古草生機湯對H22荷瘤小鼠體內抑瘤及免疫調節作用的初步研究

張伊冰 亓煥偉 李家峰 亓煥明 李瀛偉 包永睿,3,4 孟憲生,3,4

(1 遼寧中醫藥大學藥學院,大連,116600; 2 沈陽百草濟世腫瘤醫藥研究中心,沈陽,110041; 3 遼寧省現代中藥研究工程實驗室,大連,116600; 4 遼寧省中藥多維分析專業技術創新中心,大連,116600)

世界衛生組織最新公布的《世界癌癥報告》顯示:2018年,肝癌成為全球第6大常見癌癥和全球第4大常見癌癥致死因素,在亞洲和非洲的年齡標準化發病率高于美國、歐洲和大洋洲[1]。在中國癌癥流行病學的最新報告中,肝癌在全國惡性腫瘤發病率排名第4位,約為26.92/10萬,年發病患者約37萬[2]。

古草生機湯為沈陽百草濟世腫瘤醫藥研究中心研制,由白花蛇舌草、黃藥子、莪術等8味中藥組成,有散結化痞、清瘀消滯、通利排毒等功效,在臨床上用于惡性腫瘤的治療和其他治療方式的聯合用藥,經過多年數百病例觀察均有很好的治療效果。近年來該方劑治療消化系統惡性腫瘤獲得較好療效,在治療肝癌的同時,能夠對肝臟功能、免疫功能起到一定的保護和調節作用,且具有不良反應小等特點,但其藥效評價及具體抗腫瘤機制尚未有詳細報道。本研究為2016、2017年度遼寧省創新團隊研究項目——中藥藥效物質組學及作用機制整合研究中的一部分,旨在通過動物體內模型初步探究臨床有效抗肝癌方劑——古草生機湯的抗癌作用機制。研究基于古草生機湯在臨床應用所取得一定成果的基礎上,探究該方劑對肝癌的抑制作用及分子機制,采用H22肝癌荷瘤小鼠模型,通過免疫器官、瘤體組織顯微結構、血清指標、基因表達等不同層面,應用蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin,HE)染色、酶聯免疫吸附試驗、實時熒光定量PCR等方法對古草生機湯體內抑瘤和免疫調節作用進行藥效學評價,為將來此藥的臨床應用及抗消化系統惡性腫瘤的進一步研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與細胞 實驗動物:無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級昆明種小鼠,8周齡,雄性,體質量為18～22 g(購于遼寧長生生物技術股份有限公司,許可證號SCXK(遼)2015-0001,遼寧中醫藥大學動物實驗倫理號/動物使用許可證號SYXK(遼)2019-0004)。在室溫(23±1)℃、相對濕度55%±5%、12 h/12 h晝夜交替日光燈照射動物房內飼養,攝食、飲水自由的環境中適應1周后,用于實驗。細胞株:H22小鼠肝癌瘤株,購于江蘇齊氏生物科技有限公司。

1.1.2 藥物 古草生機湯(由沈陽百草濟世腫瘤醫藥研究中心提供),環磷酰胺(揚子江藥業集團公司,批號:19032821)。

1.1.3 試劑與儀器 組織固定液(海門市博創實驗器材有限公司,批號:2050354)、肝素鈉(北京索萊寶科技有限公司,批號:1024E026)、1640培養基(Gibco公司,美國,貨號:2058872)、胎牛血清(Gibico公司,美國,貨號:10099-141),腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor,TNF-α)酶聯免疫分析試劑盒(本生健康科技有限公司,貨號:BS-0121)、小鼠γ干擾素(Interferon-γ,IFN-γ)酶聯免疫分析試劑盒(本生健康科技有限公司,貨號:BS-9828),小鼠白細胞介素-2(Interleukin-2,IL-2)酶聯免疫分析試劑盒(本生健康科技有限公司,貨號:BS-2689)、凋亡相關因子(Factor Related Apoptosis,FAS)酶聯免疫分析試劑盒(本生健康科技有限公司,貨號:BS-0009)、小鼠凋亡相關因子配體(Factor Related Apoptosis Ligand,FASL)酶聯免疫分析試劑盒(本生健康科技有限公司,貨號:BS-0723)、天門冬氨酸氨基轉移酶(Aspartate Transferase,AST)酶聯免疫分析試劑盒(本生健康科技有限公司,貨號:BS-1626)、丙氨酸氨基轉移酶(Alaninetransaminase,ALT)酶聯免疫分析試劑盒(本生健康科技有限公司,貨號:BS-5192),RNA提取試劑盒(TransZol Up,北京全式金生物技術有限公司,批號:L30731)、反轉錄試劑盒(Trans Script One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix,北京全式金生物技術有限公司,批號:L10303)、熒光定量PCR試劑盒(Trans Start Top Green qPCR Super Mix,北京全式金生物技術有限公司,批號:L20830)。實驗涉及所有引物委托大連萬澤貿易有限公司技術人員,按照引物中適宜的(G+C)/(A+T)比例進行設計,使退火溫度在60 ℃附近,設計好的引物序列交與生物上海生工生物公司進行合成。CO2培養箱(Millipore公司,美國,型號:W2001R),超純水處理裝置(Millipore公司,美國,型號:Milli-Q)、熒光倒置顯微鏡(NIKON公司,日本,型號:ECLIPSE-TI),酶標儀(Molecular Devices公司,美國,型號:Spectra Max Plus384),微量離心機(Thermo Fisher公司,美國,型號:Sorvall Lengend Mico21)。

1.2 方法

1.2.1 分組與H22荷瘤小鼠動物模型建立 小鼠肝癌H22細胞株用含有1%青鏈霉素和10%胎牛血清的1640培養基,放置于37 ℃、5%CO2、95%相對飽和濕度的培養箱內進行常規培養和傳代,傳代3次后,取對數生長期的細胞進行后續實驗。

取上述對數生長期狀態良好的H22小鼠肝癌細胞,離心棄上清,用磷酸鹽緩沖液(Phosphate-buffered Saline,PBS)吹散調整細胞濃度為1×107個/mL,0.2 mL/只腹腔注射昆明種小鼠體內進行擴增,自由攝食飲水,飼養8 d。在無菌臺下,取生長狀態良好的小鼠脫頸椎處死,75%乙醇消毒腹部,無菌注射器腹腔穿刺,抽吸腹水,得到乳白色濃稠狀腹水,留存備用。將腹水21 000×g離心5 min,棄上清,加PBS吹散離心清洗2次,用PBS調整細胞濃度為1×107個/mL,用于第2代腹水注射。連續傳3代,第3代腹水經臺盼藍拒染法檢測細胞活性,細胞存活率≥95%,備用。取8周昆明種小鼠,將腹水細胞濃度調整為1×107個/mL,0.2 mL/只,注射于小鼠右前肢腋下,密切觀察小鼠變化,2 d后小鼠右前肢腋下可觸摸到鼓起結節,表明造模成功。

隨機將成模小鼠分為空白組、模型組、陽性藥組(環磷酰胺27 mg/kg)、古草生機湯低劑量組(0.75 g/kg)、古草生機湯高劑量組(1.5 g/kg)。

1.2.2 給藥方法 模型組和空白組給予生理鹽水,每只0.2 mL,1次/d,每隔1 d稱量小鼠體質量,共給藥7 d。末次給藥2 h后,禁食不禁水。次日稱量各組小鼠體質量,將小鼠眼眶取血,加入肝素抗凝,靜置30 min后,21 000×g離心10 min,取上層血漿。脫頸椎處死小鼠,除空白組外,其余組解剖,依次剝離取出脾、胸腺、瘤體,分別稱重。

1.2.3 檢測指標與方法 計算各組的抑瘤率、脾臟指數和胸腺指數:抑瘤率%=(1-給藥組平均瘤重/模型組平均瘤重)×100%;脾指數=小鼠脾重量(mg)/小鼠體質量(g)×10;胸腺指數=小鼠胸腺重量(mg)/小鼠體質量(g)×10。

HE染色法評價古草生機湯對H22荷瘤小鼠實體瘤生長情況的影響:將模型組、陽性藥組、古草生機湯低劑量組和古草生機湯高小鼠的瘤體組織放入10%甲醛溶液中固定,經脫水、透明、浸蠟、包埋、切片和貼片,用HE試劑染色封片,顯微鏡下觀察各組瘤組織結構改變、腫瘤細胞密度、腫瘤細胞凋亡及壞死程度。

酶聯免疫吸附試驗法檢測H22荷瘤小鼠血清中IL-2、TNF-α、IFN-γ、Fas、FasL、AST、ALT的含量:按照試劑盒內說明書上的操作制備各組的血漿樣品,對應加入各反應試劑,在酶標儀450 nm下測定吸光度,建立標準曲線,根據標準曲線及各樣品的吸光度,計算出各組小鼠血漿中IL-2、TNF-α、IFN-γ、Fas、FasL、AST、ALT的含量。

熒光實時定量PCR法檢測古草生機湯對Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2-associated X Protein,Bax)和B細胞淋巴瘤(B Cell Lymphoma-2,Bcl-2)mRNA表達的影響:取除空白組外其他組小鼠的瘤體組織,以Transzol法提取總RNA,按照Trans Script One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix反轉錄試劑盒說明書的操作步驟,將提取的總RNA反轉錄成第一鏈cDNA,反應條件為:25 ℃孵育10 min,42 ℃孵育15 min,85 ℃加入5 s使反轉錄酶失活。用Trans Start Top Green qPCR Super Mix試劑盒對目的基因進行擴增,內參基因為β-actin,擴增反應條件:94 ℃加熱30 s,94 ℃加熱5 s、55 ℃加熱15 s、72 ℃加熱10 s重復40次。引物序列為如下。Bax-F:5-AGGATGCGTCCACCAAGAA-3。Bax-R:5-CAAAGTAGAAGAGGGCAACCAC-3-3。Bcl-2-F:5-CAACACTCCCTCTTGACCTATGC-3。Bcl-2-R:5-GAAAATGTTCCCAAGTGAGTTAGA-3。VEGF-F:5-CCCGAATTCTCCTGGTGAGAGATCTGGTT-3。VEGF-R:5-GGGGGATCCGCCTCCGAAACCATGAACTT-3。β-actin-F:5-GTCCCTCACCCTCCCAAAAG-3。β-actin-R:5-GCTGCCTCAACACCTCAACCC-3。

2 結果

2.1 古草生機湯對H22小鼠平均體質量、實體瘤抑瘤率和免疫器官的影響 模型組小鼠給藥期間的平均體質量增長率為3.81%,明顯低于空白組(18.66%);陽性藥組、古草生機湯低劑量組和高劑量組小鼠平均體質量增長率分別為17.31%、14.96%和13.35%,均高于模型組,且差異均有統計學意義(均P<0.01)。見表1,圖1。

圖1 各組小鼠的體質量、抑瘤率、臟器指數注:古-低為古草生機湯低劑量組,古-高為古草生機湯高劑量組;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01

表1 給藥期間各組小鼠平均體質量變化

陽性藥組、古草生機湯低劑量組、高劑量組H22荷瘤小鼠實體瘤的平均重量明顯低于模型組,差異均有統計學意義(均P<0.01)。陽性藥組、古草生機湯低、高劑量組的抑瘤率分別為67.45%、35.11%和47.81%,古草生機湯的抑瘤率與給藥劑量負相關。見表2,圖1。除空白組外各組小鼠瘤體圖片見圖2。陽性藥組和古草生機湯低、高劑量組小鼠瘤體的體積變化規律與計算所得抑瘤率結果相同。

圖2 各組H22荷瘤小鼠的實體瘤注：A.模型組;B.陽性藥組;C.古草生機湯低劑量組;D.古草生機湯高劑量組

圖3 各組H22荷瘤小鼠實體瘤病理切片(HE染色,×200)注：A.模型組;B.陽性藥組;C.古草生機湯低劑量組;D.古草生機湯高劑量組

表2 各組小鼠的抑瘤率

模型組小鼠的胸腺指數為18.62±3.83,低于空白組27.71±6.35;模型組的脾臟指數為47.06±7.04,高于空白組30.20±3.48。陽性藥組和古草生機湯低、高劑量組的胸腺指數為12.30±1.77、24.47±6.07、25.53±4.61;3組的脾臟指數分別為13.80±1.78、36.42±7.23和34.89±4.38。與模型組比較,古草生機湯低、高劑量組能夠明顯提高小鼠的胸腺指數并降低脾臟指數,且其藥效隨藥濃度的增加而增強,差異有統計學意義(P<0.01,P<0.05)。陽性藥小鼠的胸腺指數明顯低于空白組,但脾臟指數明顯降低且遠低于空白組的正常小鼠。

2.2 古草生機湯對H22荷瘤小鼠實體瘤生長情況的影響 從HE染色的病理切片中可以看出,模型組腫瘤細胞排列較緊密,細胞密度大,壞死細胞少見,細胞核較大胞漿較少,細胞間質較少;陽性藥組細胞排列疏松,壞死細胞多見細胞核有中心壞死和破裂,細胞質凝聚固縮;古草生機湯低、高劑量組和模型組比較死亡細胞數量較多,細胞大小各異:古草生機湯低劑量組的結締組織較其他3組更為明顯,古草生機湯高劑量組的細胞間質較低劑量組更大,細胞死亡數量更多。

2.3 古草生機湯對H22荷瘤小鼠血清IFN-γ、TNF-α、IL-2、Fas、FasL、AST、ALT的影響 與空白組比較,模型組小鼠血清中的IFN-γ、TNF-α和IL-2平均含量明顯低于空白組,分別為(283.42±37.88)pg/mL、(231.00±17.35)pg/mL和(170.09±20.71)pg/mL;陽性藥組(383.01±22.17)pg/mL、(374.24±26.21)pg/mL和(335.06±28.37)pg/mL、古草生機湯低劑量組(242.33±32.47)pg/mL、(322.98±25.99)pg/mL和(296.86±19.37)pg/mL、古草生機湯高劑量組(519.28±24.54)pg/mL、(386.66±37.57)pg/mL和(372.91±48.54)pg/mL均高于模型組(均P<0.01)。模型組小鼠血清中肝功能指標AST和ALT的含量為(25.92±0.85)ng/mL和(21.60±0.94)ng/mL,顯著高于空白組;陽性藥組為(20.11±1.80)ng/mL和(17.74±1.28)ng/mL、古草生機湯低劑量組為(21.12±1.76)ng/mL和(17.38±0.91)ng/mL、古草生機湯低劑量組為(19.12±1.30)ng/mL和(16.20±0.69)ng/mL,3個給藥組的肝功能指標均明顯低于模型組(P<0.01)。模型組小鼠血清中Fas和FasL含量為(17.36±1.16)nmol/mL和(10.38±0.90)nmol/mL,明顯高于空白組;陽性藥組為(14.55±0.84)nmol/mL和(8.79±0.77)nmol/mL、古草生機湯低劑量組為(13.03±1.11)nmol/mL和(8.05±0.59)nmol/mL、古草生機湯高劑量組為(12.05±70.78)nmol/mL和(7.32±0.67)nmol/mL,3個給藥組均明顯低于模型組(均P<0.01)。古草生機湯低劑量組升高IFN-γ、TNF-α、IL-2和降低AST的功效明顯高于陽性藥組(P<0.01,P<0.05),古草生機湯高劑量組降低ALT的功效明顯高于陽性藥組(P<0.05),古草生機湯低、高劑量組降低Fas、FasL的功效均明顯高于陽性藥組(P<0.05)。見圖4。

圖4 各組H22荷瘤小鼠血清指標檢測結果注:古-低為古草生機湯低劑量組,古-高為古草生機湯高劑量組;與模型組比較,**P<0.01;與陽性藥組比較,△P<0.05,△△P<0.01

2.4 古草生機湯對H22荷瘤小鼠實體瘤組織中Bax和Bcl-2 mRNA表達的影響 陽性藥組、古草生機湯低劑量組、古草生機湯高劑量組均能夠上調瘤組織中Bax mRNA的表達,下調Bcl-2 mRNA的表達,與模型組比較,差異有統計學意義(P<0.01)。古草生機湯高劑量組的Bax和Bcl-2 mRNA表達量與陽性藥組接近,古草生機湯低劑量組略遜于陽性藥組。見圖5。

圖5 各組H22荷瘤小鼠瘤組織中Bax和Bcl-2mRNA相對表達量注:古-低為古草生機湯低劑量組,古-高為古草生機湯高劑量組;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01

3 討論

肝癌是世界范圍內發病率高、致死率高的一類惡性腫瘤。目前,肝惡性腫瘤的臨床治療方法以手術、化療和放療為主,常用的化療藥物存在一定的不良反應[3],有明顯的細胞毒性,對正常細胞的殺傷力大,容易造成肝腎功能損傷以及多重耐藥等現象[4],且能夠對機體的免疫功能造成不同程度的影響[5]。中藥在治療惡性腫瘤方面具有不良反應小、耐藥性低的特點,還可以在一定程度上保護臟器功能、調節自身免疫、提高患者的生命質量,在惡性腫瘤的臨床治療上有一定的應用前景[6]。

本研究在評價古草生機湯在對抗癌的同時,著重分析其在抗體質量消耗、調節機體免疫、臟器保護等方面的功效。從模型組小鼠較低的體質量增長率可以看出,肝癌對小鼠的體質量影響較大,能夠影響其體質量增長,陽性藥組和古草生機湯低、高劑量組的小鼠體質量增長率均明顯高于模型組,顯示出古草生機湯可在一定程度上抑制肝癌對小鼠體質量的影響。胸腺和脾臟是機體重要的免疫器官,當惡性腫瘤發生和發展時,機體免疫器官會受到嚴重影響并發生明顯的變化,出現胸腺萎縮、脾臟腫大的現象,而且其程度與腫瘤病情發展相關[7]。本實驗通過計算胸腺、脾臟指數來反映各組小鼠的胸腺萎縮、脾臟腫大程度,從所得結果可知,古草生機湯能明顯提高H22荷瘤小鼠的胸腺指數并降低小鼠的脾臟指數,減輕腫瘤對小鼠胸腺、脾臟2個免疫器官的影響。

腫瘤的形成與發展是極為復雜的過程,目前認為細胞外調節因子及細胞內信息系統失控可導致細胞內分子紊亂,從而引起惡變和不可控制的增殖,機體依靠自身的細胞和細胞因子等活性物質調節免疫功能,以起到對腫瘤細胞的監視和特異性殺傷作用[8]。IFN-γ對機體免疫系統具有重要的調節作用,是機體發揮免疫功能、消除體內病原的重要因子之一,對機體的免疫和抑制腫瘤有重要的作用[9]。TNF-α是由T細胞、單核巨噬細胞等產生的細胞因子,是惡性腫瘤微環境中常見且具有一定代表性的細胞因子,能誘導腫瘤細胞凋亡,在調節免疫功能與抗腫瘤免疫中起到重要作用[10]。臨床研究表明,TNF-α水平的異常,對機體內環境的穩定會產生重大影響,可造成患者免疫功能異常,誘導腫瘤的發生及病情的發展[11]。IL-2是機體免疫功能調節的重要細胞因子,能夠促進T細胞的增殖與活化,刺激自然殺傷細胞的增殖,在自然殺傷細胞和T淋巴細胞中同時分泌INF-γ,增強免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷作用[12]。從本實驗結果可知,當肝癌細胞在小鼠體內增長時,模型組小鼠血清中的免疫細胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2均明顯下降,古草生機湯可顯著升高小鼠血清中此3種指標,且其調節作用隨給藥濃度的升高而增強。依此推斷:古草生機湯可通過對機體免疫調節來對抗肝腫瘤的發展。

Fas是細胞表面重要的死亡受體,是細胞凋亡的信號分子。Fas與其FasL結合,活化并轉導凋亡信號,是誘導腫瘤細胞凋亡的重要途徑之一[13]。研究表明,惡性腫瘤患者血清中可溶性Fas和FasL顯著升高,化療后二者明顯降低[14]。本實驗結果與上述研究相同,模型組H22荷瘤小鼠血清中的Fas和FasL顯著升高,陽性藥組和古草生機湯低、高劑量組的Fas和FasL明顯降低。由此可見,古草生機湯能夠在一定程度上調節Fas和FasL,可能是其誘導腫瘤細胞凋亡的作用之一,但具體機制還需要進一步探究和驗證。

當肝臟發生病變時,肝細胞過度合成ALP,通過淋巴管和肝竇進入血液循環。既往研究證實,原發性肝癌小鼠的癌細胞大量增殖過程中,小鼠血清中AST和ALT的含量迅速增加[15]。本實驗中,模型組小鼠血清中的AST、ALT含量較空白組顯著升高;古草生機湯小鼠血清中的AST、ALT含量均明顯降低,由此可見古草生機湯在抗肝癌的同時能夠起到保護小鼠肝臟功能的作用。

Bax為促凋亡基因,Bcl-2為原癌基因之一,是細胞存活促進因子,Bax和Bcl-2通過形成同源或異源二聚體來調節細胞凋亡[16]。當Bax蛋白與自身形成同源二聚體時,可誘導細胞凋亡;當Bax蛋白與Bcl-2蛋白結合形成異源二聚體時,則會抑制Bcl-2蛋白對細胞凋亡的抑制功能[17]。因此,當二者表達水平達到平衡時則細胞正常生存;當Bcl-2的表達量多于Bax,Bcl-2與Bax結合成異源二聚體抑制細胞凋亡[18];當Bcl-2表達量少于Bax,Bax與Bax形成同源二聚體促進細胞凋亡[19]。研究表明,腫瘤細胞能夠通過上調Bcl-2下調Bax從而逃避凋亡[20]。本實驗中,古草生機湯可顯著上調H22荷瘤小鼠腫瘤組織中Bax mRNA的相對表達量,下調Bcl-2的表達量,使Bax的表達量多于Bcl-2,促進腫瘤細胞凋亡,從而發揮抗腫瘤的作用。

綜上所述,本研究初步證實古草生機湯具有一定的體內抗肝腫瘤活性,其作用機制可能與其促進腫瘤細胞凋亡、調節機體免疫有關,且在抑制腫瘤的同時對肝臟功能有一定的保護作用,但其具體機制還需要進一步探究。

利益沖突聲明:無。