青稞HvnWRKY26基因的克隆及表達分析

姚曉華,王 越,姚有華,景 剛,安立昆,白羿雄,吳昆侖

(1.青海大學,青海西寧 810016; 2.青海省農林科學院/青藏高原種質資源研究與利用實驗室/青海省青稞遺傳育種重點實驗室/國家麥類改良中心青海青稞分中心,青海西寧 810016)

青稞(HordeumvulgareL. var.nudumHook. f.)屬于禾本科大麥屬作物,是栽培大麥的一個變種,因其成熟時籽粒的內外稃與穎果分離,籽粒裸露,故又稱為裸大麥[1]。青稞遺傳背景與大麥高度相似,主要分布在海拔4 000 m左右的青藏高原地區,是青藏高原藏族同胞們的主要口糧[2]。條紋病作為青稞生產上的重要病害,嚴重影響青稞的產量和品質[3]。目前發現的與青稞條紋病相關的基因較少。研究發現,過表達Rdg1a和Rdg2a基因均能夠顯著提高大麥對條紋病的抗性[4-7]。本課題組前期通過轉錄組測序,也發現3個與青稞條紋病相關的基因AGO1[2]、MEL1AGO[8]和RGA[9]。

WRKY是植物中最重要的轉錄因子之一,主要參與植物生物和非生物脅迫響應過程[10]。植物在受到病原菌攻擊時,可以通過增強植物的抗性抵抗病原菌的侵染[11]。Abbruscato等[12]研究發現,敲除WRKY22基因后,水稻對稻瘟病的抗性水平降低;而在水稻中過表達WRKY22基因則可以提高轉基因株系對稻瘟病的抗性。Chen等[13]研究發現,在煙草中過表達小麥抗旱相關基因TaWRKY10能夠顯著提高煙草的耐旱性和耐鹽性。此外,WRKY轉錄因子還參與植物激素信號和MAPK(mitogen-activated protein kinase)信號轉導[14],如擬南芥AtMPK3/6能夠通過磷酸化激活AtWRKY33轉錄因子的轉錄活性,誘導植保素的生物合成,從而抵抗灰霉菌(Botrytiscinerea)的侵染[15]。然而,WRKY基因對青稞條紋病的響應尚未見報道。

本課題組前期通過分析不同抗性青稞品種感染條紋病后的轉錄組測序結果,發現一個差異表達的WRKY基因家族成員。在此基礎上,本研究對該基因進行了克隆,命名為HvnWRKY26。并對該基因編碼蛋白的理化性質、系統進化以及抗條紋病脅迫時的表達模式進行分析,以期為進一步研究青稞HvnWRKY26基因的抗條紋病功能和抗病機理奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為抗病青稞品種昆侖14號和感病青稞品種Z1141,均由青海大學農林科學院作物栽培與育種所青稞研究室繁育保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA的合成

用植物RNA提取試劑盒(TaKaRa,北京)提取昆侖14號和Z1141的葉片總RNA。參考姚曉華等[8]的方法檢測RNA的濃度和純度。用Prime-Script lst Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(TaKaRa,北京)將RNA反轉錄為cDNA,-80 ℃存儲。

1.2.2 青稞HvnWRKY26基因的克隆

本課題組前期用條紋病菌侵染青稞抗病品種昆侖14號和感病品種Z1141,然后對正常葉片和感病葉片進行轉錄組測序(由諾禾致源科技股份有限公司進行),結果發現一個差異表達的基因(基因ID:HORVU1Hr1G090190),并命名為HvnWRKY26。利用Primer 6.0設計該基因CDS區的擴增引物HvnWRKY26-F/R(表1)。以青稞葉片總RNA反轉錄獲得的cDNA為模板,利用THUNDERBIRD SYBR qRCR Mix(TOYOBO,上海)進行PCR擴增。PCR擴增體系、反應程序以及瓊脂糖凝膠電泳檢測均參考姚曉華等[2]的方法。使用膠回收試劑盒(生物工程,上海)回收目的條帶,將目的片段連接到pEasy-Blunt載體(全式金,北京)上,并轉化大腸桿菌Trans-T1感受態細胞,挑取白斑單菌落進行陽性鑒定,挑選3個陽性克隆送至上海生物工程股份有限公司進行測序。

表1 本研究用到的引物信息

1.2.3 青稞HvnWRKY26基因的生物信息學分析

利用Uniprot(https://www.uniprot.org/)對HvnWRKY26基因進行注釋;利用ExPASY(https://web.expasy.org/compute_pi/)預測HvnWRKY26蛋白的理化性質。利用SignalP 4.1 (http://www.Detaibio.com/tools/signal-peptide.html)和TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMIHMM2.0/)預測HvnWRKY26蛋白的信號肽和跨膜結構。利用SPOMA( https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL(https://swiss-model.expasy.org/)預測HvnWRKY26蛋白的二級結構和三級結構。利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi?NORMAL=1)預測HvnWRKY26蛋白的保守結構域。將HvnWRKY26基因序列輸入到植物基因組數據庫Gramene(http://www.gramene.org/)中,從大麥參考基因組(ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/release-63/plants/fasta/hordeum_vulgare/dna)中獲取HvnWRKY26基因的啟動子區域序列,用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析HvnWRKY26基因啟動子區域的順式作用元件。通過NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查詢大麥(Hordeumvulgare)、野生二粒小麥(Triticumdicoccoides)、山羊草(Aegilopstauschii)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、黍(Panicumhallii)、粟(Setariaitalica)和狗尾草(Setariaviridis)中與青稞HvnWRKY26同源的WRKY蛋白,利用DNAMAN 6.0軟件進行多序列比對。

從大麥參考基因組中獲得與HvnWRKY26基因親緣關系較近的5個WRKY基因家族成員;從水稻參考基因組中獲得與HvnWRKY26基因親緣關系較近的11個WRKY基因家族成員;從玉米參考基因組中獲得與HvnWRKY26基因親緣關系較近的17個WRKY基因家族成員。利用MEGA 7和ITOL(https://itol.embl.de/itol.cgi)構建上述基因編碼蛋白的系統進化樹。通過在線軟件STRING 9.0 (http://string.embl.de/),以擬南芥、水稻和玉米的WRKY26蛋白為基礎,進行蛋白互作網絡分析。

1.2.4 青稞HvnWRKY26基因的表達模式分析

用Primer 6.0設計HvnWRKY26基因的qRT-PCR引物HvnWRKY26-SF/SR(表1)。以青稞抗病品種昆侖14號和感病品種Z1141感染條紋病后的正常葉片和感病葉片的cDNA(500 ng·μL-1)為模板,以TC139057為內參基因(表1)[16]。用TB Green○RPremix Ex TaqTM(TaKaRa,北京)進行qRT-PCR擴增。PCR反應程序、反應體系均參考楊 雪等[9]的方法。用2-ΔΔCT法[17]計算HvnWRKY26基因的相對表達量,每個樣品設3次生物學重復。利用SPSS進行顯著性檢測。

2 結果與分析

2.1 青稞HvnWRKY26基因的克隆及其編碼蛋白的理化性質

以昆侖14號和Z1141的葉片總RNA反轉錄得到的cDNA為模板,以HvnWRKY26-F/R為引物,擴增到一條長度約1 000 bp的目的條帶(圖1a)。測序后分析發現,其完整開放閱讀框為765 bp,可編碼255個氨基酸,且昆侖14號和Z1141的堿基序列和氨基酸序列一致性均為100%。利用SMART對氨基酸序列進行保守結構域預測,發現該基因編碼的蛋白具有典型的WRKY結構域(94～156 aa),屬于WRKY基因家族(圖1b)。

a:HvnWRKY26基因的PCR結果,M:DL2000;1:昆侖14號;2:Z1141。b:HvnWRKY26蛋白的保守結構域預測。c:HvnWRKY26蛋白的二級結構預測,藍色:α-螺旋;紅色:延伸鏈;綠色:β-轉角;橙色:無規則卷曲。d:HvnWRKY26蛋白的三級結構預測。

理化性質分析表明,該基因編碼的蛋白分子式為C1159H1783N345O359S12,分子量為26.68 KDa,不穩定指數為41.29,脂溶指數為64.41,理論等電點為5.62,其中負電荷殘基(Asp+Glu)25個,正電荷殘基(Arg+Lys)19個,平均疏水性指數(GRAVY)為-0.333。說明該蛋白是一個親水性的不穩定酸性蛋白。跨膜結構和信號肽分析表明,該蛋白不存在跨膜結構,且無信號肽。

二級結構預測表明,該蛋白含有48.03%的無規則卷曲,35.83%的α-螺旋,9.84%的延伸鏈,以及6.30%的β-轉角(圖1c),推測α-螺旋和無規則卷曲這兩個結構在蛋白行使功能時發揮重要作用。三級結構預測結果與二級結構預測結果基本一致(圖1d)。Uniprot基因注釋結果表明,該蛋白為WRKY26,被定位在細胞核內,因此將該基因命名為HvnWRKY26。

2.2 HvnWRKY26基因的順式作用元件

分析結果(表2)表明,HvnWRKY26基因啟動子區域含有豐富的順式作用元件,包括脫落酸響應元件(ABRE)、茉莉酸響應元件(CGTCA-motif和TGACG-motif)、干旱誘導響應元件(MBS)以及其他與逆境脅迫相關的順式作用元件。此外還包括與赤霉素響應、生長素響應、光響應等相關的順式作用元件。

表2 青稞HvnWRKY26基因啟動子區域的順式作用元件

2.3 HvnWRKY26蛋白的同源比較及系統進化分析

采用DNAMAN 6.0進行氨基酸序列比對,結果發現,青稞HvnWRKY26蛋白與大麥WRKY26、野生二粒小麥WKRY24、山羊草WKRY55、二穗短柄草WKRY41、黍WKRY30、粟WKRY53和狗尾草WRKY30的蛋白氨基酸序列一致性分別為81.10%、80.23%、82.17%、37.35%、33.33%、29.77%和27.42%。這些蛋白均具有高度保守的WRKY結構域,青稞HvnWRKY26蛋白的WRKY結構域序列與上述物種的一致性分別為100%、96.83%、95.24%、87.30%、87.30%、87.30%和87.30%(圖2)。系統進化分析表明,青稞HvnWRKY26與大麥WRKY26的親緣關系最近,與黍WKRY30、粟WKRY53和狗尾草WRKY30的親緣關系較遠(圖3a)。進一步構建HvnWRKY26及其在大麥、水稻和玉米參考基因組中親緣關系較近的WRKY蛋白的進化樹,結果發現,這些蛋白被分為A、B、C三類。其中,HvnWRKY26與3個大麥成員、3個水稻成員和6個玉米成員聚為A類,說明這些蛋白的功能在進化上相對保守。

Hvn:青稞;Hv:大麥;At:山羊草;Td:野生二粒小麥;Bd:二穗短柄草;Ph:黍;Si:粟;Sv:狗尾草。圖3同。紅線表示WRKY結構域,黑線表示CX7CX23HXC鋅指基序,藍線表示WRKYGQK基序。

a:HvnWRKY26與其他七種禾本科植物WRKY蛋白的進化樹分析。b:HvnWRKY26及其與親緣關系較近的大麥、水稻和玉米WRKY蛋白的進化樹分析,Os:水稻;Zm:玉米。

2.4 HvnWRKY26基因對青稞條紋病的響應

RNA-seq和qRT-PCR分析結果表明,與正常葉片相比,昆侖14號的感病葉片中HvnWRKY26基因的表達量分別提高15.58和59.69倍;Z1141的感病葉片中HvnWRKY26的基因表達量分別提高4.52和0.92倍,且該基因在昆侖14號感病葉片中的表達量極顯著高于Z1141感病葉片(圖4)。

KL14N:昆侖14號正常葉片;KL14S:昆侖14號感病葉片;ZN:Z1141正常葉片;ZS:Z1141感病葉片。相同分析方法圖柱上不同大寫字母表示樣品間差異極顯著(P<0.01)。

3 討論

前人研究表明,WRKY轉錄因子參與調控植物的生長發育、衰老、抗逆性等過程[18]。本研究克隆到的HvnWRKY26基因具有典型的WRKY結構域,包含WRKYGQK基序(100～106 aa)和CX7CX23HXC鋅指基序(120～154 aa),屬于WRKY轉錄因子[19],是WRKY基因家族中的第三類亞家族[20]。HvnWRKY26與禾本科其他植物WRKY蛋白的氨基酸序列一致性不高,但WRKY結構域的序列一致性較高,推測WRKY結構域在調控功能基因的表達中起重要作用,但其是否在青稞抗條紋病中發揮作用有待進一步研究。

順式作用元件是基因轉錄調控的重要分子開關[21]。在番茄中,LeWRKY1基因啟動子區域具有茉莉酸響應元件,外源激素茉莉酸可誘導LeWRKY1基因的表達,并通過茉莉酸依賴的信號途徑參與番茄對灰霉菌的防御響應過程[22]。本研究發現,HvnWRKY26基因啟動子區域也具有多種響應生物和非生物脅迫相關的元件,如脫落酸響應元件(ABRE)、光響應元件(ACE、ATCT-motif、Box 4等)、茉莉酸甲酯響應元件(CGTCA-motif和TGACG-motif)、防御應激反應元件(TC-rich repeats)等。Germain等[23]研究表明,白云杉防御素PgD1基因含有TC-rich repeats元件,過表達PgD1基因能能夠顯著提高白云杉對樹脂假單胞菌的抗性。因此,推測HvnWRKY26基因啟動子區域的TC-rich repeats元件可能在青稞抗條紋病過程中也發揮重要作用。

系統進化分析表明,青稞HvnWRKY26基因與12個WRKY基因家族成員(大麥3個,水稻3個,玉米6個)聚為一支,且都包含WRKYGQK基序。其中,大麥中的HORVU3Hr1G059220和水稻中的LOC_Os11g45850在Swiss-Prot中均被注釋為WRKY53。Chujo等[24]研究表明,在水稻中過表達OsWRKY53,可誘導防御相關基因(包括抗病相關蛋白基因)上調表達,使水稻對稻瘟病的抗性增強。推測條紋病菌侵染青稞后HvnWRKY26基因與稻瘟病菌侵染水稻后OsWRKY53基因的抗病機制相似,但仍需進一步驗證。

研究表明,許多WRKY基因與植物的抗病性有關,在植物對病原菌的抵抗中起著關鍵作用。在水稻中,OsWRKY24基因在稻瘟病侵染后上調表達[25];在小麥中,WRKY45的過表達增強了植株對白粉病和條銹病的抗性[26];在擬南芥中,AtWRKY33的過表達增強了對壞死真菌引起的灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)和鏈格孢菌(Alternariabrassicicola)的抗性[27],AtWRKY45或AtWRKY1的過表達均可增強植株的抗病和耐旱能力[28-29]。本研究結果表明,青稞抗病品種昆侖14號和感病品種Z1141在條紋病侵染后HvnWRKY26基因顯著上調表達,且抗病品種的表達量顯著高于感病品種,該結果與上述研究結果類似,推測具有類似的抗病機制。該研究結果為進一步研究青稞HvnWRKY26基因的抗病功能奠定基礎。