制備活性干酵母的工藝研究

張玲玲 宋璐 韓冉 劉勝斌 孟夢 侯麗華

摘要：活性干酵母因其保存和運輸方便、發酵進程激活快、乙醇生成速率高等優點逐漸在工業中被推廣。實驗室前期篩選出了優秀的釀酒酵母，但缺少活性干酵母制備工藝的研究與優化，該研究在前期研究的基礎上，將篩選出的優良釀酒酵母進行活性干酵母制備條件的優化。結果表明，釀酒酵母菌株H1制備活性干酵母的最佳工藝是離心速度4 500 r/min、離心時間10 min、添加10%乳糖作為保護劑進行冷凍干燥。將干酵母的菌體用水稀釋25倍，在水溫45 ℃、葡萄糖濃度為5%的條件下復水活化30 min，與鮮酵母同時接入發酵培養基中進行發酵試驗，發酵結束后，干酵母和鮮酵母試驗組原料（還原糖）剩余量分別為0.93，0.82 g/dL，產物（乙醇）生成量分別為9.60，9.72 g/dL，可知干酵母依舊保持良好的發酵性能。該研究以期為小批量簡便制備活性干酵母提供理論依據和技術方法。

關鍵詞：活性干酵母；離心條件；冷凍干燥保護劑；復水活化條件；發酵性能

中圖分類號：TS201.3????? 文獻標志碼：A???? 文章編號：1000-9973（2023）08-0121-04

Study on the Preparation Process of Active Dry Yeast

ZHANG Ling-ling1，2， SONG Lu1，2， HAN Ran1，2， LIU Sheng-bin1，2， MENG Meng1，2， HOU Li-hua1，2*

（1.College of Food Science and Engineering， Tianjin University of Science & Technology， Tianjin 300457，

China； 2.Key Laboratory of Food Quality and Health in Tianjin， Tianjin 300457， China）

Abstract：Active dry yeast is gradually promoted in industry due to its convenient storage and transportation， fast activation of fermentation process and high ethanol production rate. In the laboratory， excellent Saccharomyces cerevisiae is screened out in the early stage， but there is a lack of research and optimization of the preparation process of active dry yeast. Based on the previous research， in this study， the preparation conditions of active dry yeast for the screened excellent Saccharomyces cerevisiae are optimized. The results show that the best process of preparing active dry yeast by Saccharomyces cerevisiae strain H1 is centrifugation speed of 4 500 r/min， centrifugation time of 10 min， and addition of 10% lactose as the protectant for freeze-drying. Dilute the dry yeast cells 25 times with water， and activate them by rehydrating under the conditions of 45 ℃ water temperature and 5% glucose concentration for 30 min. Add it into the fermentation medium with fresh yeast simultaneously for fermentation test. After fermentation， the remaining amount of raw material （reducing sugar） in the dry yeast and fresh yeast test groups is 0.93， 0.82 g/dL respectively， and the production amount of product （ethanol） is 9.60， 9.72 g/dL respectively. It can be seen that dry yeast still maintains good fermentation performance. The aim of this study is to provide a theoretical basis and technical method for the simple preparation of active dry yeast in small batches.

Key words： active dry yeast; centrifugal conditions; freeze-drying protectant; rehydration activation conditions; fermentation performance

收稿日期：2023-02-14

基金項目：天津市科技計劃項目（21ZYQCSY00050）資助

作者簡介：張玲玲（1990－），女，浙江嵊州人，工程師，碩士，研究方向：食品營養與化學。

通信作者：侯麗華（1974－），女，黑龍江哈爾濱人，教授，博士生導師，博士，研究方向：食品微生物、食品發酵。

活性干酵母是鮮酵母經干燥脫水處理，復水活化后仍具備較強發酵能力的干酵母制品[1]。其水分含量在4%～6%左右，保存形式一般是細條狀或小球狀顆粒。相比于鮮酵母，活性干酵母具有鮮明的優勢。第一，存儲物流方便：鮮酵母需要低溫保存[2]，且每隔一段時間需要活化并繁殖，恢復活性后需繼續低溫保存[3]。而活性干酵母粉水分含量低，酵母處于休眠狀態，可在常溫（25 ℃）下儲存24個月，期間不需做活化處理[4]，有效降低了保藏成本和運輸成本。第二，發酵進程激活快：鮮酵母需確定發酵能力才可使用，因此在使用前需要培養1～2 d，計算其活菌數后再投入使用[5]。而活性干酵母活化后便可使用，活化時間短則10～15 min，長則20～30 min，某些成熟的干酵母產品已投入商業使用[6]。第三，產物生成速率高：底物中的碳源作為其能源物質[7]，活性干酵母活化后酵母菌擴大培養與厭氧發酵同時進行，極大提高了底物的利用率，并提升了產物乙醇的生成速率。因此，活性干酵母的應用更利于現代工業的發展。

我國從20世紀70年代開始研究和生產活性干酵母，雖然時間不長，但是活性干酵母的研究已經取得了很大的進展[8]。活性干酵母的生產工藝日趨成熟，工藝流程見圖1，酵母在與培養基分離以及干燥的過程中，數量和活性均會有所損失，因此優化分離與干燥這兩個條件將是制備活性干酵母的關鍵，以期用溫和節能的方法獲得高活性的干酵母。酵母菌菌體細胞與培養液的分離普遍采用離心分離的方法，在離心過程中，不當的離心時間和速度會對酵母菌體產生不良影響。過高的速度和過長的時間會導致菌體損傷甚至死亡，過低的速度和過短的時間會造成離心不徹底，菌體大量損失。因此，需要找到最佳的離心參數。活性干酵母制備過程中的干燥方法有很多，如熱干燥法、滾筒干燥法、真空冷凍干燥法等[9-10]。其中真空冷凍干燥法[11]是將物料先冷凍成固體，然后在真空條件下對物料加熱，將冰升華為蒸氣使物料干燥的過程。與其他干燥方法相比，真空冷凍干燥能夠減少高溫對物料的影響，最大限度保持物料中的芳香物質及營養成分，制品的含水量也更少，同時低溫和真空的狀態能夠抑制微生物的生長，保護物料不被氧化。因此，本研究采取真空冷凍干燥法進行干燥條件的優化。

實驗室前期篩選出了優良的釀酒酵母，但是缺少對活性干酵母制備工藝的研究與優化，本研究在前期研究的基礎上，將篩選出的優良釀酒酵母進行活性干酵母的制備條件優化，之后將最佳制備條件下的干酵母進行復水活化條件的優化，研究復水條件并檢驗活性干酵母的活性，技術路線見圖2。本研究以期為小批量簡便制備活性干酵母提供理論依據和技術方法。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養基

菌種：天津科技大學誘變選育的編號為H1的優良釀酒酵母。

YPD培養基（yeast extract peptone dextrose，YPD）[12]：1%酵母膏、2%蛋白胨、1.5%瓊脂粉，115 ℃高溫滅菌20 min，添加5%的葡萄糖。

玉米培養基：玉米面經糖化后得到葡萄糖濃度為240 g/L的發酵培養基，添加0.05％的（NH4）2HPO4和0.05％的KH2PO4。

1.2 材料與試劑

玉米面：購于天津市濱海新區明耀超市；L-谷氨酸鈉、脫脂奶粉、麥芽糖、海藻糖（均為分析純）：Solarbio公司；乳糖（分析純）：天津市奧淇醫科醫藥銷售有限公司。

1.3 儀器與設備

微量離心機、冷凍大容量離心機 美瑞泰克科技（天津）有限公司；真空冷凍干燥機 Christ公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 活性干酵母生產工藝流程

活性干酵母生產工藝流程見圖1。

1.4.2 本研究技術路線

活性干酵母制備工藝見圖2。

1.4.3 計算方法

參照GB 4789.15－2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》[13]的方法進行酵母菌的計數。

冷凍干燥后酵母菌的存活率=（冷凍干燥后的活菌數/冷凍干燥前的活菌數）×100%。

離心收得率=（沉淀中活菌數/初始活菌數）×100%。

所有試驗均重復3次，所列的數據均是3次獨立試驗的平均值。

2 結果與討論

本研究以天津科技大學誘變選育的優秀釀酒酵母H1進行活性干酵母的制備試驗，優化活性干酵母制備過程中的離心條件并選擇合適的冷凍干燥保護劑，干酵母制備完成后優化復水活化條件，試驗結果如下。

2.1 離心條件

離心條件的篩選對菌體數量及活性起著關鍵的作用，是決定后續干酵母中活菌數量的重要環節，因此對離心速度和離心時間的優化至關重要。本研究從離心速度3 500 r/min開始，隔一段速度設置一個取樣點，離心時間從10 min開始，每增加5 min設置一個取樣點，條件設置及得到的酵母收得率見圖3。

不同的離心速度和離心時間獲得的酵母收得率差距較大，分布在38%～75%區間，由圖3可知，離心速度越快，離心時間越長，酵母的收得率并非越高，離心速度為4 500 r/min時的收得率比其他轉速的收得率普遍要高，而當離心速度為4 500 r/min、離心時間為10 min時，酵母收得率最高，為75%，即活性干酵母制備的最優離心條件。

2.2 冷凍干燥保護劑選擇

冷凍干燥保護劑是指可以保護細胞免受冷凍損傷、防止活性組分發生變性的物質。在細胞懸液中加入冷凍干燥保護劑可保護酵母在冷凍過程中不受冰晶對細胞的損害。作用原理：一方面，冷凍干燥保護劑與溶液中的游離水分子結合，發生水合作用，游離水分子減少，則溶液的黏性增加，溫度降低時冰晶生成量減少，水的結晶過程被弱化；另一方面，冷凍干燥保護劑增加了溶液濃度，維持了細胞內外的摩爾濃度，使細胞免受細胞質中電解質的傷害。因此，在冷凍干燥過程中選擇保護劑非常有必要。但是由于細胞結構不同，保護劑的選擇也不同，選擇合適的保護劑會有事半功倍的效果。

本研究選取市場上購買的8種不同的冷凍干燥保護劑添加在制備活性干酵母的中間過程，保護劑與菌懸液的比例為1∶3，得到的釀酒酵母存活率見圖4。

由圖4可知，不同的冷凍干燥保護劑對釀酒酵母的保護性能有很大差距，添加甘油保護劑的試驗組，釀酒酵母在冷凍干燥后存活率不到2%，大部分沒有存活，保護效果不佳；而添加脫脂奶粉和乳糖保護劑的試驗組，釀酒酵母在冷凍干燥后存活率分別達到22.10%和22.54%，是8種冷凍干燥保護劑中保護效果較好的。因此考慮這兩種保護劑，根據市場購入價格（見表1），乳糖比脫脂奶粉的單價低0.43元/g，與其他保護劑進行比較，乳糖單價最低，保護效果最好，因此本研究中最優冷凍干燥保護劑為乳糖。

2.3 復水活化條件

活性干酵母的含水量一般在4%～6%左右，與鮮酵母的含水量相差很多，干酵母在使用前需復水活化，才能激發其發酵活力，合適的復水活化條件可在最節省能源的條件下最大力度激發酵母的活性，且復水活化是活性干酵母使用的必經流程，因此活化條件的優化至關重要。據研究，活性干酵母復水后活性的好壞受活化用水稀釋數、活化溫度、活化葡萄糖濃度和活化時間的影響，因此，對上述4個因素對活性干酵母復水活化后的活性影響進行了正交試驗，正交試驗因素水平表見表2，正交試驗結果見表3。

通過極差分析可知，復水活化最關鍵的因素是活化溫度，其次是活化用水稀釋數、活化時間、活化葡萄糖濃度，各因素主次排序為B＞A＞D＞C，由結果可知最優的組合為A3B3C2D2，即活化用水稀釋倍數為25倍，活化溫度為45 ℃，活化葡萄糖濃度為5%，活化時間為30 min。

2.4 對比試驗

將編號為H1的釀酒酵母菌株在離心速度4 500 r/min、離心時間10 min得到的菌體，添加10%乳糖作為保護劑進行冷凍干燥制得活性干酵母。將活性干酵母進行復水活化，采用水稀釋25倍，水溫45 ℃，葡萄糖濃度5%，活化30 min，與鮮酵母同時接入發酵培養基中進行發酵試驗，結果見表4。

由表4可知，鮮酵母和干酵母在發酵結束后，原料（還原糖）剩余量分別為0.82，0.93 g/dL，產物（乙醇）生成量分別為9.72，9.60 g/dL，可知干酵母消耗還原糖的量以及生成乙醇的量與鮮酵母相差不大，可認為通過以上優化條件制得的活性干酵母依舊保持著良好的發酵性能，表明活性干酵母的制備條件優良。

3 結論

本研究對優良酵母發酵菌株（天津科技大學誘變選育編號為H1）進行了活性干酵母的制備工藝條件的探討和優化，結果表明，H1釀酒酵母菌株的活性干酵母最優制備條件為離心速度4 500 r/min、離心時間10 min、添加10%乳糖作為冷凍干燥保護劑進行冷凍干燥。將制得的活性干酵母用水稀釋25倍，水溫控制在45 ℃，葡萄糖濃度為5%，活化30 min，與鮮酵母同時接入發酵培養基中進行發酵試驗，發酵結束后，原料（還原糖）剩余量分別為0.93，0.82 g/dL，產物（乙醇）生成量分別為9.60，9.72 g/dL，可知干酵母消耗還原糖的量以及生成乙醇的量與鮮酵母相差不大，表明干酵母依舊保持著良好的發酵性能，本研究為進一步促進活性干酵母在乙醇工業化生產中的應用提供了參考。

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