVCAR3 及CaOV3 低表達。本文基于公共數據庫的分析，STC2 在多個癌種中存在差異表達，并且與多個癌種的患者預后及免疫浸潤存在明顯的相關性。無論是公共數據庫的漿液性卵巢癌隊列或者本地漿液性卵巢癌隊列的數據分析顯示，STC2蛋白在正常卵巢組織中表達很低，甚至不表達，但在高級別漿液性卵巢癌組織中高表達，表達越高預示著患者的生存時間更長，這與上述文獻中報道的似有不符，然而文獻報告中研究對象多為上皮性卵巢癌，而本文中的預后主要針對上皮性卵巢癌中漿液性這一病理亞型進行的分析，上述的不一致意味著STC2在不同病理類型卵巢癌的發生及發展中的作用機制可能不同。臨床上，不同病理類型的卵巢癌在發病機制、生物學行為及預后亦存在較大差異，基于本文的這些發現，為臨床上后續進一步研究STC2 在不同病理類型卵巢癌生物學中的作用以及引起這種差異可能的機制奠定基礎，體現精準醫學的理念，為STC2作為漿液性卵巢癌潛在的生物標志物和治療靶點提供理論依據。