基于參七湯的人參-三七藥對治療心肌梗死療效的薈萃分析及網絡藥理學研究

魏路路 郭書文,2 力一凡 馮鵬飛

(1 北京中醫藥大學,北京,100029; 2 北京中醫藥大學房山醫院,北京,102401)

心肌梗死(Myocardial Infarction,MI),是由于冠狀動脈閉塞、血流中斷導致心肌嚴重持久的缺血、缺氧引起的心肌局部壞死,嚴重時可并發心律失常、休克或心力衰竭,是造成人類死亡的主要原因之一[1]。相關報道顯示,中國心血管病的患病率處于持續上升階段,死亡率居首位,高于腫瘤及其他疾病[2],其中MI是重要致死因素之一。MI是急、危、重癥,確診后應立即搶救,應休息、鎮痛、吸氧、補充血容量、抗休克等對癥治療。

MI在中醫上屬于“胸痹”“真心痛”的范疇,病機多為“本虛標實”,臨床證候虛實夾雜,虛證以氣虛最為常見,實證多為血瘀[3],針對氣虛血瘀的病機,常以益氣活血的方式治療,參七湯作為益氣活血的代表方藥之一,臨床具有很好的療效。參七湯以人參、三七為君藥,現代研究表明,人參皂苷作為人參的主要活性成分,具有抗心律失常、抗心肌肥厚、抗心肌缺血、抗心肌細胞凋亡等作用[4]。人參皂苷Rg1在MI的狀態下能夠抑制心臟纖維化以及促進血管再生[5]。三七總皂苷是三七的活性成分,能夠通過上調血管內皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)表達促進新生血管生成,減少心肌梗死面積[6]。然而有關人參、三七治療MI的研究往往都是單一通路、單一機制研究,本研究通過薈萃分析了解參七湯治療MI的有效率,并結合網絡藥理學的方法,全方位、多角度探討人參-三七治療MI的作用機制,揭示其內在機制。

1 資料與方法

1.1 文獻來源 國家知識基礎設施數據庫(China National Knowledge Infrastructure,CNKI)、中國學術期刊數據庫(China Science Periodical Database,CSPD)及中文科技期刊數據庫(Chinese Citation Database,CCD)、PubMed、CochraneLibrary、Embase數據庫建庫以來發表的相關文獻,手工檢索《中國心血管雜志》《中華心血管病雜志》《心血管病學進展》等相關雜志。

1.2 檢索策略 搜索時間截止到2022年12月。檢索參七湯治療心肌梗死的臨床隨機對照試驗研究文獻,中文搜索詞:參七湯、胸痹、真心痛、心肌梗死,英文搜索詞:shenqi、myocardial infarction。以CNKI為例,檢索策略為[(全文=‘參七湯’)AND(全文=胸痹+真心痛+心肌梗死)]。

1.3 納入標準 納入以西醫常規治療為對照組,在對照組基礎上聯合參七湯治療的臨床隨機對照試驗研究,西醫常規治療可聯合運動方案,不考慮盲法與否,不考慮參七湯在關鍵用藥基礎上的臨床藥物加減。試驗研究對象應為心肌梗死后心室重構患者,研究對象診斷標準不設立統一標準,但主體內容應一致,符合中華醫學會、歐洲心臟病學會、美國心臟病協會等權威機構發布的心肌梗死診斷標準,中醫診斷應符合胸痹或真心痛。評價標準主要指標為左心室射血分數(Left Ventricle Ejection Fraction,LVEF)、左室舒張末期內徑(Left Ventricular End-diastolic Dimension,LVEDD)、低密度脂蛋白膽固醇(Low Density Lipoprotein Cholesterol,LDL-C),次要指標為證候積分總有效率。主要指標≥1項可納入。

1.4 排除標準 1)重要數據缺失文獻;2)研究周期少于1個月文獻;3)期刊文獻與畢業大論文重復者。

1.5 資料提取及質量評價 1)資料提取:主要內容包括研究者信息、樣本量、性別、年齡、干預措施和對照措施、療程、結局指標。2)質量評價:質量評價嚴格按照Cochrane協作網的偏倚風險評估工具執行。共7個條目:隨機序列生成、隨機序列隱藏、受試者及研究人員的盲法、結局評價者盲法、不完整結局數據、選擇性結局報告及其他偏倚,并針對每個條目的偏倚做出高風險(High risk)、低風險(Low risk)、不確定風險(Unclear risk)的判斷來評價納入研究的方法學質量。資料提取及質量評價由2位研究者獨立完成并交叉核對,產生分歧時,與第3位研究者協商、討論決定。

1.6 統計分析 采用Rev Man 5.4統計軟件進行數據分析。計數資料用比值比(Odds Ratio,OR)及其95%置信區間(95% Confidence Interval,95%CI)表示,計量資料用均數差(Mean Deviation,MD)及其95%CI表示。若異質性檢驗結果為P>0.10時,多個研究的異質性無統計學意義,若P≤0.10,多個研究的異質性有統計學意義。通過I2來分析各研究間的異質性,當I2≤50%時,異質性較小,忽視異質性,采用固定效應模型;若I2>50%,則認為其為高異質性,選擇隨機效應模型進行Meta分析,并通過亞組分析和回歸分析,盡量找出異質性來源。

1.7 網絡藥理學研究

1.7.1 人參-三七活性成分、相關靶點及作用MI相關靶點的篩選 活性成分及相關靶點:通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)尋找“人參”“三七”的活性成分,結合口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)≥30%和類藥性(Drug Likeness,DL)≥0.18作為篩選條件,獲得二者的活性化合物及其作用的蛋白質靶點[7]。利用Uniprot蛋白質數據庫(https://www.uniprot.org)將上述蛋白質靶點進行統一規范。

作用于MI相關靶點的篩選:通過GeneCards數據庫、OMIM數據庫、DrugBank數據庫以及TTD數據庫篩選心肌梗死相關靶點[8-11],將4個數據庫獲得的相關靶點匯總并去重。將人參-三七活性成分的靶點和MI相關靶點取交集,將其作為人參-三七作用于MI的潛在靶點。

1.7.2 靶蛋白質-蛋白質相互作用(Protein-protein Interaction,PPI)網絡的構建 將人參-三七作用于MI的潛在靶點導入STRING 11.0數據庫(https://string-db.org/)構建PPI網絡[12],生物種屬選擇‘Homo sapiens’,最小交互閾值選擇‘highest confidence(0.900)’,下載PPI網絡圖片。

1.7.3 人參-三七作用MI的潛在靶點富集分析 將潛在靶點導入Metascape數據庫進行基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析。分別進行分子功能(Molecular Functions,MF)、生物過程(Biological Processes,BP)、細胞組分(Cellular Components,CC)及KEGG通路分析,設置“P<0.01”,保存數據并使用OriginPro 2019b對結果進行可視化處理。

1.7.4 活性成分-靶點網絡和成分-靶點-通路網絡的構建及核心組分篩選 將人參-三七的活性成分和人參-三七作用于MI的潛在靶點導入Cytoscape 3.7.1軟件[13],構建活性成分-潛在靶點網絡,并分析關鍵網絡拓撲參數,如連接度(Degree)、介數中心性(Betweenness Centrality)、接近中心性(Closeness Centrality)等,根據這些參數篩選人參-三七作用MI的活性成分和作用靶點。將KEGG通路富集分析的結果作為信號通路,選取比較有代表性的前20個通路,將這些道路對應的潛在靶點與活性成分導入Cytoscape 3.7.1構建活性成分-靶點-通路網絡。

1.7.5 分子對接驗證 從PDB數據庫(http://www.rcsb.org/)獲取核心靶點的蛋白質三維結構數據文件(Protein Data Bank,PDB),從TCMSP獲取主要活性成分的MOL2結構。將核心靶點蛋白作為受體,活性成分作為配體,應用分子對接模擬軟件AutoDock 4.2進行半柔性對接[14]。對接運算采用拉馬克遺傳算法(Lamarckian Genetic Algorithm,LGA),各參數選擇默認值。對接完成后,對結果進行分析,并用pymol進行可視化處理[15]。

2 結果

2.1 文獻檢索結果 通過檢索策略共獲得224篇相關文獻,篩重后共獲得178篇文獻,初篩后剔除明顯不符合納入標準文獻159篇,精準閱讀文獻19篇,最終納入文獻9篇[16-24]。文獻篩選流程見圖1。

圖1 文獻篩選流程

2.2 納入文獻基本特征 本研究納入9項研究,共650例,觀察組共328例,對照組共322例。納入研究的基本特征見表1。

表1 納入文獻基本特征

2.3 質量評價 對納入的9篇文獻,采用Cochrane風險偏倚評價表進行質量評價。1)隨機分配方法:9篇文獻中6篇采用隨機數字表分組法,評價為低風險,其余3篇未提及具體隨機方法,評價為風險不明。2)分配方案隱藏:9篇文獻中3篇未提及具體分配隱藏,評價為不明風險。3)盲法:9篇文獻均未提及盲法設計,評價為不明風險。4)結果數據的完整性:文獻中有1篇研究觀察組與對照組均有脫落,作者已詳述脫落與剔除原因,評價為低風險,其余8篇文獻的病例數完整,均評價為低風險。5)選擇性報告研究結果:9篇文獻中,有1篇存在選擇性報告結果,評價為高風險。6)其他偏倚來源:納入的9篇文獻中無其他偏倚來源。見圖2。

圖2 納入文獻偏倚風險

2.4 結局指標評價及結果分析

2.4.1 射血分數 共有6篇文獻[18-22,24]進行了射血分數的判定,結果顯示,各研究間存在明顯異質性(P<0.000 01,I2=92%),采用隨機效應模型,觀察組優于對照組,但2組間差異無統計學意義(MD=3.22,95%CI為-0.26～6.69,P=0.07)。依據治療時間進行亞組分析,結果顯示,治療1個月的2項研究存在明顯異質性(P=0.002,I2=89%),差異無統計學意義(MD=1.11,95%CI為-11.47～13.68,P=0.86);治療2～3個月的3項研究異質性降低(P=0.19,I2=39%),差異有統計學意義(MD=5.82,95%CI為4.19～7.44,P<0.000 01)。總合并效應量(MD=3.22,95%CI為-0.26～6.69,P=0.07)。結果顯示,觀察組相較對照組可提高LVEF。異質性的變化與療程有關,考慮其異質性來源可能與療程有關。見圖3～4。

圖3 LVEF森林圖

圖4 LVEF亞組分析森林圖

2.4.2 LDL-C 共有4篇文獻[16,17,19,23]進行了,LDL-C的評定,存在明顯異質性(P<0.000 01,I2=94%),采用隨機效應模型進行分析。敏感性分析提示逐一排除文獻未見明顯異質性改變,考慮相關研究較少,暫不明確異質性來源。結果顯示,觀察組相較對照組可降低低密度脂蛋白,差異有統計學意義(MD=-0.48,95%CI為-0.7～-0.19,P=0.001)。見圖5。

圖5 低密度脂蛋白森林圖

2.4.3 LVEDD 共有2篇文獻[19,22]進行了LVEDD的評定,存在明顯異質性(P=0.01,I2=85%),采用隨機效應模型進行分析,考慮研究較少,暫不予異質性來源分析,結果顯示,觀察組相較對照組可降低左室舒張末內徑,差異無統計學意義(MD=-2.45,95%CI為-5.68～0.77,P=0.14)。見圖6。

圖6 左室舒張末內徑森林圖

2.4.4 證候積分總有效率 共有5篇文獻[16-18,21,24]對證候積分總有效率進行了判定,結果顯示,異質性檢驗提示各研究無明顯異質性(P=1.00,I2=0%),故采用固定效應模式,提示觀察組治療總有效率優于對照組,差異有統計學意義(OR=4.46,95%CI為2.28～8.74,P<0.000 1)。見圖7。

圖7 證候積分總有效率森林圖

2.5 人參-三七活性成分、相關靶點及作用MI潛在靶點的篩選

2.5.1 人參-三七活性成分與相關靶點 通過TCMSP數據庫篩選出30個符合OB≥30%、DL≥0.18條件的化合成分,其中人參有22種,三七有8種活性成分,將二者匯總刪除重復值,共得到人參-三七26種活性成分。主要有:高麗槐素(Inermin)、山柰酚(Kaempferol)、阿樸天仙子堿(Aposiopolamine)、南蛇藤芐酰胺(Celabenzine)、原阿片堿(Fumarine)、人參皂苷f2(Ginsenoside f2)、槲皮素(Quercetin)、β-谷甾醇(Beta-sitosterol)、豆甾醇(Stigmasterol)等。各個活性成分的OB和DL值見表2。人參活性成分作用靶點114個、三七活性成分作用靶點177個,合并后刪除重復值共得到靶點197個。

表2 人參-三七活性成分

2.5.2 人參-三七作用MI的潛在靶點 從GeneCards、DrugBank、OMIM、TTD數據庫篩選心肌梗死相關靶點,各獲得靶點916個、105個、40個、23個,去重共得到相關靶點1 012個。將篩選出的人參-三七活性成分作用靶點與心肌梗死相關靶點取交集并繪制韋恩圖,得到人參-三七作用心肌梗死的交集靶點102個。見圖8。

圖8 人參-三七活性成分靶點與MI相關疾病靶點韋恩圖

2.6 PPI網絡的構建 將102個潛在靶點導入STRING 11.0平臺,得到人參-三七作用MI靶點PPI網絡,包含102個節點,255條邊。其中節點表示蛋白,邊則表示PPI關系。見圖9。

圖9 人參-三七治療MI相關靶點PPI網絡

2.7 GO富集分析與KEGG通路分析 KEGG通路分析共獲得149條通路,選取前20個通路利用OriginPro 2019b進行可視化處理。見圖10A。結果顯示,潛在靶點主要在AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、PI3K-AKT信號通路(PI3K-AKT signaling pathway)、核因子κB信號通路(NF-kappa B signaling pathway)、HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)、cGMP-PKG信號通路(cGMP-PKG signaling pathway)等通路富集。見圖10。

圖10 KEGG通路分析和GO富集分析結果

GO富集分析結果顯示潛在靶點參與的分子功能主要包括核受體化學(Nuclear receptor activity)、細胞因子受體結合(Cytokine receptor binding)、蛋白質結構域特異性結合(Protein domain specific binding)、蛋白酶結合(Protease binding)、絲氨酸水解酶活性(Serine hydrolase activity)等;生物過程主要有:細胞因子介導的信號通路(Cytokine-mediated signaling pathway)、對脂多糖的反應(Response to lipopolysaccharide)、對無機物的反應(Response to inorganic substance)、細胞對有機環狀化合物的反應(Cellular response to organic cyclic compound)、對有毒物質的反應(Response to toxic substance)等;參與的細胞組分主要包括膜筏(Membrane raft)、細胞外基質(Extracellular matrix)、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子復合物(RNA polymeraseⅡtranscription factor complex)、內質網腔(Endoplasmic reticulum lumen)、質膜蛋白復合物(Plasma membrane protein complex)等。見圖10。

2.8 網絡構建及核心組分的篩選 篩選出人參-三七作用于MI的重要活性成分為槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇,重要靶點為前列腺素內過氧化物合酶(Prostaglandin G/H Synthase,PTGS)2、前列腺素內過氧化物合酶1(PTGS1)、β2腎上腺素受體(beta-2 Adrenergic Receptor,ADRB2)、心臟鈉通道基因(SCN5A)。見圖11。

KEGG通路富集共得到149條通路,選取其中20條通路。見圖12。

圖12 成分-靶點-通路網絡

2.9 分子對接驗證 結果顯示人參-三七的主要活性成分槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇與靶點ADRB2結合較好,推測人參-三七治療MI與槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇以及靶點ADRB2關系密切。見圖13。

圖13 槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇與靶點ADRB2的對接結果

3 討論

MI是心血管疾病中發病率較高的一種疾病,對中老年患者構成了很大的威脅。中醫認為,MI的根本病因在于患者本身臟腑功能失調、勞倦內傷等內因與外邪侵襲、飲食不節等外因。根本病機在于不通則痛,不榮則痛。前者多表現為血瘀,可由外邪侵襲、痰濁、寒凝等引起。后者多由氣虛、血虛、陽虛等引起[25]。臨床MI患者多表現為氣虛血瘀證,常用益氣活血方治療,本研究納入9項以參七湯為主治療MI的臨床研究,共計650例患者,分別從LVEF、LVEDD、LDL-C、證候積分總有效率等指標評價參七湯治療MI的有效性。結果顯示參七湯聯合西醫常規治療相較對照組能改善心功能,降低血脂水平,提高治療有效率。不過本研究存在一定局限性:本研究納入研究時間年限跨度較長,研究質量參差不齊,原始研究執行情況不明,可能導致研究異質性偏高;納入文獻未采用盲法,未采用安慰劑對照,納入單項研究的樣本量普遍偏少。

本研究通過網絡藥理學的方法初步篩選出人參-三七作用MI的活性成分有槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇等。心血管疾病的相關研究表明,槲皮素可以抑制心肌梗死模型大鼠白細胞與內皮細胞間黏附,抵抗微小血栓的形成,減少急性MI造成的心肌損傷[26]。還可以顯著改善心肌纖維化大鼠的心功能,降低大鼠心肌組織中轉化生長因子-β(Transforming Growth Factor-β,TGF-β)及結締組織生長因子(Connective Tissue Growth Factor,CTGF)的表達水平,改善心肌的組織形態,減少膠原的沉積,逆轉心肌纖維化[27]。山柰酚可抑制環氧合酶,以及抑制淋巴因子白細胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、IL-1、IL-18和腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)的釋放,起到抗炎的保護作用[28]。β-谷甾醇可以抑制心肌缺血再灌注損傷大鼠的氧化應激反應和炎癥反應,并下調細胞外信號調節激酶1/2(Extracellular Regulated Protein Kinases1/2,ERK1/2)信號通路磷酸化水平減少細胞凋亡從而減輕心肌損傷[29]。豆甾醇可以有效地減少由缺血再灌注損傷引起的神經功能缺損和梗死損傷,改善組織病理學變化[30]。

由人參-三七作用MI的PPI網絡發現,人參-三七作用MI的主要靶點為PTGS2、PTGS1、ADRB2、SCN5A。PTGS2又稱環氧合酶-2是花生四烯酸合成前列腺素的限速酶,能夠促進炎癥反應,參與誘導細胞凋亡和增殖[31]。PTGS1又叫環氧合酶-1,除參與炎癥反應外,還參加很多疾病的病理過程,如疼痛、血栓癥、動脈粥樣硬化、內皮功能紊亂、高血壓、癌癥等[32]。ADRB2激活的下游蛋白激酶A(Protein Kinase A,PKA)能夠負反饋調節ADRB2的磷酸化,這一過程促使ADRB2由親和刺激性G蛋白(Stimulatory Protein,Gs)轉換成親和抑制性G蛋白(Inhibitory G-proteins,Gi)的狀態,且Gi蛋白表達也增高,此時ADRB2可以通過偶聯上調的Gi蛋白并激活下游PI3K-AKT信號通路,抑制心肌細胞凋亡[33]。SCN5A突變與多種疾病有關,如可誘發心律失常、特發性心房顫動、“SCN5A重疊綜合征”等[34]。

KEGG通路富集分析顯示人參-三七作用MI的潛在靶點主要在AGE-RAGE信號通路、PI3K-AKT信號通路、核因子κB信號通路、缺氧誘導因子-1(Hypoxia-Inducible Factor 1,HIF-1)信號通路、cGMP-PKG信號通路等富集。晚期糖基化終末產物與糖基化終末產物受體通過影響動脈粥樣硬化、線粒體功能障礙、氧化應激、鈣穩態和細胞骨架功能來影響心血管疾病的發病機制[35]。PI3K-AKT信號通路參與改善大鼠急性MI后的心功能損傷和減少心肌細胞凋亡,以及通過抑制過度自噬來減輕心肌梗死后期的損傷[36]。核因子κB信號通路的活性直接影響著下游炎癥介質TNF-α、IL-6、IL-8等的表達,從而發揮著調節炎癥的作用[37]。HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β 2個亞基組成的異二聚體轉錄因子。HIF-1α在多種炎癥免疫細胞中高表達,影響免疫細胞的募集、遷移、吞噬、殺傷等,在炎癥發生及消退過程中都發揮重要作用[38]。缺氧狀態下,HIF-1α通過正調控蛋白酶激活受體1的表達,進而改變Bcl-2/Bax的表達比例,誘導H9c2細胞凋亡[39]。cGMP-PKG信號通路可以抑制炎癥介質的釋放,減輕MI后的梗死面積和心肌損傷[40]。

綜上所述,本研究通過網絡藥理學的方法系統闡述了人參-三七作用MI的分子機制,找到了人參-三七治療MI的相關活性成分、作用靶點和信號通路,推測人參-三七主要通過調節線粒體功能、氧化應激、鈣穩態、炎癥反應以及抑制細胞凋亡等來治療MI,為后續的實驗研究提供了堅實的理論基礎和科學依據。

利益沖突聲明:無。