107個(gè)山東小麥品種抗條銹性評(píng)價(jià)及分子標(biāo)記檢測(cè)

鄭良梅,楊 慧,徐曉偉,童朝陽,藺瑞明,馮 晶,姚 強(qiáng),王鳳濤

(1.青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院,青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青海西寧 810016; 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193; 3.山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院農(nóng)業(yè)科技學(xué)院,山東濟(jì)南 250100;4.國家植物保護(hù)甘谷觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站,甘肅甘谷 741000)

條銹病是小麥生產(chǎn)上主要?dú)鈧鞑『χ弧Ｔ谥袊?小麥條銹病發(fā)生具有明確的越夏區(qū)、冬繁區(qū)和春季流行區(qū),是世界上最大且相對(duì)獨(dú)立的條銹病流行區(qū)[1]。山東省是中國小麥高產(chǎn)區(qū)和優(yōu)勢(shì)主產(chǎn)區(qū),位于條銹病的春季流行區(qū)。2017年山東省小麥條銹病發(fā)生面積約144.8萬hm2,占全部小麥種植面積的54.69%[2],2020年再次大面積爆發(fā)[3]。

選育和種植抗條銹病品種是防控小麥條銹病最經(jīng)濟(jì)、有效和環(huán)保的措施。然而,山東小麥品種對(duì)條銹病的抗性水平未知,在條銹病發(fā)生時(shí)只能對(duì)所有品種無差別地采用應(yīng)急防控措施,耗費(fèi)巨大的人力、物力和財(cái)力。此外,由于小麥條銹菌毒性小種的頻繁變異,導(dǎo)致推廣的抗病品種不斷“喪失”抗病性[4]。因此,亟需實(shí)現(xiàn)抗病小麥育種與毒性小種監(jiān)測(cè)同步進(jìn)行,提高抗病育種的前瞻性,充分發(fā)揮抗病品種在條銹病防控中的作用[5]。

本研究選用107個(gè)山東省小麥品種進(jìn)行室內(nèi)苗期抗性鑒定和田間成株期抗性鑒定,并結(jié)合8個(gè)抗條銹病基因(Yr5、Yr9、Yr10、Yr15、Yr18、Yr26、Yr36和Yr62)的分子標(biāo)記檢測(cè)供試材料中所攜帶的抗性基因,以期明確山東小麥品種對(duì)條銹菌的的抗性水平以及已知抗條銹病基因在山東小麥品種中的分布情況,為山東小麥條銹病的防控及未來抗病育種提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為107個(gè)不同年份審定的山東小麥品種,抗條銹病鑒定所用感病對(duì)照品種為銘賢169。用于分子標(biāo)記檢測(cè)的抗病近等基因系包括Avocet S*6/Yr5、Avocet S*6/Yr9、Avocet S*6/Yr10、Avocet S*6/Yr15、Avocet S*6/Yr24及Jupiteco R(Yr18)、RIL 65(Yr36)、PI 192252(Yr62),以Avocet S和銘賢169為陰性對(duì)照。苗期室內(nèi)接種所用條銹菌混合菌株包括生理小種CYR32、CYR33和CYR34;成株期田間接種所用條銹菌混合菌株包括生理小種CYR32、CYR33、CYR34、G22-14以及Hybrid 46類群和水源11類群。所有材料均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。

1.2 小麥條銹病抗性鑒定

1.2.1 苗期抗性鑒定

苗期抗性鑒定在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所溫室內(nèi)進(jìn)行。每個(gè)品種選取10粒種子,播種于直徑為8 cm的花盆中,每盆播種4個(gè)品種,于育苗間培養(yǎng),以銘賢169為感病對(duì)照品種。待小麥長至兩葉期時(shí),參照龐云星等[6]的方法,利用電子氟化液(NovecTM7100)將CYR32、CYR33和CYR34的新鮮條銹菌夏孢子制備成4 mg·mL-1的孢子懸浮液,利用噴霧裝置將孢子懸浮液混合后均勻噴灑在小麥葉片上,將接種植株置于相對(duì)濕度大于95%、溫度為10 ℃的黑暗接種間內(nèi)保濕24 h后,轉(zhuǎn)到人工氣候室(晝15～18 ℃/夜11～14 ℃,光照時(shí)間12～14 h·d-1,光強(qiáng)5 000～6 000 lx)內(nèi)潛育發(fā)病。待感病對(duì)照銘賢169充分發(fā)病后,依據(jù)農(nóng)業(yè)部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T 2953-2016)《小麥區(qū)域試驗(yàn)品種抗條銹病鑒定技術(shù)規(guī)程》的0～4級(jí)標(biāo)準(zhǔn)記載侵染型,其中0～2級(jí)為抗病類型(R),3～4級(jí)為感病類型(S)。

1.2.2 成株期抗性鑒定

將107個(gè)供試小麥品種于2019年在甘肅天水、四川成都分別設(shè)置人工接種鑒定圃,人工接種生理小種CYR32、CYR33、CYR34和G22-14以及Hybrid 46類群和水源11類群的混合菌株;同時(shí)在湖北荊州設(shè)置自然發(fā)病鑒定圃。鑒定圃種植方法均采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),行長1.5 m,行距0.3 m,每行播種5個(gè)品種,每個(gè)品種播種8～10粒于20 cm間隔內(nèi)。感病對(duì)照銘賢169作為條銹病誘發(fā)行分別播種于每行兩側(cè)。待銘賢169充分發(fā)病且嚴(yán)重度達(dá)80%以上時(shí),每個(gè)品種隨機(jī)選取6～8株,調(diào)查供試品種的侵染型和嚴(yán)重度,每隔7 d調(diào)查一次,共調(diào)查3次。按照農(nóng)業(yè)部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T 2953-2016)記載侵染型和嚴(yán)重度,其中侵染型記載標(biāo)準(zhǔn)同1.2.1,嚴(yán)重度按照0%、1%、5%、10%、20%、40%、60%、80%、100%九級(jí)標(biāo)準(zhǔn)記載,并以最高侵染型和最大嚴(yán)重度作為最終抗病性結(jié)果。

1.3 抗病基因分子標(biāo)記檢測(cè)

采用改良的CTAB法提取小麥葉片基因組DNA[7],使用分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度,并用ddH2O將DNA原液濃度稀釋至100 ng·μL-1,于-20 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｓ每箺l銹病基因Yr5[8]、Yr9[9]、Yr10[10]、Yr15[11]、Yr18[12]、Yr26[13]、Yr36[14]和Yr62[15]的連鎖標(biāo)記進(jìn)行抗病基因檢測(cè),引物序列參照相應(yīng)文獻(xiàn),由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成(表1)。所有引物的PCR反應(yīng)體系為25 μL,包括DNA(100 ng·μL-1)2 μL,上、下游引物各1 μL,2× Taq Master Mix 12.5 μL,ddH2O 8.5 μL。各基因的PCR反應(yīng)程序按照相應(yīng)文獻(xiàn)進(jìn)行,Yr5、Yr9、Yr10、Yr15、Yr18、Yr26和Yr36基因的分子標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),Yr62基因的分子標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物用6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。

表1 小麥抗條銹病基因的特異性引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 供試小麥材料的抗條銹性鑒定結(jié)果

2.1.1 苗期抗性鑒定結(jié)果

用條銹菌生理小種CYR32、CYR33和CYR34的混合菌株對(duì)107個(gè)小麥品種進(jìn)行苗期抗性鑒定,結(jié)果(表2)表明,表現(xiàn)為高感的品種49個(gè),占比45.79%;表現(xiàn)為中感的品種51個(gè),占比47.66%;表現(xiàn)為中抗及以上水平的品種6個(gè),占比5.61%,其中鑫麥296、濟(jì)麥22和泰麥一號(hào)表現(xiàn)為高抗,洲元9369、汶農(nóng)6號(hào)、聊麥16和濟(jì)寧13號(hào)表現(xiàn)為中抗。

表2 107個(gè)品種的抗條銹病鑒定及抗病基因分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果

2.2.2 成株期抗性鑒定結(jié)果

用條銹菌生理小種CYR32、CYR33、CYR34和G22-14以及Hybrid 46類群和水源11類群的混合菌株對(duì)107個(gè)小麥品種進(jìn)行成株期抗性鑒定,結(jié)果(表2)顯示,在甘肅天水鑒定圃,表現(xiàn)為高抗、中抗、中感和高感的品種分別有14個(gè)(13.1%)、30個(gè)(28.0%)、42個(gè)(39.3%)和21個(gè)(19.6%);在四川成都鑒定圃,表現(xiàn)為高抗、中抗、中感和高感的品種分別有3個(gè)(2.8%)、30個(gè)(28.0%)、38個(gè)(35.5%)和36個(gè)(33.6%);在湖北荊州鑒定圃,表現(xiàn)為免疫、高抗、中抗、中感和高感的品種分別有2個(gè)(1.9%)、6個(gè)(5.6%)、57個(gè)(53.3%)、33個(gè)(21.5%)和17個(gè)(15.9%)。有25個(gè)品種(13.2%)在3個(gè)鑒定圃均表現(xiàn)為中抗及以上水平,且3個(gè)鑒定圃中抗病品種所占比例從高到低依次為湖北荊州(60.8%)>甘肅天水(41.1%)>四川成都(30.8%)。

濟(jì)寧13號(hào)在苗期和成株期對(duì)條銹菌混合菌株均表現(xiàn)出抗性,表明該品種具有全生育期抗性。濟(jì)麥262、煙農(nóng)836、菏麥17等24個(gè)品種對(duì)條銹菌混合菌株在苗期表現(xiàn)為感病,而在成株期表現(xiàn)為中抗及以上水平,表明這些品種具有成株期抗性。

2.2 抗病基因檢測(cè)結(jié)果

利用與抗條銹病基因Yr5、Yr9、Yr10、Yr15、Yr18、Yr26、Yr36和Yr62連鎖的分子標(biāo)記,對(duì)107個(gè)品種進(jìn)行基因檢測(cè)。結(jié)果(表2)表明,齊麥2號(hào)、泰山28、魯原502等27個(gè)品種可能攜帶Yr9,占比25.2%;圣麥102、山農(nóng)31號(hào)、煙農(nóng)999等27個(gè)品種可能攜帶Yr10,占比25.2%;山農(nóng)15、聊麥16、德抗961、煙農(nóng)18號(hào)、濟(jì)南9號(hào)這5個(gè)品種可能攜帶Yr18,占比4.7%;山農(nóng)紫麥1號(hào)、臨麥2號(hào)、煙農(nóng)23號(hào)等12個(gè)品種可能攜帶Yr62,占比11.2%。107個(gè)品種中均未檢測(cè)到Y(jié)r5、Yr15、Yr26和Yr36。

2.3 不同時(shí)期育成品種的成株期抗性比較

對(duì)不同時(shí)期育成品種的成株期抗銹性進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)2000年及以前育成的31個(gè)品種中,在3個(gè)鑒定圃中均表現(xiàn)為中抗及以上水平的有11個(gè),占比35.5%;2001-2005年育成的30個(gè)品種中,在3個(gè)鑒定圃中均表現(xiàn)為中抗及以上水平的有9個(gè),占比30.0%;2006-2011年育成的26個(gè)品種中,在3個(gè)鑒定圃中均表現(xiàn)為中抗及以上水平的有3個(gè),占比11.5%;2012-2019年育成的20個(gè)品種中,在3個(gè)鑒定圃中均表現(xiàn)為中抗及以上水平的有2個(gè),占比10.0%。這表明不同時(shí)期育成品種的抗性總體表現(xiàn)存在差異,2012年以前育成的品種中,山農(nóng)18、德抗961、金鐸1號(hào)等23個(gè)品種仍然具有較好的抗性;而2012-2019年育成的20個(gè)品種中,僅濟(jì)麥262和煙農(nóng)836具有中抗及以上水平的抗性(表3)。

表3 不同育成時(shí)期山東小麥品種的抗條銹性表現(xiàn)

3 討論

本研究選擇位于不同條銹病流行區(qū)的3個(gè)鑒定圃對(duì)107個(gè)山東育成小麥品種進(jìn)行抗條銹病鑒定,鑒定結(jié)果反映了品種對(duì)于中國獨(dú)立流行區(qū)大多數(shù)條銹菌的抗性水平,對(duì)于山東小麥抗條銹病育種具有借鑒作用。在3個(gè)鑒定圃成株期表現(xiàn)中抗及以上水平的品種所占比例不同,在四川成都鑒定圃(30.8%)和甘肅天水鑒定圃(41.1%)的抗病品種比例低于湖北荊州(60.8%),在3個(gè)鑒定圃均表現(xiàn)抗性的品種比例為23.4%。湖北荊州鑒定圃屬于鄂西北冬繁區(qū),本研究采用自然發(fā)病的接種方式;四川成都和甘肅天水鑒定圃位于條銹病核心菌源基地和冬繁區(qū),本研究采用人工接種加自然誘發(fā)鑒定,因此湖北荊州鑒定圃菌株的毒性小種多樣性較低。這可能是湖北荊州鑒定圃中抗病品種比例較高的原因。濟(jì)麥6號(hào)、濱麥1號(hào)、魯麥21號(hào)和濟(jì)南13號(hào)在湖北荊州表現(xiàn)為中感,而在甘肅天水表現(xiàn)為中抗,表明湖北荊州出現(xiàn)了與甘肅天水毒性譜不同的菌株,這些菌株可能來自于云貴地區(qū)[16-17]。

不同時(shí)期育成的品種在3個(gè)鑒定圃的成株期抗性表現(xiàn)不同,育成時(shí)間越晚的抗性品種比例越低。尤其是2012年以來育成的20個(gè)品種中,苗期具有較好抗性的品種僅鑫麥296,成株期具有較好抗性的品種僅濟(jì)麥262和煙農(nóng)836,說明新選育的品種抗病比例顯著下降。原因可能是山東育成品種的遺傳多樣性較窄,導(dǎo)致品種的抗性差異越來越小[18]。因此,需拓寬山東小麥種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ),為小麥品種選育提供更豐富的親本材料。

Yr9和Yr10基因在我國小麥育種中曾廣泛應(yīng)用[19-20],但對(duì)當(dāng)前流行小種已喪失抗性[21]。本研究發(fā)現(xiàn),2005年及以前育成的品種中Yr9和Yr10基因的分布頻率分別為31.1%和24.6%,其中濟(jì)寧864872、濟(jì)寧16號(hào)、豐川6號(hào)、金鐸1號(hào)和濟(jì)寧13號(hào)可能同時(shí)攜帶Yr9和Yr10基因。Yr5和Yr15均為全生育期抗性基因,目前仍是我國有效的抗病基因[21],但本研究中未發(fā)現(xiàn)攜帶這2個(gè)基因的品種。攜帶Yr62基因的品種具有良好的抗病性[21],本研究中有12個(gè)品種可能含有Yr62基因,且大部分品種均具有較好的抗性。

本研究發(fā)現(xiàn),2005年及以前育成的品種中,32.8%的品種仍然具有較好的抗性,其中金鐸1號(hào)、德抗961、濟(jì)寧13、濟(jì)南17號(hào)分別聚合了Yr9+Yr10+Yr62、Yr9+Yr18、Yr9+Yr10+Yr62和Yr10+Yr62,魯麥14號(hào)、泰山23號(hào)、濟(jì)寧12號(hào)等品種可能攜帶未知的抗病基因,因此仍保持成株期抗性。而2011-2019年育成的品種未發(fā)現(xiàn)攜帶成株期抗性基因Yr18或Yr62。因此,現(xiàn)階段山東小麥育種中,應(yīng)以利用成株期抗性基因?yàn)橹?聚合全生育期抗性基因的策略,加快抗病基因輪替;遵循抗病基因布局的原則,引入與菌源地不同的抗性基因品種,延長抗病品種使用年限。