六味地黃丸和通絡救腦滴丸對2種癡呆模型小鼠腦組織Aβ降解的影響

賈亞泉 宋軍營 曾華輝 謝治深 張紫娟 袁 永 原 野 張振強 狄 波

(1 河南中醫藥大學中醫藥科學院,鄭州,450046; 2 中國中醫科學院,北京,100700)

癡呆主要以認知和自理能力下降為主要表現,其發病與腎、心、脾、肝等臟腑功能失調密切相關。因腎精生髓通于腦,若腎精虧耗,髓海不足,腦元失養而“腎精不足”致呆;因憂愁思慮,痰蒙心竅,致七情不遂使臟腑功能失調,氣滯血瘀而“毒損腦絡”致呆。本文在此中醫病機理論指導下,以補腎填精,解郁散結治法,采用SAMP8小鼠建立“腎精不足”證癡呆動物模型和SAMR1小鼠雙側海馬區注射Aβ1-40建立“毒損腦絡”證癡呆動物模型,比較2種癡呆模型的差異,通過六味地黃丸和通絡救腦滴丸分別對此2種癡呆癥進行治療,采用免疫印跡法(Western Blotting法)檢測調節腦內Aβ代謝的關鍵蛋白胰島素降解酶(Insulin-degrading Enzyme,IDE)、低密度脂蛋白相關蛋白1(Low-density Lipoprotein Receptor-related Protein 1,LRP1)和晚期糖基化終末產物受體(Receptor for Advanced Glycation end Products,RAGE)的表達,探討六味地黃丸和通絡救腦滴丸對不同擬老年癡呆癥模型小鼠腦組織中Aβ降解的作用特點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級SAMP8小鼠,雄性,32周齡,48只;SPF級SAMR1小鼠,雄性,32周齡,68只,購自北京華阜康實驗動物有限公司,生產許可證號:SCXK(京)2020-0004。動物購回后飼養于河南中醫藥大學動物實驗中心,使用許可證號:SYXK(豫)2021-0015,期間自由飲食,飼養溫度控制在(22±1)℃,相對濕度(45±5)%,照明每12 h明暗交替1次。本實驗通過河南中醫藥大學實驗動物福利倫理委員會審查批準(倫理審查號:DWLL201911028)。

1.1.2 藥物 六味地黃丸(河南宛西制藥股份有限公司,批號:18110401)、通絡救腦滴丸(由梔子、三七組成,具有解營衛之毒、活血通絡之功效,天津紅日藥業股份有限公司,批號:090603);鹽酸多奈哌齊片(衛材藥業有限公司,批號:1701069)。

1.1.3 試劑與儀器 Aβ1-40(Sigma,德國,貨號:A1075),Aβ抗體(Abcam,英國,貨號:Ab11132),IDE抗體(Abcam,英國,貨號:Ab25970),RAGE抗體(Abcam,英國,貨號,Ab37647),LRP1抗體(Epitomics,美國,貨號:2703-1),抗β-Actin鼠單克隆抗體(北京康為世紀生物科技有限公司,貨號:CW1313),DAB試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司,貨號:CW0211),UltraSensitive S-P(Goat)(福州邁新生物技術開發有限公司,貨號:KIT-9709),放射免疫沉淀測定(Radio Immunoprecipitation Assay,RIPA)裂解液(上海碧云天生物科技有限公司,貨號:P0013B),二辛可寧酸(Bicinchoninic Acid,BCA)蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司,貨號:P0012)。小動物腦立體定位儀(深圳市瑞沃德生命科技有限公司,型號:68003)、Morris水迷宮檢測系統(深圳市瑞沃德生命科技有限公司,型號:63031),超聲細胞破碎儀(Sonics,美國,型號:VCX130),電泳儀、轉膜儀、凝膠成像儀(Bio-rad,美國,型號:P3000),電子天平(上海精密儀器儀表有限公司,型號:YP600),全自動酶標儀(Thermo,美國,型號:MK3),光學顯微鏡(Leica,德國,型號:DM500B)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

1.2.1.1 分組 SAMR1小鼠分為空白對照組(N組)12只;模型一組(A組)、陽性對照組(AY組)、六味地黃丸組(AL組)和通絡救腦滴丸組(AT組),每組14只。SAMP8小鼠分為模型二組(P組)、陽性對照組(PY組)、六味地黃丸組(PL組)和通絡救腦滴丸組(PT組),每組12只。

1.2.1.2 雙側海馬注射Aβ1-40動物模型制備 動物適應性喂養5 d后對SAMR1小鼠除空白對照組進行造模。造模前12 h對動物進行禁食不禁水處理。動物麻醉后,將動物腹位固定在腦立體定位儀上,剃除頭頂部手術區毛發,用碘伏消毒后做0.5 cm左右縱向切口,參照大鼠腦立體定位圖譜在前囟后2.3 mm,中線左右各1.8 mm,用牙科鉆鉆開顱骨,暴露硬腦膜,用微量進樣針自腦表面進針2 mm,每側注射Aβ1-40溶液0.5 μL,進樣時間3 min,注射后留針3 min,之后用1 min時間緩慢撤針,肌內注射青霉素G 10萬U/d,連續注射3 d,常規飼養。

1.2.2 給藥方法 參照《中藥藥理實驗方法》計算給藥量,六味地黃丸(LWDH)3.333 g/(kg·d)、通絡救腦滴丸(TLJN)0.618 g/(kg·d)、鹽酸多奈哌齊片(YSDNPQ)1.667 mg/(kg·d),每天所需藥量溶于1 mL去離子水中。Aβ1-40溶液的配制:將Aβ1-40溶于無菌生理鹽水,參照Prediger的實驗配置,使1 μL溶液含有400 pmol的Aβ1-40,將溶液在37 ℃恒溫水浴中孵育4 d備用。在造模成功后第2天開始,每天早、晚8點各1次進行灌胃給藥,每次灌胃量根據動物體質量計算給藥體積。其中,N組、A組、P組給予等量去離子水,AL組、PL組給予六味地黃丸溶液,AT組、PT組給予通絡救腦滴丸溶液,AY組、PY組給予鹽酸多奈哌齊片,連續給藥14 d。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 行為學測試 1)Morris水迷宮實驗:各組動物均于A模型造模后第15天適應性游泳60 s。第16天起正式測試,先將動物放在平臺上適應10 s進行空間定位。動物放入水中后,軟件開始計時,從入水到找到平臺所需的時間為逃避潛伏期。在60 s內找到平臺并停留超過2 s者為尋的成功,其潛伏期為實際所用時間;否則為尋的失敗,其潛伏期為60 s。每次測試后將動物再次放置在平臺上適應10 s。每只動物從未放置平臺的3個象限依次測試1次,連續測試3 d。2次測試間隔3 h。每天動物測試順序、入水象限、測試時段保持一致。2)避暗實驗:水迷宮實驗結束后第2天進行,電刺激30 V。避暗實驗第1天,將小鼠放到明室自由活動,當小鼠進入暗室時,關閉明暗室之間的通道門,同時暗室通電,電刺激小鼠5 s后取出。24 h后將小鼠再次放入明室,測試時間5 min。從測試開始到小鼠第1次進入暗室的時間為避暗潛伏期,測試期間進入暗室的次數為錯誤次數,在暗室停留的時間為錯誤區時間。

1.2.3.2 免疫組化法檢測海馬與皮層Aβ的表達情況 行為學檢測結束后,將小鼠快速斷頭處死,在冰上取出全腦,除去小腦,投入4%多聚甲醛溶液固定24 h后取出,常規脫水,石蠟包埋切片,片厚6 μm。常規脫蠟脫水,用3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶,熱修復抗原,滴加5%BSA封閉液,室溫20 min,滴加1∶100稀釋的一抗,4 ℃孵育過夜。滴加二抗37 ℃溫箱孵育20 min,滴加SABC,37 ℃溫箱20 min,DAB顯色,蘇木精復染,常規脫水封片。顯微鏡下觀察拍照,采用Image-Pro-Plus 7.0圖像分析系統測其平均光密度值。

1.2.3.3 Western Blotting法檢測海馬和皮層IDE、LRP1、RAGE等蛋白的表達情況 在冰盤上快速取出小鼠全腦,分離雙側海馬及皮層,提取總蛋白,定量。取總蛋白樣品25 μg,經SDS-PAGE電泳后,轉膜,放入37 ℃恒溫搖床,60 r/min,封閉1 h。將膜浸入用封閉液稀釋的一抗(IDE 1∶200、LRP1和RAGE 1∶1 000),4 ℃恒溫搖床,60 r/min孵育。TBST洗膜3次。將膜浸入用封閉液稀釋的二抗(1∶10 000),37 ℃恒溫搖床,60 r/min,孵育1 h。TBST洗膜3次。滴加ECL后放入暗盒曝光,掃描圖片,Image J分析軟件比較灰度值。

2 結果

2.1 LWDH和TLJN對2種模型小鼠行為功能學的影響

2.1.1 MWM逃避潛伏期的組間比較 與N組比較,2種模型組訓練各天的逃避潛伏期均明顯延長,差異有統計學意義(P<0.01);2種模型各觀察組逃避潛伏期均隨訓練天數的增加而縮短,與N組比較,差異有統計學意義(P<0.05,P<0.01);AL組、AT組與A組比較,訓練各天逃避潛伏期均縮短,差異有統計學意義(P<0.05),但AL組與AT組比較,差異無統計學意義(P>0.05);PL組與P組比較,從訓練第2天起逃避潛伏期縮短,差異有統計學意義(P<0.05),但與PT組比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 各組小鼠的逃避潛伏期注：與N組比較,*P<0.05,**P<0.01;與各自模型比較,△P<0.05

2.1.2 MWM尋臺成功率的組間比較 與N組比較,兩模型各組尋臺成功率均明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05,P<0.01),但各組隨訓練天數的增加尋臺成功率均有提高趨勢;與A組比較,AL組訓練各天尋臺成功率均提高,差異有統計學意義(P<0.05)。AL組和AT組之間差異無統計學意義;與P組比較,PL組從訓練第2天起尋臺成功率提高,差異有統計學意義(P<0.05,P<0.01)。與PT組比較,PL組訓練各天的尋臺成功率均較高,至第3天差異有統計學意義(P<0.01)。見圖2。

圖2 各組小鼠的尋臺成功率注：與N組比較,*P<0.05,**P<0.01;與各自模型比較,△P<0.05,△△P<0.01;與PT比較,▲▲P<0.01

2.1.3 MWM平均游速的組間比較 與N組比較,A模型各組游速差異無統計學意義(P>0.05);但P模型各組游速差異均有統計學意義(均P<0.01)。A模型與P模型組間游速差異有統計學意義(P<0.01)。見圖3。

圖3 各組小鼠的游速注：與N組比較,**P<0.01;2種模型之間,與A組比較,△△P<0.01

2.1.4 避暗實驗結果分析 2種模型各組的避暗潛伏期均明顯縮短,與N組比較,差異有統計學意義(P<0.01);單模型間,A模型中AT組與A組、AY組和AL組比較避暗潛伏期延長,差異均有統計學意義(均P<0.05);P模型中PL組與P組、PY組和PT組比較避暗潛伏期延長,差異有統計學意義(P<0.05,P<0.01)。見圖4。

圖4 各組小鼠的避暗潛伏期注：與N組比較,**P<0.01;與各自模型(A組/P組)比較,△P<0.05;與AL組比較,▲P<0.05;與PT組比較,□□P<0.01

2種模型各組的避暗錯誤次數有所增加,與N組比較,A組、AL組、P組和PT組錯誤次數增加,差異均有統計學意義(均P<0.05);單模型內,A模型中觀察組與模型組比較,避暗錯誤次數均有不同程度減少,差異有統計學意義(P<0.01,P<0.05);P模型中觀察組與模型組比較,避暗錯誤次數有減少趨勢,差異無統計學意義(P>0.05);P組與A組比較,避暗錯誤次數減少,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖5。

圖5 各組小鼠的避暗錯誤次數注：與N組比較,*P<0.05,**P<0.01;與各自模型(A組/P組)比較,△P<0.05,△△P<0.01;2種模型之間,與A組比較,▲P<0.05

2種模型各組的避暗錯誤區時間均增加,與N組比較,僅A組避暗錯誤區時間增加,差異有統計學意義(P<0.01);單模型間,A模型中觀察組與模型比較,避暗錯誤區時間減少,差異有統計學意義(P<0.01);P模型中各組避暗錯誤區時間差異無統計學意義(P>0.05);P組與A組比較,避暗錯誤區時間減少,差異有統計學意義(P<0.01)。見圖6。

圖6 各組小鼠的避暗錯誤區時間注：與N組比較,**P<0.01;與各自模型(A組/P組)比較,△△P<0.01;2種模型之間,與A組比較,▲▲P<0.01

2.2 LWDH和TLJN對2種模型小鼠腦組織皮層和海馬Aβ的影響 在皮層和海馬組織中,N組神經元形態完整,排列整齊,無明顯Aβ陽性染色。A組、P組均可見少量Aβ陽性斑塊,膠質細胞增生。A模型和P模型的各觀察組Aβ陽性斑塊有不同程度減少。見圖7。

圖7 各組小鼠腦組織海馬與皮層Aβ的表達情況

在皮層組織中,僅A組Aβ蛋白表達與N組有不同程度增多,差異有統計學意義(P<0.05)。在海馬組織中,除PL組外,其余各組Aβ蛋白表達與N組均有不同程度增多,差異有統計學意義(P<0.05,P<0.01)。與PT組比較,PL組海馬Aβ蛋白表達降低,差異有統計學意義(P<0.01)。見圖8。

圖8 各組小鼠腦組織皮層和海馬中Aβ的表達水平注：與N組比較,*P<0.05,**P<0.01;與各自模型(A組/P組)比較,△△P<0.01;與PT組比較,▲▲P<0.01

2.3 LWDH和TLJN對2種模型小鼠腦組織皮層和海馬IDE的影響 與N組比較,A組皮層、海馬IDE表達升高,差異有統計學意義(P<0.01,P<0.05);P組皮層、海馬IDE表達有降低趨勢,但差異無統計學意義(P>0.05)。

經不同藥物治療后,AT組海馬IDE表達降低至與N組無差異,且明顯低于A組(P<0.01);AT組與AL組比較,海馬組織IDE蛋白表達降低,差異有統計學意義(P<0.01);PL組皮層、海馬IDE表達均明顯升高,與N組、P組比較,差異有統計學意義(P<0.01);PL組與PT組比較,皮層、海馬組織IDE蛋白表達均升高,差異有統計學意義(P<0.01)。

2種模型之間,與A組比較,P組皮層和海馬IDE蛋白表達差異有統計學意義(P<0.01)。見圖9～10。

圖9 各組小鼠腦組織皮層和海馬中IDE的表達水平注：與N組比較,*P<0.05,**P<0.01;與各自模型(A組/P組)比較,△△P<0.01;與AL比較,▲▲P<0.01;與PT比較,□□P<0.01;2種模型之間,與A組比較,■■P<0.01

圖10 Western Blotting法檢測各組皮層和海馬IDE表達情況

2.4 LWDH和TLJN對2種模型小鼠腦組織皮層和海馬LRP1的影響 與N組比較,A組皮層LRP1表達降低,差異有統計學意義(P<0.01),而海馬LRP1表達升高,差異有統計學意義(P<0.01);P組皮層、海馬LRP1表達均降低,差異有統計學意義(P<0.01)。

經不同藥物治療后,AL組與AT組皮層、海馬LRP1表達均比A組降低,差異有統計學意義(P<0.01,P<0.05);與AL組比較,AT組皮層LRP1表達升高,差異有統計學意義(P<0.01);PL組皮層、海馬LRP1表達均升高,與P組比較,差異有統計學意義(P<0.01)。與PT組比較,PL組皮層、海馬LRP1表達均有不同程度升高,差異均有統計學意義(均P<0.01)。2種模型之間,與A組比較,P組海馬LRP1蛋白表達差異有統計學意義(P<0.01)。見圖11～12。

圖11 各組小鼠腦組織皮層和海馬中LRP1的表達水平注：與N組比較,**P<0.01;與各自模型(A組/P組)比較,△P<0.05,△△P<0.01;與AL比較,▲▲P<0.01;與PT組比較,□□P<0.01;2種模型之間,與A組比較,■■P<0.01

2.5 LWDH和TLJN對2種模型小鼠腦組織皮層和海馬RAGE的影響 與N組比較,A組與P組皮層、海馬RAGE表達均升高,差異均有統計學意義(均P<0.01)。經不同藥物治療后,AT組海馬RAGE表達降低,與A組比較,差異有統計學意義(P<0.01)。AT組與AL組比較,海馬RAGE表達降低,差異有統計學意義(P<0.01)。PL組皮層、海馬RAGE表達降低,與P組比較,差異有統計學意義(P<0.01),但皮層RAGE表達降低至與N組無差異;PL組與PT組比較,皮層RAGE表達降低,差異有統計學意義(P<0.05)。2種模型之間,P組與A組比較,皮層和海馬RAGE蛋白表達均更高,差異有統計學意義(P<0.01,P<0.05)。見圖12～13。

圖12 Western Blotting法檢測各組皮層和海馬LRP1表達情況

圖13 各組小鼠腦組織皮層和海馬中RAGE蛋白的表達水平注：與N組比較,**P<0.01;與各自模型(A組/P組)比較,△P<0.05,△△P<0.01;與AL組比較,▲▲P<0.01;與PT組比較,□P<0.05;2種模型之間,與A組比較,■P<0.05,■■P<0.01

圖14 Western Blotting法檢測各組皮層和海馬RAGE表達情況

3 討論

癡呆是一種隨著年齡增長、病情不斷加重的神經退行性疾病[1],歷代醫家認為腎精虧損,腦髓化生不足為其主要病因,臨床上以益精填髓為主要治法[2]。Aβ1-40通過損傷細胞器及細胞骨架而對神經細胞產生毒性作用,引起海馬前炎癥介質表達增多、氧化反應增強,觸發AD病變級聯反應,引發空間記憶障礙,學習記憶能力減退[3]。SAMP8小鼠是快速老化小鼠品系中的一個亞系,主要以學習、記憶障礙為主要特征,是目前公認的自然衰老癡呆模型[4]。本實驗通過雙側海馬注射Aβ1-40和自然飼養至32周齡的SAMP8小鼠復制癡呆動物模型,與空白對照組比較,2種模型組小鼠的逃避潛伏期明顯延長,尋臺成功率降低,避暗潛伏期縮短,說明2種模型小鼠均出現了癡呆癥狀。且雙側海馬注射Aβ1-40模型組和32周齡SAMP8小鼠在實驗過程中均死亡了2只,兩模型組間差異無統計學意義。

現代醫學研究表明,生理條件下外周和中樞內Aβ水平保持平衡[5]。若腦內Aβ清除功能下降,導致Aβ在腦內堆積,則引發突觸功能異常、神經元凋亡等多種病理反應[6]。IDE在清除腦內Aβ的過程中起重要作用,其表達升高與Aβ斑塊減少有直接關系[7]。LRP1是低密度脂蛋白受體家族成員之一,LRP1通過與Aβ直接結合,或通過LRP1配體與Aβ結合后,將腦內Aβ轉運至血液[8-10]。RAGE是一種多功能受體,屬免疫球蛋白超家族,廣泛分布于內皮細胞、單核巨噬細胞、神經元及小膠質細胞等表面,是BBB上將Aβ從血液轉運入腦組織的主要受體[11-14],與LRP1是一對作用相反的蛋白。BMECs細胞膜上的RAGE與Aβ結合后,可促使Aβ穿過BBB后在腦內積聚[15],并激活小膠質細胞,產生氧化應激反應,生成ROS,促進凋亡,同時促進炎癥介質的表達,引起炎癥反應[16-18]。另外,神經元和小膠質細胞上的RAGE也可與Aβ結合,激活小膠質細胞,引發AD相關病理過程[19-21]。

本研究結果表明,2種模型在神經行為學的水迷宮游速、避暗實驗錯誤次數、錯誤區時間等活動度相關指標,和腦組織海馬和皮層中IDE、RAGE和海馬中LRP1等蛋白的表達上,差異均有統計學意義(均P<0.05)。SAMP8模型小鼠的水迷宮游速和避暗錯誤次數下降,腦組織中RAGE表達升高,IDE和LRP1表達降低,反映了腎虛精乏證模型的Aβ代謝障礙更嚴重。給予LWDH和TLJN治療后,TLJN對改善雙側海馬注射Aβ1-40模型小鼠的避暗潛伏期、腦組織海馬區IDE和RAGE的表達水平作用明顯,而LWDH對上述指標的調節作用不如TLJN;LWDH對改善SAMP8模型小鼠水迷宮尋臺成功率、避暗潛伏期、腦組織皮層和海馬區IDE表達和海馬Aβ的表達水平,發揮了顯著作用,而TLJN對上述指標的調節作用不如LWDH。由此說明,六味地黃丸可改善“腎精不足”癡呆模型動物腦組織Aβ清除障礙,通絡救腦滴丸可改善“毒損腦絡”癡呆模型動物腦組織Aβ清除障礙,而非對癥治療未發揮顯著改善作用,甚至還有反作用。通過以方測證,證明了SAMP8小鼠作為“腎精不足”證和雙海馬注射Aβ1-40小鼠作為“毒損腦絡”證的癡呆模型。

利益沖突聲明:無。