青蒿素對(duì)高果糖誘導(dǎo)的小鼠脂質(zhì)代謝紊亂血清代謝組學(xué)研究

李夢(mèng)婷 董李晉川 陳 穎 張 紅 楊紫玉 楊 慶 劉 麗 閆思超 蔡維艷 李 琦 翁小剛 王婭杰 朱曉新

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所,北京,100700)

隨著食品工業(yè)的快速發(fā)展,在過(guò)去的40年中果糖消耗量急劇增加,高果糖玉米糖漿以其廉價(jià)、甜度高的優(yōu)勢(shì)常用于飲料等食品加工領(lǐng)域[1]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)富含果糖的高熱量飲食方式是多種疾病產(chǎn)生的重要原因之一,如果糖攝入過(guò)多可導(dǎo)致代謝綜合征和非酒精性脂肪肝,還可能會(huì)誘發(fā)高血壓、痛風(fēng)等疾病[2-5],出現(xiàn)血壓升高、高密度脂蛋白水平降低、三酰甘油水平升高和高血糖等癥狀[6]。10%果糖水長(zhǎng)期喂飼可導(dǎo)致小鼠的血糖升高、血脂代謝紊亂和葡萄糖耐受不良等異常[7],并且引起小鼠腸道微生物群組成改變,腸上皮屏障受損以及海馬神經(jīng)炎癥反應(yīng)[8]。

青蒿素是由本研究所的屠呦呦團(tuán)隊(duì)從菊科植物黃花蒿ArtemisiaannuaL.提取的含過(guò)氧橋的倍半萜內(nèi)酯類化合物,是治療腦型瘧、惡性瘧的特效藥[9]。近年來(lái),青蒿素類藥物在抗腫瘤、免疫疾病、抗炎等方面表現(xiàn)出顯著作用[10-12]。如青蒿琥酯能夠具有降血脂作用,可降低患高脂血癥兔的血漿膽固醇和三酰甘油[13]。蒿甲醚能夠顯著改善2型糖尿病小鼠體內(nèi)葡萄糖穩(wěn)態(tài)和胰島素抵抗[14]。由此可見,青蒿素類藥物具有改善肥胖相關(guān)代謝紊亂,調(diào)節(jié)糖脂代謝的潛能[15]。但針對(duì)青蒿素干預(yù)高果糖飲食小鼠血清代謝組學(xué)的研究未見報(bào)道。本文旨在通過(guò)研究飲食果糖小鼠及青蒿素干預(yù)后小鼠代謝物的變化,探討青蒿素改善高果糖引起的小鼠代謝紊亂的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 40只2周齡斷乳雄性C57BL/6J小鼠,體質(zhì)量8～10 g,購(gòu)自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2019-0010。動(dòng)物飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所動(dòng)物室SYXK(京)2016-0021,SPF環(huán)境,溫度為(25±2)℃,相對(duì)濕度為(50±15)%,明暗周期12 h,自由飲水、攝食。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用遵守3R原則。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分獲得中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院基礎(chǔ)理論研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(倫理審批號(hào):20190722058)。

1.1.2 藥物 青蒿素(浙江海正藥業(yè)饋贈(zèng),批號(hào):S181121),用羧甲基纖維素鈉水溶液配制為5 mg/mL溶液;二甲雙胍(中美上海施貴寶制藥有限公司,批號(hào):ABG0233),用羧甲基纖維素鈉水溶液配制為20 mg/mL溶液。

1.1.3 試劑與儀器 葡萄糖(Glucose,GLU)測(cè)試盒(上海榮盛生物藥業(yè)有限公司,批號(hào):20201104037),三酰甘油(Triacylglycerol,TG)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所,貨號(hào):A110-1-1),總膽固醇(Total Cholesterol,T-CHO)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所,貨號(hào):A111-1-1),低密度脂蛋白膽固醇(Low-density Lipoprotein Cholesterol,LDL-C)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所,貨號(hào):A113-1-1),高密度脂蛋白膽固醇(High-density Lipoprotein Cholesterol,HDL-C)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所,貨號(hào):A112-1-1),普通飼料(南通特洛菲飼料科技有限公司,貨號(hào):LAD0011),標(biāo)準(zhǔn)熱量型35%高果糖模型飼料(南通特洛菲飼料科技有限公司,貨號(hào):TP04103),UHPLC-Q-TOF-MS/MS(AB SCIEX,美國(guó),型號(hào):Triple TOF 5600),高速離心機(jī)(Eppendorf,德國(guó),型號(hào):Centrifuge 5424R)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為4組,每組10只,分別飼喂標(biāo)準(zhǔn)飲食(正常組)或35%高果糖飲食(模型組、青蒿素組、二甲雙胍組),正常飲水。

1.2.2 給藥方法 從第9周開始,青蒿素組小鼠的給藥劑量為0.1 mL/10 g,二甲雙胍組小鼠的給藥劑量為0.1 mL/10 g,1次/d,連續(xù)灌胃6周。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,每周記錄1次體質(zhì)量。連續(xù)灌胃6周后,將小鼠禁食過(guò)夜,用戊巴比妥鈉麻醉(50 mg/kg)后取血,全血在573×g下離心10 min,分離血清,儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1 小鼠血糖 取實(shí)驗(yàn)小鼠血清,血糖、三酰甘油、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白及總膽固醇濃度用標(biāo)準(zhǔn)診斷試劑盒檢測(cè)。

1.2.3.2 超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法分析 1)血清樣本處理:取實(shí)驗(yàn)小鼠血清樣品100 L,加入400 L預(yù)冷甲醇乙腈溶液(1∶1,v/v),渦旋60 s,于-20 ℃放置1 h沉淀蛋白,在4 ℃下17 968×g離心20 min,取上清冷凍,-80 ℃保存樣本。2)色譜條件:采用Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色譜(Ultra High Performance Liquid Chromatography,UHPLC)HILIC色譜柱,流動(dòng)相A:水+25 mmol/L乙酸銨+25 mmol/L氨水,流動(dòng)相B:乙腈。梯度洗脫程序:0～1 min,95%B;1～14 min,95%～65%B;14～16 min,65%～40%B;16～18 min,40%B;18～18.1 min,40%～95%B;18.1～23 min,95%B。流速0.3 mL/min,柱溫25 ℃。3)質(zhì)譜條件:分別采用電噴霧電離(Electrospray Ionization,ESI)正離子和負(fù)離子模式進(jìn)行檢測(cè),Triple TOF 5600質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。ESI源參數(shù)如下:霧化氣(Gas1)為60 psi,輔助氣(Gas2)為60 psi,氣簾氣(CUR)為30 psi。溫度:600 ℃。噴霧電壓(ISVF)±5 500 V(正負(fù)2種模式)。TOF MS掃描范圍:60～1 000 Da。product ion掃描范圍:25～1 000 Da。TOF MS采樣速率為0.20 s/spectra,product ion采樣速率為0.05 s/spectra。二級(jí)質(zhì)譜采用信息相關(guān)獲取(Information Dependent Acquisition,IDA)獲得,并且采用High Sensitivity模式,去簇電壓(Declustering Potential,DP):±60 V(正負(fù)2種模式),碰撞能:35±15 eV,IDA設(shè)置如下:Exclude Isotopes within 4 Da,Candidate Ions to Monitor per cycle:6。4)數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì):原始數(shù)據(jù)經(jīng)ProteoWizard轉(zhuǎn)換成.mzXML格式,然后采用XCMS程序進(jìn)行峰對(duì)齊、保留時(shí)間校正和提取峰面積。代謝物結(jié)構(gòu)鑒定采用精確質(zhì)量數(shù)匹配(<25百萬(wàn)分比濃度)和二級(jí)譜圖匹配的方式,檢索實(shí)驗(yàn)室自建數(shù)據(jù)庫(kù)。數(shù)據(jù)經(jīng)Pareto-scaling預(yù)處理后,進(jìn)行多維統(tǒng)計(jì)分析,包括無(wú)監(jiān)督主成分分析(Unsupervised Principal Component Analysis,UPCA)和正交偏最小二乘法判別分析(Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis,OPLS-DA),OPLS-DA以VIP>1和P value<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn),模型組與正常組、給藥組之間進(jìn)行比較。單維統(tǒng)計(jì)分析包括Student′s t-test和變異倍數(shù)分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體質(zhì)量與血糖水平 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各組小鼠體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。模型組小鼠血清中葡萄糖、總膽固醇、高密度脂蛋白含量顯著上升,三酰甘油含量升高;青蒿素組與模型組比較血清三酰甘油顯著降低;各組之間低密度脂蛋白差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果表明,模型組小鼠出現(xiàn)糖脂代謝紊亂,表現(xiàn)為高血糖及高三酰甘油血癥,青蒿素顯著改善了模型小鼠血清的三酰甘油水平。見圖2。

圖1 各組小鼠體質(zhì)量變化

圖2 各組小鼠血糖血脂水平注:與正常組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較,△P<0.05,△△P<0.01

2.2 代謝輪廓分析 采用XCMS軟件對(duì)代謝物離子峰進(jìn)行提取,并將正常組(C)、模型組(M)、青蒿素組(ART)、QC組樣本提取到的峰經(jīng)Pareto-scaling得到PCA模型。正離子模式(Positive Ion Mode,POS)和負(fù)離子模式(Negative Ion Mode,NEG)下QC樣本PCA得分圖見圖3。

圖3 正、負(fù)離子模式下樣本的PCA得分

OPLS-DA常用于差異代謝物的篩選,正常組與模型組OPLS-DA得分:正離子模式R2=0.991、Q2=0.789,負(fù)離子模式R2=0.996、Q2=0.939。青蒿素組與模型組OPLS-DA得分:正離子模式R2=0.996、Q2=0.434,負(fù)離子模式,R2=0.977、Q2=0.635。見圖4。

圖4 正、負(fù)離子模式下模型組與正常組、青蒿素組與模型組的OPLS-DA得分

2.3 差異代謝物分析 根據(jù)OPLS-DA模型篩選標(biāo)準(zhǔn)選出87個(gè)具有顯著性差異的代謝物,模型組與正常組共66個(gè)差異代謝物,給藥組與模型組共32個(gè)差異代謝物。見表1。

與對(duì)照組比較,模型組亞油酸、順式-9,10-環(huán)氧硬脂酸、3-吲哚丙酸、2,3-二羥基丙基(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯酸酯、1-硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿的水平顯著降低;棕櫚酸、D-喹諾酮糖、α-酮異戊酸、愈傷酸、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿、花生四烯酸(不含過(guò)氧化物)、L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯的水平顯著升高。

青蒿素使亞油酸、順式-9,10-環(huán)氧硬脂酸、3-吲哚丙酸、2,3-二羥基丙基(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯酸酯,1-硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿的含量進(jìn)一步下降；花生四烯酸(不含過(guò)氧化物)、L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯的含量進(jìn)一步升高。與模型組比較，青蒿素顯著下調(diào)了棕櫚酸、D-喹諾酮糖、α-酮異戊酸、愈傷酸、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿的水平。

2.4 差異代謝物京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析 對(duì)上述差異代謝物進(jìn)行KEGG通路富集分析,結(jié)果表明,高果糖喂養(yǎng)的模型小鼠亞油酸代謝,蛋白質(zhì)的消化吸收,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成等重要通路發(fā)生了顯著變化(均P<0.01)。青蒿素組與模型組之間主要涉及脂質(zhì)代謝類通路改變,其中包括脂肪酸生物合成、不飽和脂肪酸生物合成、亞油酸代謝等重要通路(均P<0.01)。見圖5～6,表2。

表2 模型組與正常組,青蒿素組與模型組差異通路

圖5 模型組與正常組KEGG通路富集分析

圖6 青蒿素組與模型組KEGG通路富集分析

3 討論

飲食高果糖動(dòng)物模型目前主要用于研究脂質(zhì)代謝、降糖作用及炎癥反應(yīng)[16]。果糖的大量攝入可增加參與脂肪生成和炎癥反應(yīng)途徑的酶和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá),可導(dǎo)致果糖誘導(dǎo)的代謝綜合征[17],改變了葡萄糖代謝、胰島素敏感性和血脂濃度[16]。果糖主要被肝臟攝取代謝[18],不受到限速酶限制,不通過(guò)胰島素調(diào)控[19]。研究表明,果糖在肝臟中轉(zhuǎn)化為三酰甘油,大量進(jìn)入血液循環(huán),長(zhǎng)期的過(guò)量攝入可引起腦部的胰島素抵抗,導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)的能量代謝失衡和神經(jīng)炎癥反應(yīng),從而神經(jīng)突觸可塑性降低[20]。本實(shí)驗(yàn)中喂飼高果糖飲食15周,與正常飲食組比較,小鼠體質(zhì)量未發(fā)現(xiàn)明顯變化;但是高果糖飲食可使小鼠血糖及血清三酰甘油、高密度脂蛋白膽固醇升高。長(zhǎng)期的高果糖飲食可引起嚙齒類動(dòng)物的認(rèn)知功能損傷和學(xué)習(xí)記憶障礙[21];高脂高果糖喂養(yǎng)的動(dòng)物腦部小膠質(zhì)細(xì)胞被激活[22]。果糖通過(guò)誘導(dǎo)大鼠腦組織中果糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子5(GLUT5)進(jìn)而誘導(dǎo)產(chǎn)生中樞炎癥反應(yīng)[17]。高果糖攝入引起海馬和背側(cè)海馬分子層白細(xì)胞介素-1b的顯著增加[23]。我們前期也發(fā)現(xiàn)青蒿素及其衍生物可通過(guò)直接調(diào)節(jié)中樞炎癥反應(yīng)過(guò)程和抑制炎癥反應(yīng)用于治療神經(jīng)炎癥[24-25],有助于保護(hù)海馬細(xì)胞,下調(diào)炎癥反應(yīng)信號(hào)通路,降低了炎癥介質(zhì)的釋放[26];通過(guò)調(diào)節(jié)腸道免疫反應(yīng)和循環(huán)炎癥介質(zhì)間接調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥反應(yīng)。今后研究我們也將關(guān)注長(zhǎng)期高果糖飼養(yǎng)小鼠是否會(huì)具有炎性改變,青蒿素及其衍生物是否有可能通過(guò)調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng),抑制炎癥反應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

在本研究中高果糖誘導(dǎo)的小鼠模型,青蒿素干預(yù)后可降低模型小鼠血清三酰甘油水平,對(duì)血糖、膽固醇水平?jīng)]有影響。為深入研究青蒿素對(duì)高果糖飲食誘導(dǎo)的小鼠血清代謝物的變化,我們對(duì)小鼠血清進(jìn)行代謝輪廓分析,正、負(fù)離子模式下QC樣本緊密聚集在一起,表明分析方法重復(fù)性好;正、負(fù)離子模式下正常組與模型組、青蒿素組與模型組達(dá)到了很好的分離,證明模型穩(wěn)定,可用于下一步差異代謝物分析。根據(jù)單變量統(tǒng)計(jì)分析篩選差異代謝物,青蒿素干預(yù)后主要涉及脂肪酸類成分的變化。對(duì)差異代謝物進(jìn)行KEGG通路富集,發(fā)現(xiàn)高糖飲食能夠引起小鼠脂肪酸、甘油磷脂、苯甲酸及其衍生物、糖醇、吡啶及其衍生物、異黃酮、氨基酸等相關(guān)代謝物水平變化;而青蒿素能夠回調(diào)α-酮異戊酸、愈傷酸、順式-9-棕櫚油酸等差異代謝物。α-酮異戊酸是一種具有興奮性神經(jīng)毒性的支鏈氨基酸代謝物,使中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生改變,常對(duì)大腦造成損害,紋狀體內(nèi)注射能夠引起大鼠驚厥[27]。血液中高濃度α-酮異戊酸會(huì)導(dǎo)致代謝酸中毒,發(fā)生代謝性疾病,如糖尿病等。在本研究中,青蒿素能夠顯著降低模型小鼠血清α-酮異戊酸含量,調(diào)節(jié)小鼠脂質(zhì)代謝及中樞神經(jīng)系統(tǒng)。棕櫚酸、愈傷酸和順式-9-棕櫚油酸等差異代謝物都與脂肪酸代謝相關(guān)。青蒿素給藥可使脂質(zhì)類代謝物出現(xiàn)顯著變化,其中包括中長(zhǎng)鏈脂肪酸、膽汁酸及亞油酸相關(guān)代謝物。亞油酸可轉(zhuǎn)化為具有代謝活性的花生四烯酸,具有誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)、脂肪生成和內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用[28]。較高的亞油酸生物標(biāo)志物與2型糖尿病發(fā)病率負(fù)相關(guān),提示青蒿素可能改善模型小鼠的亞油酸代謝紊亂[29]。多不飽和脂肪酸在體內(nèi)往往發(fā)揮著有益的作用,而飽和脂肪酸能引起人體內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的紊亂等一系列疾病[30]。

綜上所述,14周的高果糖飲食改變了小鼠的脂質(zhì)、氨基酸、碳水化合物代謝及消化、神經(jīng)系統(tǒng)等系統(tǒng)相關(guān)的代謝物水平。青蒿素給藥后可顯著調(diào)節(jié)小鼠脂質(zhì)代謝及神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的代謝物紊亂;脂肪酸及不飽和脂肪酸生物合成通路在給藥后發(fā)生顯著改變。雖然本研究結(jié)果顯示青蒿素發(fā)揮了調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的作用,改善高果糖飲食引起的代謝紊亂,但是其發(fā)揮作用的特異性靶點(diǎn)和受體尚不明確,其潛在機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

利益沖突聲明:作者聲明沒有利益沖突。