水牛ACSL基因家族全基因組及表達分析

梁莎莎 于農淇 鄢勝飛 盧瑛 李廳廳 黃健 譚正準 李輝 黃榮春 潘偉軍 覃廣勝

摘要 為鑒定水牛長鏈脂酞輔酶A合成酶（long-chain fatty Acyl-CoA synthetases，ACSLs）的家族成員并探究該基因家族在泌乳方面的功能，通過生物信息學技術對水牛ACSL基因家族進行了motif、基因結構分析、共線性分析、不同物種系統進化分析，運用qPCR技術檢測ACSLs在不同組織的mRNA表達量。結果表明：水牛ACSL基因家族共有5個家族成員并分別命名為bbu.ACSL1、bbu.ACSL3、bbu.ACSL4、bbu.ACSL5和bbu.ACSL6。染色體分布情況結果顯示：bbu.ACSL1位于1號染色體，bbu.ACSL3位于2號染色體，bbu.ACSL4位于25號染色體，bbu.ACSL5位于23號染色體，bbu.ACSL6位于9號染色體。這5個ACSL氨基酸數在699～722 aa，所有蛋白的等電點除ACSL6外均大于7.00。Motif分析發現，除ACSL3和ACSL4缺少motif8外，其余均含有預測出的Motif 1～10，且排序相同。物種內共線性分析結果顯示，水牛和普通牛中均不存在串聯重復和片段重復，種間共線性分析結果顯示，水牛ACSL與普通牛ACSL存在4對片段重復基因。不同物種ACSL系統發育分析顯示，ACSL基因家族具有較高的保守性，其中水牛與普通牛和牦牛的聚類更為相近。不同組織表達量分析發現ACSL1、ACSL3在乳腺組織的mRNA表達量高于其他組織，ACSL6在大腦的mRNA表達量高于其他組織，ACSL4在肺部的mRNA表達量高于其他組織，ACSL5在肝的mRNA表達量高于其他組織。根據RNA-seq 測序結果分析不同泌乳時期表達量結果顯示，ACSL1在整個泌乳期均有高表達量，尤其是在泌乳第50、140和280天。ACSL3和ACSL5在泌乳第7天和第50天高表達，但隨著泌乳天數增加，表達量降低。ACSL4和ACSL6在泌乳第7天表達量最高，但在整個泌乳期的表達量均遠低于該家族的其他3個成員。

關鍵詞 水牛； ACSL； 基因結構； 共線性； 系統發育；乳腺組織；表達量

中圖分類號 S823.8+3? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2023）14-0079-07

作者簡介 梁莎莎（1992—），女，廣西南寧人，助理研究員，從事水牛分子遺傳學研究。*通信作者，研究員，從事動物育種與繁殖研究。

收稿日期 2022-08-08

水牛以耐粗飼而著稱，具有適應性強、耐高溫高濕、抗病力強和易飼養等特點［ 1］。除了作為役畜外，水牛還可提供奶類和肉類，具有重要的經濟價值［ 2］。水牛奶乳汁濃厚，奶質優良，營養豐富，具有較高的乳脂肪（8.0%）、乳蛋白（4.5%）、不飽和脂肪酸比例和較低的磷脂和膽固醇水平［ 3］，有“奶中之王”之稱。然而，水牛平均產奶量遠低于荷斯坦普通牛，奶產量僅占世界牛奶產量的13%［ 4］。因此，提高水牛泌乳性能至關重要，而挖掘與產奶性狀相關的候選基因有助于改善水牛泌乳性能。

長鏈脂酞輔酶A合成酶家族（longchain fatty Acyl-CoA synthetases，ACSLs）是哺乳動物利用脂肪酸活化催化生成酯酰輔酶A過程中所必需的酶［ 5］。目前已發現，哺乳動物ACSLs基因有5種亞型，分別為ACSL1、ACSL3、ACSL4、ACSL5和ACSL6［ 6-7］。研究表明，ACSLs基因在甘油三酯、磷脂和膽固醇合成及脂肪酸代謝中具有重要作用［ 8］。ACSL1基因可以提高甘油三酯中油酸的沉積，增加脂肪在細胞內的沉積量［ 5］，對牛脂肪細胞中的多不飽和脂肪酸合成具有積極調控作用［ 9］。在中國紅草原牛中，脂肪細胞分化過程誘導ACSL3，其過表達可促進脂滴甘油三酯含量的增加［ 10］。ACSL4被發現的功能包括細胞內脂質儲存［ 11］，膽固醇從內質網運輸到線粒體［ 12］，有研究發現，ACSL4多態性與不同豬品種的IMF含量和脂肪酸組成有關［ 13］。ACSL5存在于各種組織中，包括棕色脂肪組織、骨骼肌、肝臟和大腦，有發揮促進脂肪酸在合成代謝脂類和分解代謝β-氧化通路之間的通道作用［ 14］。ACSL6最初在大鼠大腦中被發現［ 15］，ACSL6缺乏癥會破壞正常的腦功能和精子發生，小鼠缺乏ACSL6會表現出運動功能障礙和星形膠質細胞增生增加［ 16］。

大量研究表明，ACSLs對哺乳動物的許多代謝過程中發揮著不可或缺的作用，特別是脂質代謝方面，然而目前關于水牛ACSL基因家族的研究較少。筆者以水牛基因組為參考，從全基因組水平鑒定水牛的ACSL家族成員，分析該家族成員的蛋白序列特征、motif分布、外顯子-內含子結構、染色體定位、共線性關系、系統進化關系，運用qPCR和RNA-seq技術檢測水牛ACSL基因家族在不同組織和不同泌乳時期的表達量差異，以期為后續深入挖掘水牛ACSL基因家族的功能提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗水牛組織cDNA（心、肝、肺、腎、胃、乳腺和大腦）均來自廣西水牛研究所，品種為尼里水牛，月齡約48個月，體重約500 kg，雌性，泌乳期3頭。

1.2 主要試劑和儀器設備 主要試劑? PerfectStart Green qPCR SuperMix購自北京全式金公司。主要儀器? NanoDrop2000紫外分光光度計（Gene，USA）和Roche Lightcycler 480實時熒光定量PCR儀。

1.3 試驗數據 以水牛及其相關物種的全基因組序列為基礎進行分析。全基因組數據包括全基因組的基因序列、蛋白質序列和基因注釋文件。全基因組數據源自NCBI基因組數據庫（表1）。

1.4 水牛ACSL基因家族成員蛋白序列的獲得

登陸UniProt（https：∥www.uniprot.org/）搜索ACSL基因家族的蛋白質序列，勾選所有該家族不同物種的可靠蛋白序列，下載保存并使用MEGA 7.0軟件比對其同源性。登陸NCBI下載水牛完整蛋白序列，再使用hmmbuild和hmmsearch軟件構建HMM模型，并搜索序列庫找到水牛ACSL基因家族所有的蛋白序列，最后使用TBtools軟件將序列提取出來。

1.5 水牛ACSLs蛋白序列特征分析

使用ProtScale（https：∥web.expasy.org/protscale/）計算水牛ACSL家族蛋白質分子量和等電點；使用TBtools軟件中的Table Row Extract or Filter插件從水牛和普通牛的基因注釋文件中提取ACSLs染色體分布信息。

1.6 水牛ACSLs蛋白質保守基序分析及基因結構預測

使用MEME（http：∥memesuite.org/tools/meme）和GSDS（http：∥gsds.cbi.pku.edu.cn/）分析水牛ACSL家族蛋白質保守基序（motif）和基因結構；使用Pfam（http：∥pfam.xfam.org/）搜索每個motif所屬的結構域；使用MEGA 7.0構建水牛ACSL家族系統進化樹；最后使用TBtools軟件將水牛ACSLs系統進化樹和motif分析結果整合到一起進行可視化。

1.7 水牛和普通牛ACSLs共線性分析

為了探討ACSL基因家族的進化進展，使用TBtools軟件中的one step MCscanX插件對水牛和普通牛的種內及種間進行共線性分析，使用Advanced Circos和Dual Systeny Plot插件繪制物種內及種間共線性圖。

1.8 不同物種ACSLs系統發育分析

為揭示水牛與其近緣物種ACSLs之間的進化關系，使用MEGA 7.0構建水牛、普通牛、牦牛、山羊、綿羊、馬和駱駝的ACSL家族系統進化樹，最后使用Adobe Illustrator CS6對系統進化樹進行美化。

1.9 水牛ACSLs表達分析

1.9.1 不同組織表達量檢測及分析。

使用Primer 3.0設計水牛ACSL基因家族qPCR引物，引物序列見表2。將水牛組織（心、肝、肺、腎、胃、乳腺和大腦）的cDNA 稀釋至70～80 ng/μL，使用實時熒光定量PCR檢測ACSL基因家族在不同組織中的表達情況，以GAPDH作為內參。反應體系為20 μL，其中2 x PerfectStart Green qPCR SuperMix 10.0 μL，Rnase water 8.2 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA 1.0 μL；反應條件：94 ℃ 預變性30 s，94 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，40個循環。運用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量，采用Duncans新復極差法對不同組織表達量進行多重比較，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

1.9.2 基于RNA-seq進行不同泌乳時期表達分析。

為揭示ACSLs不同成員在水牛乳腺組織中不同泌乳時期的表達量差異，筆者選用4個泌乳時期：泌乳第7天（7 d）、第50天（50 d）、第140天（140 d）和第280天（280 d），每個時期2頭，活體采集共8頭摩拉水牛乳腺組織進行轉錄組測序，測序結果已上傳到NCBI數據庫，登錄號：PRJNA480718（SRR7523532～SRR7523538）。

ACSLs表達量分析：使用sratoolkit將所有RNA-seq原始sra文件轉換為fastq格式。運用kallisto構建水牛ACSL基因家族index庫，并分別比對8個RNA-seq結果，進行量化分析，計算ACSLs在不同RNA-seq中的TPM（Transcripts Per Million）值，由TPM值來表示基因的表達量，計算每組的平均值后，使用TBtools軟件中的Heatmap插件對其進行可視化，繪制表達量熱圖。

2 結果與分析

2.1 水牛ACSL蛋白序列的獲得及特征分析

對水牛基因組的蛋白序列進行搜索，共鑒定得到5條水牛ACSL蛋白的編碼基因，命名為bbu.ACSL1、bbu.ACSL3、bbu.ACSL4、bbu.ACSL5和bbu.ACSL6。染色體分布情況結果顯示，bbu.ACSL1位于1號染色體，bbu.ACSL3位于2號染色體，bbu.ACSL4位于25號染色體，bbu.ACSL5位于23號染色體，bbu.ACSL6位于9號染色體。bbu.ACSL6的氨基酸數為722 aa，最短的是bbu.ACSL1，為699 aa。所有蛋白的等電點除了bbu.ACSL6，均大于7.00（表3）。

2.2 水牛ACSLs motif分析和基因結構預測

根據水牛ACSLs系統進化樹結果，可將水牛ACSL家族基因分為3組，即ACSL1和ACSL6為一組，ACSL5單獨為一組，ACSL3和ACSL4為一組。

蛋白保守基序結果顯示，共預測出10個保守的motifs（命名為Motif 1～10）。這10個保守motifs的分布見圖1，氨基酸序列信息見表4。由圖1可知，水牛ACSL家族成員中，除了ACSL3和ACSL4外缺少motif8外，其余均含有預測出的Motif 1～10且排序相同。使用Pfam分析每個motif后發現，除了motif7和motif8外，均含有AMP-binding結構域。基因結構結果顯示，水牛ACSL1和ACSL5基因有23個外顯子，22個內含子，ACSL3有15個外顯子，14個內含子，ACSL4有18個外顯子，17個內含子，ACSL6有24個外顯子和23個內含子。

2.3 水牛和普通牛ACSLs共線性分析

為了研究ACSL家族的進化進展，對水牛和普通牛的種內及種間進行共線性分析（圖2）。結果發現，在水牛和普通牛中均未發現串聯重復基因對。種間共線性分析結果表明，水牛ACSL與普通牛ACSL存在4對片段重復基因，分別是bbu.ACSL3-bta.ACSL3、bbu.ACSL6-bta.ACSL6、bbu.ACSL5-bta.ACSL5和bbu.ACSL4-bta.ACSL4（圖2、3）。

2.4 不同物種ACSLs系統發育分析

為揭示水牛與水牛近緣物種ACSLs之間的進化關系，分別獲取了普通牛（Bos taurus）、牦牛（Bos mutus）、山羊（Capra hircas）、綿羊（Ovis aries）、馬（Equus caballus）和駱駝（Camelus ferus）的ACSL家族蛋白序列，并構建了進化樹（圖4）。根據進化樹信息，發現所有的基因劃分為大類，分別是Group Ⅰ、Group Ⅱ和Group Ⅲ。Group Ⅰ 包括所有上述物種的ACSL1和ACSL6，Group Ⅱ只包括ACSL5，GroupⅢ包括ACSL3和ACSL4，其中水牛ACSL家族基因與普通牛和牦牛的聚類更為相近。

2.5 水牛ACSLs不同組織表達量分析

為了探究水牛ACSLs的組織特異性，利用qPCR技術檢測了ACSLs在心、肝、肺、腎、胃、乳腺和大腦7個組織中的mRNA表達量，結果顯示（圖5），這5個ACSL基因在這7個組織中均有表達，其中ACSL1、ACSL3在乳腺組織中的mRNA表達量極顯著高于其他組織（P<0.01），ACSL6在乳腺組織中的mRNA表達量極顯著高于肺、肝、腎、胃、心、脂肪，ACSL3和ACSL6在大腦的mRNA表達量極顯著高于肝、心、胃、心、脂肪組織（P<0.01），ACSL4在肺部的mRNA表達量極顯著高于其他組織（P<0.01），ACSL5在肝的mRNA表達量極顯著高于其他組織（P<0.01）。

2.6 水牛ACSLs不同泌乳時期表達分析

在組織表達分析中，ACSL基因家族在水牛泌乳期組織中均有表達，為了進一步探索ACSLs對水牛乳房發育及泌乳性能的作用，該試驗選用4個泌乳時期：泌乳第7天（7 d）、第50天（50 d）、第140天（140 d）和第280天（280 d），每個時期2頭，活體采集共8頭摩拉水牛乳腺組織進行轉錄組測序，分析了水牛ACSLs不同泌乳時期的表達量差異。TPM計算結果顯示，這5個ACSL基因在4個泌乳時期的乳腺組織中均有表達，其中ACSL1在整個泌乳期均有高表達量，尤其是在泌乳第50、140和280天。ACSL3和ACSL5在泌乳第7天和第50天高表達，但隨著泌乳天數增加，表達量降低。ACSL4和ACSL6在泌乳第7天表達量最高，但在整個泌乳期的表達量均遠低于該家族的其他3個成員（表5、圖6）。

3 討論

該研究利用生物信息學技術在水牛全基因組序列中鑒定出5個ACSL家族成員，根據它們的進化關系分成了3組。這5個ACSL蛋白長度在699～722 aa，所有蛋白的等電點除ACSL6外均大于7。說明除了ACSL6外，其余家族成員均為堿性蛋白質。Motif分析發現，除ACSL3和ACSL4外缺少motif8外，其余均含有預測出的Motif 1～10且排序相同，說明水牛ACSL基因家族成員蛋白功能相似。

在遺傳進化過程中，串聯復制和片段復制有助于加速基因家族的擴增和基因組進化機制，為獲取新的基因功能提供了可能［ 17］，而在進化過程中，親緣關系越近，共線性越好。該次對水牛和奶牛的種內共線性分析中，均未發現串聯重復和片段重復，但是水牛和奶牛種間共線性關系很高并且發現了4對片段重復ACSL基因，說明兩者ACSL基因家族的親緣關系接近［ 18］。

不同物種ACSL系統發育分析結果顯示，不同物種的直系同源ACSL基因聚類在一起，可以看出ACSL基因家族具有較高的保守性，其中水牛與奶牛和牦牛的聚類更為接近。在進化中的這種高度保守，也暗示了其在哺乳動物中具有重要的生物學功能。

ACSL家族包括ACSL1、ACSL3、ACSL4、ACSL5和ACSL6 5種不同的異構體，這些蛋白質具有不同的亞細胞定位、脂肪酸底物和組織特異性。長鏈脂肪酸在腦內的代謝及其與信號分子（如甘油二酰基和LPA）和細胞膜結構成分（包括髓鞘）的結合，需要ACSLs的激活，其中ACSL3和ACSL6是大腦中主要的ACSL亞型［ 19］。除了大腦，BU等［ 20］研究發現，ACSL3是介導肝臟脂肪合成的轉錄調控的新角色。DONG等［ 21］研究發現，高果糖飲食的倉鼠肝臟中ACSL3 的mRNA和蛋白表達明顯減少。ACSL4被發現與人的肺部功能相關，鐵凋亡和ACSL4的抑制可通過減少脂質過氧化和增加谷胱甘肽和GPX4水平來減輕肺缺血再灌注（IR）誘導的肺損傷中的鐵質損傷［ 22］。Lewin等［ 23］研究發現，大鼠禁食48 h后，肝臟線粒體ACSL5活性增加。尼里水牛不同組織mRNA表達量結果顯示，ACSL3和ACSL6在大腦的mRNA表達量極顯著高于其他組織（P<0.01）（除了ACSL3大腦低于乳腺組織），ACSL4在肺部的mRNA表達量極顯著高于其他組織（P<0.01），ACSL5在肝臟的mRNA表達量顯著高于其他組織（P<0.01）。表明在尼里水牛中，ACSL3和ACSL6可能在調節大腦，ACSL4調節肺部，ACSL5調節肝臟的脂肪酸代謝方面發揮重要作用。而肝臟是脂質和脂肪酸代謝的重要部位，游離脂肪酸在肝臟中主要有3種代謝途徑，分別是完全氧化合成H2O和CO2；不完全氧化生成酮體及再酯化合成甘油三酯。因此，進入肝臟的游離脂肪酸超過其氧化代謝速率時，代謝發生異常，游離脂肪酸部分再酯化成甘油三酯，從而誘發脂肪積累，使肝臟發生病變［ 24］。因此，研究ACSL3和ACSL5基因對水牛的脂質和脂肪酸代謝具有重要意義。然而ACSLs在摩拉水牛乳腺組織不同泌乳時期的表達量差異與使用尼里水牛組織進行的表達量檢測結果有所不同。在摩拉水牛中，ACSL5在泌乳第7天和第50天高表達，表達量隨著泌乳天數增加而降低，但ACSL4和ACSL6在整個泌乳期的表達量均遠低于該家族的其他3個成員。這表明在不同水牛品種中，即使是相同的ACSL基因家族成員，對其泌乳性能也可能存在著不同的作用效果。

乳脂是一種高品質的脂肪，由甘油三酯（TAG）、二酰甘油、磷脂和丁酸等組成，其中甘油三酯的含量能達到總乳脂的98%。甘油三酯在細胞內會聚集成大脂滴，以乳脂球的形式分泌到牛奶中，因此通常以甘油三酯的含量來研究牛奶中的乳脂含量［ 25］。脂肪酸在乳腺中是被用來合成乳脂的底物，短鏈脂肪酸（C4-C8）和中鏈脂肪酸（C8-C14）幾乎完全是在乳腺上皮細胞中從頭合成的，而長鏈脂肪酸（>C16）是從血液中直接攝取的，Cl6脂肪酸在2種來源中各占50%左右。大部分長鏈脂肪酸（LCFA）主要通過ACSLl活化成長鏈酰基輔酶A穿過細胞膜，然后長鏈酰基輔酶A將LCFA帶入細胞后活化再利用［ 26］。ACSL3能促進卵磷脂的合成和細胞內脂滴的形成，有助于維持脂質平衡［ 27］。ACSL6通過將CoA與脂肪酸連接來激活脂肪酸，對具有C16-C20骨架的飽和脂肪酸以及多不飽和脂肪酸具有相同作用，ACSL6還能參與小脂質滴的生物發生過程及TAG和膽固醇酯的形成過程［ 28-29］，這些對乳脂的形成至關重要。此外，LIANG等［ 30］在荷斯坦奶牛中發現了6個ACSL1基因的SNPs，它們在一定程度上與產奶量、乳脂含量、乳蛋白含量和體細胞評分（SCS）有關。Li等［ 31］研究發現，ACSL3是奶牛乳脂肪酸性狀相關的20個新的候選基因中的關鍵基因之一。呂艷濤［ 32］研究發現，泌乳期母豬乳腺中ACSL3在家族成員中基因表達量最高，且隨著泌乳的進行mRNA表達量顯著升高。王夢巖等［ 33］研究發現，ACSL5基因可能與中國荷斯坦奶牛的乳蛋白代謝相關，這些研究均表明ACSLs與哺乳動物乳脂合成密切相關。而深入挖掘ACSL基因家族的功能也將有助于改善水牛的產奶性狀，優化水牛乳制品的品質，對今后提高水牛乳業的經濟效益具有重要意義。

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