納米TiO2處理對山定子響應重茬土壤脅迫的生理效應研究

張悅　牛潔　王詩琦　劉興萍　王延秀

關鍵詞：山定子；TiO₂；重茬土壤；生理特性；主成分分析

中圖分類號：S661.1 文獻標志碼：A 文章編號：2097-2172（2023）07-0654-08

糧食安全對農業基礎地位的夯實具有重要意義，因土地資源有限及國家政策不允許占用耕地新建果園等因素的影響，為了舊果園迭代更新、提質增效，必須重茬建園，即在老產區同一塊土地連續多年重茬種植同一種果樹。重茬建園易引發再植障礙，通常表現為生長受到抑制、產量低甚至死亡，影響果園“整齊度”及經濟效應發揮。中國蘋果種植總面積達200萬hm²左右，總產量4200萬t，具有明顯的規模化產業優勢。甘肅屬于西北黃土高原蘋果重點產區，是我國重要的蘋果優勢產區，其氣候、土壤、環境等多項因素均與優質蘋果生產所需條件高度吻合，具有得天獨厚的區位優勢。甘肅省目前初步形成了以靜寧、西峰、涇川為中心的隴東黃土高原區和以天水為中心的隴南淺山丘陵區兩大蘋果優勢產區，全省蘋果種植面積為24.11萬hm²，總產量達340.47萬t，分別居全國第3位和第5位，蘋果已成為甘肅優勢特色產業和農民脫貧增收的主導產業。但目前甘肅省有16%以上的果園走向“老齡化”，重茬建園技術亟須解決。研究發現，施用適宜的外源納米材料可有效改善作物再植障礙問題，目前已在棉花、番茄、小麥等作物上得到驗證。

納米材料是指在三維空間中至少有一維處于納米尺寸（0.1～100.0 nm）或由它們作為基本單元構成的材料，且只有通過細胞壁和細胞膜才能被細胞吸收，從而對植株生長發育產生一定影響。劉婭等在小麥中發現，納米TiO₂的施用有效緩解了Cd對小麥帶來的氧化脅迫，顯著提高了小麥生物量、根長等。梁鵬鵬在紫甘藍中發現，納米Ti02對紫甘藍光合作用和葉綠素含量具有明顯的濃度效應。鄭澤其等研究表明，納米TiO₂有望應用于強化植物修復土壤Cd污染。張萍研究表明，納米TiO₂溶膠不僅對多種植物病害具有明顯的防治作用，同時可促進植株生長發育。此外有研究表明，納米TiO₂能夠增強玉米幼苗的抗氧化酶活性。然而納米TiO₂的研究大部分集中在蔬菜和其他作物上，而在木本植物特別是蘋果砧木上是否具有相似的生理響應尚不清楚。

我們以一年生蘋果砧木山定子為試驗材料，研究和分析不同濃度納米TiO₂對連作脅迫蘋果砧木山定子的影響，旨在探討外源TiO₂對重茬環境中山定子幼苗生理特性的響應，以期為蘋果砧木生產實踐提供一定的理論指導。

1材料與方法

1.1材料與處理

試驗選擇長勢一致、生長健壯的一年生蘋果砧木山定子，2021年5月中下旬將苗木定植于大小相同、裝有1962年國光蘋果園重茬土塑料花盆內（11.2 cm×16.8 cm），每盆1株，并置于甘肅農業大學避雨棚（360°10′N、103°34′E）進行統一管理，定期澆水、除草。

試驗共設5個處理，分別為重茬土壤不加TiO₂（CK）、重茬土壤+0.5 g/kg TiO₂（T1）、重茬土壤+ 1.0

g/kg TiO₂（T2）、重茬土壤+2.0 g/kg TiO₂（T3）、重茬土壤+4.0 g/kg TiO₂（T4），每處理3個重復，每個重復3盆。其中，納米TiO₂以拌入土壤的方式進行施用，每盆土壤質量為5.0 kg，按所設濃度拌人相應質量的納米TiO₂。2021年7月初，自施用納米TiO₂次日開始計算時間，于第0、10、20、30 d時選取生長一致的中上部相同節位葉片保存于超低溫冰箱，進行各項指標測定與分析。

1.2生理指標的測定

1.2.1光合色素含量[葉綠素a（Chl a）、葉綠素b（Chl b）]的測定參考綜旭林等的測定方法。采集葉片，用蒸餾水洗凈其表面，剪碎，倒入80%丙酮，在黑暗條件下浸泡提取24 h，測定其663、646nm下的吸光度，代入公式計算Chl a、Chl b含量，兩者之和為Chl a+b，兩者之比為Chla/b，生物學重復3次。

1.2.2抗氧化酶[超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）]活性的測定參考買合木提·卡熱等的方法，生物學重復3次。

1.2.3相對電導率和脯氨酸的測定 相對電導率（REC）采用電導率儀型號（DDS-307）進行測定；脯氨酸（Pro）含量參照Guo R等測定方法，生物學重復3次。

1.2.4丙二醛（MDA）含量測定 參考趙世杰等的測定方法，生物學重復3次。

1.3數據處理與分析

用Microsoft Office Excel 2019及Origin 2018進行數據處理及作圖，用IBM SPSS Statistics 26進行相關性、主成分分析，分析采用單因素ANOVA的LSD法比較差異的顯著水平（a=0.05）。

2結果與分析

2.1納米Ti02對重茬條件下山定子葉片光合色素含量的影響

從圖1-A可以看出，隨脅迫時間延長，除處理T3至20 d外，各處理Chl a含量呈下降趨勢。處理至10 d時，各處理的Chl a含量差異均不顯著，但處理組Chl a含量均高于CK。處理至20 d，各TiO₂處理下的Chl a含量均高于CK，分別為28.24 mg/g（Tl）、29.02 mg/g（T2）、29.55 mg/g（T3）、26.44 mg/g （T4），其中處理T2、處理T3均顯著高于CK，分別為CK（25.36 mg/g）的1.14、1.17倍。處理至30 d時，處理T2、處理T3的Chl a含量均顯著高于CK，而處理T1、處理T4均與CK差異不顯著。

由圖1-B可知，各處理的Chlb含量變化趨勢與Chla大體相同，脅迫期間Chlb含量隨時間延長均呈下降趨勢。除處理T4在30d外，其余處理在各時間段的Chlb含量降幅均小于CK，且具有明顯濃度效應。處理至30d時，各處理的Chlb含量均達到最低值，除處理T4低于CK外，其余TiO₂處理均高于CK，且處理T2、處理T3的Chlb含量均顯著高于CK，但降幅以處理T3最小，為10.17%。

圖1-C表明，各處理的Chl a+b含量變化趨勢與Chl a、Chl b含量趨勢變化一致。Chl a+b含量隨脅迫時間的延長不斷下降，處理至10、20、30d時，均隨TiO₂濃度增加，整體均呈先升后降的趨勢，且均以處理T3的Chl a+b含量最高，處理T2、處理T3的Chl a+b含量亦顯著高于CK。

從圖1-D可以看出，在重茬脅迫下，山定子葉片的Chl a／b變化幅度小。施加TiO₂后，隨脅迫時間的延長，各處理Chl a/b變化規律不盡相同。Chl a/b在處理至10、20、30 d時，均以處理T4最高，分別為2.00、1.95、2.19，除在處理20d時與CK差異顯著，其余處理均與CK差異不顯著。

2.2納米TiO₂對重茬條件下山定子葉片抗氧化酶活性的影響

從圖2-A可以看出，隨處理時間的延長，處理Tl、T2、T3、T4山定子幼苗葉片SOD活性呈先升后降的趨勢。處理20 d時，各處理均達到峰值后不斷降低，但不同處理各時間段對SOD活性的升幅不同。處理至20 d時，處理T3的SOD活性最高（131.97 U/g），且顯著高于CK（85.70 U/g），是CK的1.54倍，其余處理也均顯著高于CK。

圖2-B表明，重茬條件下，隨脅迫時間的延長，各處理下山定子葉片的POD活性和SOD活性的變化大致趨勢相同。試驗處理10 d時，處理T2、T3、T4的POD活性均顯著高于CK。處理至20 d時，處理T3的POD酶活性達到峰值，為77.65 U/g，顯著高于CK（44.06 U/g），為CK的1.76倍。處理至30 d時，處理T1、T2、T3、T4的POD活性均下降，但各處理POD活性仍高于CK，分別為CK的1.48、1.88、2.17、1.87倍。

由圖2-C可知，重茬條件下，隨TiO₂處理時間的延長，各處理的CAT活性整體呈先升后降的趨勢。試驗處理至10d時，處理T4的CAT活性達到峰值，為4.872 U/（g.min），試驗處理至20 d時，處理T1、T2、T3的CAT活性均達到最大，分別為5.265、5.848、6.621

U/（g·min）。處理至30 d時，處理T1、T2、T3的CAT活性均顯著高于CK，其中處理T3[5.973 U/（g·min）]增加幅度最大，為CK[4.163 U/（g·min）]的1.43倍。

2.3納米TiO₂對重茬條件下山定子葉片REC和Pro含量的影響

由圖3-A可知，隨著處理時間的延長，各處理的REC均呈升高趨勢，但升幅不同。0d時，處理T1、T2、T3、T4與CK的REC無顯著差異；處理至10d時，處理T1、T2、T3、T4處理葉片REC升幅均低于CK （9.88%），分別為7.81%、6.72%、2.87%、5.90%；處理至30 d時，處理T1、T2、T3、T4葉片REC均顯著低于CK，與Od相比，處理T1、T2、T3、T4的REC分別提高了28.88%、25.77%、10.36%、20.39%，整體來看，處理T3葉片REC的增幅最小。

圖3-B表明，隨處理時間的延長，各處理葉片Pro含量整體大致呈先升后降的趨勢。脅迫至10 d時，各處理的Pro含量出現明顯的增加，隨Ti02濃度的增加，Pro含量整體上呈先升后降的趨勢；脅迫至20 d時，處理T1積累量最小，為32.41 mg/g;處理T2積累量最大，為35.27 mg/g。但與CK（24.37 mg/g）相比，處理T1的Pro含量提高了32.99%，處理T2的Pro含量提高了44.71%。

2.4納米TiO₂對重茬條件下山定子葉片MDA含量的影響

圖4表明，重茬條件下山定子葉片MDA含量隨處理時間的延長呈先上升后下降趨勢，隨著Ti02施用濃度的變化，MDA含量變幅有所不同。處理至30 d時，處理Tl、T2、T3、T4的葉片MDA含量與CK相比，以處理Tl變化幅度最小，MDA含量與CK差異不顯著。

2.5重茬條件下不同濃度納米TiO₂對山定子生理效應的綜合評價分析

2.5.1相關性分析 使用SPSS軟件對重茬脅迫后的10個指標進行相關性分析，獲得相關系數矩陣（表1）。結果表明，砧木山定子葉片的Chl a與Chl b、POD、Pro呈顯著正相關（P<0.05），與Chla+b、SOD呈極顯著正相關（P<0.01），與Chl a/b、CAT、REC、MDA呈負相關，表明可以通過上述指標等來評價納米Ti02對重茬脅迫下山定子的改善作用。

2.5.2主成分分析 為綜合評價重茬條件下不同濃度納米TiO₂對山定子的生理效應特性研究，將納米TiO₂處理后的10個指標（Chl a、Chl b、Chl a+b、Chl a/b、SOD、POD、CAT、REC、Pro、MDA）進行主成分分析，提取到2個特征值大于1的主成分，其特征值分別為9.43，2.01（表2）。第一、二主成分方差貢獻率分別為83.18%、10.05%，累計方差貢獻率達到93.23%，符合分析要求。

綜合得分（F）是每個主成分得分與相對應方差貢獻率的乘積之和，即F=PC1×0.8318+PC2×0.1005。由表3可知，山定子在不同處理下綜合得分分別為-1.31（CK）、0.10（Tl）、0.37 （T2）、0.96（T3）、-0.12（ T4），因此，在重茬條件下山定子葉片在不同濃度納米Ti02處理下的綜合排名由高到低依次為處理T3、處理T2、處理T1、處理T4、CK。

3討論與結論

光合作用是植物生長發育的基礎。葉綠素是進行光合作用主要色素，長時間的重茬脅迫會使葉綠素與葉綠體蛋白結合松弛，進而降低葉片的光合能力，使光合產物積累降低，最終導致生長量顯著下降。本研究在重茬條件下，隨時間延長，山定子葉片的葉綠素含量均呈下降趨勢，施加納米TiO₂后，山定子葉片的葉綠素含量呈不同程度的上升趨勢；當TiO₂濃度增加到4g/kg時，對其緩解作用并未繼續增強，這與于敬波等在水稻中的研究結論相似。進一步證實TiO₂在一定濃度下可以有效緩解植物遭受脅迫所受傷害。可能是由于納米材料的吸附到植物根系表面，阻塞細胞壁小孔，影響水分和營養物質的吸收與運輸，導致植株無法正常生長發育，甚至產生毒害。

研究表明，在正常環境下植物體內活性氧的產生與清除處于動態平衡，當植物遭受逆境脅迫時，這種動態平衡就會被打破，產生大量活性氧。非生物脅迫下，植物自身會啟動酶促和非酶促兩類保護系統來減輕或消除活性氧自由基的傷害。本研究中，隨著重茬脅迫時間的延長，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性呈下降的趨勢，這可能是重茬脅迫干擾了植物正常的生理功能，引起體內活性氧的積累，導致膜脂過氧化作用，破壞細胞膜系統，影響細胞內蛋白質物質的合成，從而使抗氧化酶活性下降。通過不同濃度納米TiO₂處理后，山定子葉片超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性均顯著高于重茬土壤+0.0 g/kgTiO₂，且具有明顯的濃度效應，這可能是外源TiO₂增強了植物抗氧化系統的防御能力，維持細胞膜系統的平衡，從而在一定程度上緩解了重茬脅迫引起的氧化損傷，這與李玲玲等在植物病原微生物中的研究結果一致。

植物老化或受到傷害時，易發生膜脂過氧化作用，丙二醛（MDA）含量和相對電導率（REC）是反映逆境脅迫對植物細胞膜脂過氧化傷害程度的重要參數。丙二醛（MDA）從膜上產生的位置釋放出來后，可以與蛋白質、核酸起反應修飾其特征。本研究中，重茬脅迫使得山定子葉片的丙二醛（MDA）含量增加，其生長受到抑制，施加一定濃度的納米TiO₂可有效降低膜脂過氧化，丙二醛（MDA）上升速率減緩，進而在一定程度上緩解了重茬脅迫對山定子葉片的毒害作用，維持幼苗的正常生長。相對電導率（REC）反映植物細胞膜穩定性，重茬脅迫可改變細胞膜的通透性。該實驗中，在脅迫條件下，山定子幼苗相對電導率一直呈上升趨勢，且增幅較大，可能是由于重茬障礙導致細胞膜受損，進而使得細胞內電解質外滲，施加TiO₂后山定子幼苗葉片的相對電導率（REC增幅減小，由此說明納米TiO₂可以緩解重茬脅迫下山定子葉片細胞膜透性的增大和膜脂過氧化程度的增加，改善脅迫造成的危害。這與Mustafa等在小麥中研究結果一致。

脯氨酸（Pro）在植物遭受脅迫時可在體內大量積累以保護細胞結構，同時，脯氨酸（Pro）還可以調節細胞滲透壓，穩定分子結構。本研究發現，重茬脅迫下施入納米TiO₂后山定子葉片的脯氨酸（Pro）含量明顯高于對照處理（重茬土壤+0.0g/kgTiO₂），這與Emamverdian等在矮竹中的研究結果分析一致。可能是由于施入TiO₂后，導致滲透調節物質積累，進而改善重茬脅迫。

植株重茬脅迫改善受多種因素影響，單個指標無法準確反映其改善機制，本研究中對重茬脅迫后的山定子葉片的各指標進行綜合評價。由相關性分析可得，山定子葉片的葉綠素a（Chl a）與葉綠素b（Chl b）、過氧化物酶（POD）、脯氨酸（Pro）呈顯著正相關（P<0.05），與葉綠素a+b（Chl a+b）、超氧化物歧化酶（SOD）呈極顯著正相關（P<0.01），說明葉綠素b（Chl b）含量、過氧化物酶（POD）活性、脯氨酸（Pro）含量降低是影響葉綠素a（Chl a）含量降低的原因。由此可見，TiO₂可以通過調節抗氧化酶活性和滲透物質含量，從而清除活性氧，以維持抗氧化酶系統的穩定性，降低脅迫下膜透性損害，維護細胞膜的結構和功能，且具有一定的濃度效應，其中，以重茬土壤添加2.0 g/kg的TiO₂的緩解作用效果最佳。

將重茬脅迫處理后相關的10個指標[葉綠素a（Chl a）、葉綠素b（Chl b）、葉綠素a+b（Chla+b）、Chl a/b、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、相對電導率（REC）、脯氨酸（Pro）、丙二醛（MDA）]進行主成分分析，提取特征值大于1的2個主成分，其特征值分別為9.43、2.01；第一、二主成分方差貢獻率依次為83.18%，10.05%，累積方差貢獻率達到93.23%，符合分析要求。主成分分析結果表明，TiO₂對山定子重茬脅迫緩解能力高到低依次為重茬土壤中添加2.0 g/kg TiO₂、重茬土壤中添加1.0 g/kg TiO₂、重茬土壤中添加0.5g/kg TiO₂、重茬土壤中添加4.0g/kg TiO₂、重茬土壤+0.0 g/kg TiO₂。由此可知，在重茬土壤中添加2.0 g/kg TiO₂，可通過改善重茬脅迫下山定子的光合能力、ROS清除機制、穩定細胞膜結構來減緩重茬障礙對蘋果幼苗的危害。