蔬菜軟腐病菌廣譜拮抗細(xì)菌菌株篩選鑒定及防效研究

馬俊秀 吳皓瓊 姜威 閆更軒 胡基華 張淑梅

（黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱 150010）

蔬菜營養(yǎng)成分豐富，除日常飲食必須外，其活性成分在保健、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥以及日化品等領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用［1-3］。蔬菜在生產(chǎn)以及貯藏運輸中病害頻發(fā)，其中最常見、危害最重的是軟腐病，嚴(yán)重制約蔬菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展。引起蔬菜軟腐病的病原菌種類豐富，來源和致病機(jī)制具有多樣性，主要包括果膠桿菌屬（Pectobacterium）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、假單胞菌屬（Pseudomonas）和沙雷氏菌屬（Serratia），其中國內(nèi)外研究報道最多為果膠桿菌屬，其他幾種軟腐菌報道較少［4-6］。該病主要通過胞壁降解酶使植株軟腐病變［7］，感染迅速，在全球范圍內(nèi)普遍流行。除了危害白菜（Brassica rapavar.glabra）、馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）、圓蔥（Allium cepa）、芹菜（Apium graveolensL.）、娃娃菜（Brassica pekinensis）等重要蔬菜外，還會對一些觀賞性花卉植物、樹木、農(nóng)作物等造成傷害，給農(nóng)戶帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約蔬菜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展［8-9］。

生物防治因其對環(huán)境友好、人畜安全等優(yōu)點，成為近年來研究植物病害防治的主要對象［10-11］。目前利用拮抗微生物（細(xì)菌、放線菌、真菌）、群體感應(yīng)淬滅、微生物蛋白農(nóng)藥、小RNA基因沉默等手段防治蔬菜軟腐病報道越來越多［12-16］。芽孢桿菌菌株作為拮抗細(xì)菌是防治蔬菜軟腐病主要資源，可通過產(chǎn)生抑制病原菌的抗菌蛋白、聚酮化合物、脂肽類等抗菌物質(zhì)發(fā)揮抗菌作用［17-18］。研究表明，解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）和枯草芽孢桿菌（B.subtilis）對白菜軟腐病菌Pectobacterium carotovorumsubsp.carotovorum（Pcc）和辣椒軟腐病菌Pectobacterium carotovorumsubsp.brasiliense（Pcb）具有良好的抑制效果［19-20］。Tsuda等［21］和馮迪南等［22］發(fā)現(xiàn)乳酸菌（Lactobacillus plantarum）和黏質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）對白菜軟腐病菌Pcc和馬鈴薯軟腐病菌Pcb引起的水浸狀軟腐病具有較好的抑制作用。最近研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌對娃娃菜軟腐病菌Pectobacterium carotovorum（Pc）具有較好防治作用［23］。目前大多研究集中于對單一蔬菜軟腐病菌拮抗菌株的篩選，軟腐病菌種類多樣，具有廣宿主性，因此篩選防治多種蔬菜軟腐病菌的廣譜拮抗菌株極其重要。近年來，利用群體感應(yīng)淬滅防治植物病害成為研究熱點，大量報道證明群體感應(yīng)系統(tǒng)（quorum sensing, QS）可以調(diào)控致病因子的表達(dá)，阻斷QS可以減輕病害的嚴(yán)重程度。早在2000年就有報道芽孢桿菌可以利用群體感應(yīng)淬滅技術(shù)防治作物軟腐?。?4］。目前關(guān)于軟腐菌果膠桿菌的QS系統(tǒng)與其致病基因表達(dá)調(diào)控關(guān)系研究已經(jīng)很深入，群體感應(yīng)是一種通過特殊信號因子調(diào)控細(xì)胞間的交流機(jī)制，果膠桿菌致病基因表達(dá)受到群體感應(yīng)信號分子N-?；呓z氨酸內(nèi)酯類化合物（AHLs）的調(diào)控，從而發(fā)揮致病作用使植株腐爛［25］。目前大量報道集中在AHL信號分子淬滅，如See-Too等［26］發(fā)現(xiàn)利用AHL信號分子降解酶AHL內(nèi)酯酶AidP可以有效防治白菜軟腐病。最近Zhang等［27］和Fan等［28］分別發(fā)現(xiàn)1株新型不動桿菌菌株XN-10（Acinetobactersp.XN-10）和1株中間蒼白桿菌D-2（Ochrobactrum intermediumD-2），通過降解AHL信號分子，從而顯著降低軟腐菌在白菜等蔬菜上的浸漬癥狀。另外也可通過找尋信號分子抑制劑等手段，有效控制蔬菜軟腐害的發(fā)生［29］。

黑龍江省白菜、圓蔥、娃娃菜軟腐病頻發(fā)，本省主要致病菌BC2、YC1、WWC2具有交叉侵染能力，可感染多種蔬菜。本研究針對3株病原菌，多地點采樣進(jìn)行調(diào)查，從蔬菜根際土樣中篩選到一株具有良好拮抗作用菌株DJ1，通過菌落形態(tài)、生理生化、16S rDNA序列分析對其進(jìn)行初步鑒定，明確其種屬地位，并對其抑菌效果進(jìn)行初探，為菌株開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試病原細(xì)菌 白菜軟腐病菌（Pectobacterium carotovorum）YC1、圓蔥軟腐病菌（Burkholderia gladioli）BC2、娃娃菜軟腐病菌（Pseudomonassp.）WWC2、大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC25922、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC25923、銅綠假單胞菌桿菌（Pseuduinonas aeniginasa）ATCC27853均為本研究室保存。

1.1.2 供試病原真菌 刺五加立枯病菌（Rhizoctonia solani）、水稻綿腐病菌（Achlya oryzae）、黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、水稻稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、豆角炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、玉米莖基腐病菌（Fusarium graminearum）、水稻惡苗病菌（Fusarium moniliforme）均為本研究室保存。根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）NT1由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)贈送。

1.1.3 供試蔬菜與試劑 白菜、圓蔥、娃娃菜購自哈爾濱農(nóng)貿(mào)市場。群體感應(yīng)信號因子（N-己?；?L-高絲氨酸內(nèi)酯、N-3-氧-己酰高絲氨酸內(nèi)酯）購自阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、氯化鈉10 g、瓊脂15-20 g（液體培養(yǎng)基不加瓊脂）、蒸餾水1 000 mL，pH 7.2左右。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL，pH自然。MSM培養(yǎng)基：硫酸銨 2.0 g、磷酸氫二鈉 1.5 g、磷酸二氫鉀 1.5 g、硫酸鎂 0.2 g、結(jié)晶氯化鈣0.01 g、七水合硫酸亞鐵 0.001 g、蒸餾水1 000 mL，pH 6.5。MM培養(yǎng)基：硫酸銨 2.0 g，硫酸鎂 0.2 g，無水氯化鈣 0.01 g，硫酸亞鐵 0.005 g，氯化錳 0.002 g，硫酸氫二鉀 10.5 g，磷酸二氫鉀4.5 g，pH 6.5。

1.2 方法

1.2.1 軟腐病菌的培養(yǎng) 用LB平板劃線活化-80℃保存的3種軟腐病菌YC1、BC2、WWC2，挑單菌落于LB液體培養(yǎng)基30℃，160 r/min培養(yǎng)24 h，測定菌數(shù)，用無菌水稀釋至菌液濃度為1×108CFU/mL備用。

1.2.2 拮抗細(xì)菌的篩選 采集白菜（Brassica rapavar.glabra）、黃瓜（Cucumis sativusL.）、番茄（Solanum lycopersicumL.）、辣椒（Capsicum annuumL.）、芹菜（Apium graveolensL.）、茄子（Solanum melongenaL.）等蔬菜根際土。稱取土樣2 g，放入盛有20 mL無菌水的錐形瓶中，30℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)1 h，取1 mL懸浮液進(jìn)行倍比稀釋，取10-2、10-3、10-4、10-5、10-6五個稀釋梯度液體各100 μL涂布LB固體平板［30］，每個稀釋度3次重復(fù)，30℃恒溫培養(yǎng)24 h，挑取不同形態(tài)單菌落進(jìn)行劃線純化，用LB培養(yǎng)液30℃培養(yǎng)24 h，以白菜軟腐病菌YC1、圓蔥軟腐病菌BC2和娃娃菜軟腐病菌WWC2為靶標(biāo)，采用抑菌圈方法［31-32］篩選拮抗菌株。取100 μL病原菌液均勻涂布在LB固體平板上，在平板中間放置無菌鋼圈，在鋼圈中加入50 μL純化的細(xì)菌菌液，30℃培養(yǎng)48 h，每個菌株重復(fù)3次，觀察有無抑菌圈，采用十字交叉法測量抑菌圈大小。

1.2.3 拮抗細(xì)菌的鑒定

1.2.3.1 形態(tài)和生理生化特征鑒定 將篩選到的拮抗菌株用LB平板30℃培養(yǎng)24-48 h，從顏色、形狀、有無光澤、邊緣是否整齊、有無凸起等方面觀察菌落形態(tài)。依據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》第八版［33］和《常見細(xì)菌鑒定手冊》［34］以及相關(guān)文獻(xiàn)從耐鹽性、生長溫度、pH、檸檬酸鹽利用、碳氮源利用、接觸酶、甲基紅、V-P、淀粉水解、吲哚、明膠液化等方面進(jìn)行生理生化特性鑒定，并與已報道貝萊斯芽孢桿菌進(jìn)行比較［35-37］。

1.2.3.2 分子生物學(xué)鑒定 以細(xì)菌基因組DNA為模板，利用細(xì)菌16S rDNA通用引物27F/1492R［38］進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化后測序，所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對，用MEGA5.1軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.2.4 拮抗細(xì)菌抑菌作用

1.2.4.1 對離體蔬菜軟腐病菌的抑制作用 選取健康、外觀完好無機(jī)械損傷的白菜、圓蔥、娃娃菜，首先用75%酒精消毒，再用無菌水沖洗干凈。參考Cui等［39］方法并稍作修改，將葉片切成1.5 cm×1.5 cm左右小塊，在無菌平皿內(nèi)鋪上兩層濾紙，加入3 mL無菌水，用滅菌槍頭在切塊的中部制造傷口，在傷口處先接種拮抗菌液5 μL（約1×108CFU/mL），置于恒溫培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)4 h，再接種5 μL的軟腐菌菌懸液（約1×108CFU/mL），密閉保濕，28℃培養(yǎng)48 h后觀察有無病斑，采用十字交叉法測量腐爛病斑大小。只接種病原菌為陽性對照，只接種無菌水為陰性對照，每個處理3次重復(fù)。防治效果（%）=（對照病斑直徑-處理病斑直徑）/對照病斑直徑×100%。

1.2.4.2 對白菜軟腐病菌群體感應(yīng)信號因子的降解活性 首先將菌株DJ1接種在含有5 μmol/L信號因子（N-己?；?L-高絲氨酸內(nèi)酯、N-3-氧-己酰高絲氨酸內(nèi)酯）的MSM培養(yǎng)基中，30℃，160 r/min培養(yǎng)48 h，取48 h后菌液10 μL接種在含有X-gal（40 μg/mL）的MM瓊脂條上的一端（1 cm寬），然后將根癌農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciensNT1連續(xù)接種在距其越來越遠(yuǎn)的地方，30℃，培養(yǎng)48 h后觀察現(xiàn)象［27］。

1.2.4.3 對白菜軟腐病的田間小區(qū)防效 選取長勢基本一致白菜植株，4個處理，每個處理50葉片。處理1：只接種病原菌，取1 mL病原菌液用注射器點接在白菜葉靠近根部。處理2：先接種生防菌后接種病原菌，每個葉片先接種生防菌液3 mL，再按處理1方法接種病原菌。處理3：只接種生防菌，每個葉片接種生防菌液3 mL。處理4：無菌水對照，每個葉片接種無菌水3 mL。處理3 d后調(diào)查病情，并計算防效。參考孫旺旺等［40］的分級標(biāo)準(zhǔn)，并稍作修改。0級：無??；1級：開始形成；3級：0.5 cm＜病斑直徑≤1.0 cm；5級：1 cm＜病斑直徑≦2 cm；7級：病斑直徑＞2 cm。

病情指數(shù)=∑（病害級數(shù)×病害葉片數(shù)）/（最高病害級數(shù)×總?cè)~片數(shù)）×100

防病效果（%）=（對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100%

1.2.4.4 對病原真菌和人源性病原細(xì)菌的抑菌活性 采用對峙培養(yǎng)法［41］測定拮抗細(xì)菌對8種病原真菌的抑菌性。采用抑菌圈法測定拮抗細(xì)菌對3種人源性病原細(xì)菌的抑菌活性，方法同1.2.2。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 采用MEGA 7.0、Excel 2021、Origin 2022和SPSS 27統(tǒng)計軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹和進(jìn)行分析處理試驗數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 拮抗細(xì)菌的篩選

采用稀釋涂布法從蔬菜根際的20個土樣中共分離到1 012個細(xì)菌，以3種病原菌為靶標(biāo)篩選到18株對病原菌YC1、BC2有抑菌活性的菌株，其中菌株DJ1、MC1、SD2、TD1、XHS1、SD1抑菌活性較強；篩選出1株對3種病原菌均有抑菌活性的生防菌株DJ1，對YC1、BC2、WWC2三株病原菌的抑菌圈直徑分別為10.60、6.92和3.92 mm（表1、圖1）。

圖1 拮抗菌株對軟腐病菌YC1、BC2、WWC2的抑菌圈效果Fig.1 Inhibitory zone effect of the antagonistic strains against soft rot pathogens YC1, BC2, and WWC2

表1 拮抗菌株對軟腐病菌YC1、BC2、WWC2的抑制作用Table 1 Inhibitions of the antagonistic strains against soft rot pathogens YC1, BC2, and WWC2

2.2 拮抗細(xì)菌鑒定

菌株DJ1革蘭氏陽性、桿狀、有芽孢（圖2-A）。在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，菌落呈乳白色，圓形或橢圓形，不透明，表面光滑、有褶皺，邊緣不整齊（圖2-B）。可在22-42℃、pH 5-9、1%-5% NaCl條件下正常生長。此外，菌株DJ1與文獻(xiàn)報道貝萊斯芽孢桿菌的生理生化指標(biāo)基本一致，如能夠利用山梨醇、甘露醇、果糖、蔗糖和丙二酸鹽，不能利用檸檬酸鹽。接觸酶、葡萄糖氧化發(fā)酵、明膠液化、V-P、淀粉水解、石蕊牛奶陽性，H2S產(chǎn)生、吲哚反應(yīng)、甲基紅反應(yīng)陰性。菌株DJ1不能利用海藻糖，不能分解纖維素，硝酸鹽還原呈陽性反應(yīng)，這與文獻(xiàn)報道生理生化特性不一致（表2）。應(yīng)用細(xì)菌16S rDNA通用引物PCR擴(kuò)增獲得長度為1 436 bp基因片段，測序后在NCBI上在線Blast比對，與貝萊斯芽孢桿菌同源性較高為99%（圖3）。依據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》和《常見細(xì)菌鑒定手冊》，綜合菌株形態(tài)、生理生化特性和16S rDNA 序列分析，將菌株DJ1鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。

圖2 菌株DJ1的形態(tài)特征（LB培養(yǎng)基）Fig.2 Morphology of strain DJ1（LB medium）

圖3 菌株DJ1的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain DJ1

表2 菌株DJ1的生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain DJ1

2.3 拮抗細(xì)菌對離體蔬菜軟腐病菌抑制作用

菌株DJ1對離體白菜、圓蔥與娃娃菜菜軟腐病菌具有較好的抑制活性，病原菌接種組48 h后出現(xiàn)較大病斑，拮抗菌處理組僅在接種處出現(xiàn)較小病斑（圖4），對離體白菜、圓蔥與娃娃菜軟腐病菌的抑菌率分別為84.30%、60.21%和69.96%（圖5）。

圖4 拮抗菌DJ1對離體白菜、圓蔥和娃娃菜軟腐病菌的抑菌活性Fig.4 Antibacterial activities of strain DJ1 against soft rot pathogen of Chinese cabbage（Brassica rapa var.glabra）, onion（Allium cepa）, and baby cabbage（Brassica pekinensis）in vitro

圖5 菌株DJ1對離體白菜、圓蔥和娃娃菜軟腐病菌的防效Fig.5 Control efficacy of strain DJ1 against soft rot pathogen of Chinese cabbage, onion, and baby cabbage in vitro

2.4 拮抗細(xì)菌對白菜軟腐病菌群體感應(yīng)信號因子的降解活性

菌株DJ1對白菜軟腐病菌群體感應(yīng)信號因子的降解活性以N-己?；?L-高絲氨酸內(nèi)酯和N-3-氧-己酰高絲氨酸內(nèi)酯（5 μmol/L）兩種信號因子作為對照檢測菌株DJ1對信號因子的降解活性。根據(jù)根癌農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciensNT1在瓊脂條帶上從頂部到藍(lán)色的距離以及顏色的深淺來確定樣品中信號因子的殘留含量。菌株能在以信號因子為唯一碳源的培養(yǎng)基生長，與只含有5 μmol/L信號因子的對照組相比，加入菌株DJ1的處理組顏色較淺，表明菌株DJ1具有一定的降解白菜軟腐病菌群體感應(yīng)信號因子的能力（圖6）。

圖6 拮抗細(xì)菌對白菜軟腐病菌群體感應(yīng)信號因子的降解活性Fig.6 Degradation activity of antagonistic bacteria on the quorum sensing signal factors of soft rot pathogen of Chinese cabbage

2.5 拮抗細(xì)菌對其他病原細(xì)菌與真菌的抑制作用

菌株DJ1對其他病原真菌的抑菌效果見圖7。菌株DJ1除了對3種蔬菜軟腐病菌具有較好的抑制效果外，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌（表3）和水稻綿霉菌、黃瓜枯萎病菌、水稻稻瘟病菌、豆角炭疽病菌、玉米莖基腐病菌、水稻惡苗病菌、番茄灰霉病菌8種植物病原真菌也具有抑制作用，對綠膿桿菌無抑制作用。對黃瓜枯萎病菌抑制效果最好，抑制率為71.38%，對刺五加立枯病菌抑制效果較低，抑制率為37.84%。

圖7 菌株DJ1對不同病原真菌的抑制作用Fig.7 Inhibitory effects of strain DJ1 against different pathogenic fungi

表3 菌株DJ1對不同病原細(xì)菌的抑制作用Table 3 Inhibitory effects of strain DJ1 against different pathogenic bacteria

2.6 拮抗細(xì)菌對白菜軟腐病菌的田間小區(qū)防效

生防菌和無菌水對照組不發(fā)病，只接病菌組接種1 d發(fā)病，3 d病斑擴(kuò)大（圖8），發(fā)病較重，病情指數(shù)為66.89，生防菌處理組部分葉片發(fā)病，發(fā)病較輕，病情指數(shù)為13.48，對軟腐病的防效為79.91%（表4）。

圖8 菌株DJ1對白菜軟腐病菌BC2的田間小區(qū)防效Fig.8 Control effects of strain DJ1 against the soft rot pathogen BC2 of Chinese cabbage in field plots

表4 菌株DJ1對白菜軟腐病菌BC2的田間小區(qū)防效Table 4 Control effects of strain DJ1 against the soft rot pathogen BC2 of Chinese cabbage in field plots

3 討論

3.1 貝萊斯芽孢桿菌的生防潛力

貝萊斯芽孢桿菌是近年來新發(fā)現(xiàn)的優(yōu)勢生防菌株，廣泛存在于土壤、植物根際、植物體與水體等環(huán)境中，具有促進(jìn)植物生長、抑菌譜廣、抗逆性強等優(yōu)勢，在植物病害生物防治方面具有重要作用［42-43］。目前，國內(nèi)外關(guān)于貝萊斯芽孢桿菌的研究主要側(cè)重于菌株篩選、生防機(jī)制解析、抗菌促生物質(zhì)挖掘與防效等方面，已經(jīng)從植物根際土壤、植物體與水體等不同生境中分離獲得許多具有防病促生功能的菌株，這些菌株對蔬菜、作物、果樹等病原真菌和細(xì)菌具有一定的抑制作用，多數(shù)處于研究階段，尚未商品化［44-46］。2021年貝萊斯芽孢桿菌CGMCC NO.14384在國內(nèi)首次獲得微生物農(nóng)藥登記，用來防治煙草和黃瓜白粉病。因此，在植物病害防治方面具有一定優(yōu)勢。如該菌對菜豆枯萎病菌Fusarium solani［47］、馬鈴薯瘡痂病菌Streptomyces galilaeus［48］、柑橘煤污病菌Pseudomonas chlororaphis［49］等均有一定防治作用。本實驗以3株致病性較強軟腐病菌為靶標(biāo)，篩選出1株拮抗作用較強貝萊斯芽孢桿菌DJ1，田間小區(qū)防效達(dá)79.91%，對白菜軟腐病離體葉片防效最佳達(dá)84.30%，說明貝萊斯芽孢桿菌在植物病害防治方面具有廣泛的應(yīng)用前景，是一種重要的生防資源。

3.2 菌株DJ1群體感應(yīng)信號分子與抗病之間的關(guān)系

除了利用拮抗微生物防治植物病害，近年來又開展了基于群體感應(yīng)淬滅技術(shù)防治軟腐病新策略的研究。群體感應(yīng)系統(tǒng)可以調(diào)控抗生素產(chǎn)生、生物膜形成、致病基因表達(dá)等群體行為。細(xì)菌的群體感應(yīng)信號分子主要包括N-?；呓z氨酸內(nèi)酯類化合物（AHLs）、烯酸類（DSF）、自誘導(dǎo)肽（AIPs）和呋喃硼酸二酯（AI-2）類。大量研究表明［26-28］植物病原細(xì)菌的致病性受群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控。Rodríguez等［29］從鹽角草根際分離到可以降解AHL的菌株P(guān)6（Pseudomonas segetisstrain P6），在馬鈴薯和胡蘿卜上接種P6菌株后，顯著降低了P.atrosepticum、D.solani和P.carotovorum引起的軟腐癥狀，并且對番茄還具有一定的促生作用。Zhou等［50］研究分離出1株食吡啶紅球菌XN-36（Rhodococcus pyridinivoransXN-36），可以快速使AHL信號分子的酰胺鍵斷裂，降解多種AHL信號分子，菌株XN-36作為生物防治劑可以顯著降低由P.carotovorum引起的白菜、馬鈴薯和胡蘿卜的軟腐病癥。Kachhadia等［51］研究發(fā)現(xiàn)蠟狀芽孢桿菌RC1提取物可以通過群體感應(yīng)淬滅減少由河生腸桿菌Lelliottia amnigena引起的胡蘿卜、馬鈴薯和黃瓜的軟腐狀浸漬面積。本研究中分離的貝萊斯芽孢桿菌DJ1具有一定的降解N-?；呓z氨酸內(nèi)酯類群體感應(yīng)信號分子的能力，實驗中發(fā)現(xiàn)與接種N-己?；?L-高絲氨酸內(nèi)酯、N-3-氧-己酰高絲氨酸內(nèi)酯的對照組比較，加入菌株DJ1的實驗組顏色更淺，說明菌株DJ1可以通過降解AHL信號分子從而減輕蔬菜的軟腐病害。大量研究表明AHLs信號在防控蔬菜軟腐病菌毒性方面具有良好應(yīng)用前景，將是今后蔬菜軟腐病生物防治研究重點，同時也應(yīng)積極探索其他群體淬滅方式，以挖掘效果更佳的淬滅途徑。

3.3 菌株DJ1拮抗細(xì)菌的可能機(jī)理

作為芽孢桿菌屬的一員，貝萊斯芽孢桿菌在生物防治方面研究報道逐年增多。貝萊斯芽孢桿菌抑菌作用機(jī)制主要包括競爭、抗生、產(chǎn)生抗菌物質(zhì)、誘導(dǎo)植物抗性等，其中以產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)抑制病原菌為主。B.velezensis可產(chǎn)生抗菌蛋白、聚酮化合物、脂肽類等抗菌活性物質(zhì)抑制病原菌生長。其中，歐婷等［52］研究發(fā)現(xiàn)B.velezensisSWUJ1中含有的脂肽類化合物對植物炭疽病菌具有較好拮抗活性，其基因組中存在13個脂肽類抗生素相關(guān)基因簇，LC-MS結(jié)果顯示其含有抗菌物質(zhì)包括表面活性素（surfactin）、伊枯草菌素（iturin）及豐原素（fengycin）。滕毅［53］研究發(fā)現(xiàn)，埃吉類芽孢桿菌B69可產(chǎn)生羊毛硫抗生素，并從中分離到elgicin A I、elgicin A II、elgicin B 及 elgicin C四種新型肽類抗生素。目前羊毛硫抗生素在食品防腐和抗感染治療領(lǐng)域扮演重要角色，其對革蘭氏陽性細(xì)菌和部分陰性細(xì)菌具有一定抑制效果。聚酮類物質(zhì)［54］是另一類在防治植物病害中起重要作用的抗菌活性物質(zhì)，通過在聚酮合酶組織下合成的聚酮類化合物主要包括 macrolactin、bacillaene 和 difficidin 等，研究發(fā)現(xiàn)聚酮化合物也是抗植物細(xì)菌性軟腐病的潛在抗菌物質(zhì)［37］。而本研究中貝萊斯芽孢桿菌DJ1發(fā)酵液對蔬菜軟腐病菌有明顯抑制作用，說明該菌株中可能含有某些抗菌物質(zhì)抑制病原菌生長，其具體的抗菌物質(zhì)種類、抑菌機(jī)理研究有待進(jìn)一步分析確定。由于貝萊斯芽孢桿菌的分類地位是近些年才確定的，對該菌株研究主要集中在分離篩選和病害防控方面，而對其代謝產(chǎn)物的分離純化和作用機(jī)制研究方面欠缺，目前主要是基于基因組數(shù)據(jù)對現(xiàn)有的抗菌物質(zhì)基因簇進(jìn)行分析。因此，未來應(yīng)深入挖掘貝萊斯芽孢桿菌DJ1的抗菌物質(zhì)以及它的作用機(jī)制，為該菌株今后的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

3.4 菌株DJ1對多種植物病害的廣譜抗病應(yīng)用潛力

蔬菜軟腐病是一種常見的細(xì)菌性病害，在田間和儲運期均可發(fā)病，引起蔬菜腐爛變質(zhì)，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前蔬菜生長階段的軟腐病主要依靠化學(xué)藥劑防治，農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染等副作用無法消除，儲運期因缺乏有效的綠色安全防控手段，一般不用藥防治，增加蔬菜腐爛風(fēng)險。胡蘿卜軟腐果膠桿菌P.carotovorum是蔬菜軟腐病最主要的病原菌，寄主廣泛。針對該病菌國內(nèi)外開展了生防菌株篩選與防效研究，獲得了一些能夠有效抑制該病菌的解淀粉芽孢桿菌和貝萊斯芽孢桿菌。除了胡蘿卜軟腐果膠桿菌，近年發(fā)現(xiàn)P.atroseptica、P.wasabiae、Pseudomonasspp.和B.gladioli也能引起蔬菜軟腐病，目前針對這些病菌的生防菌株篩選研究有限，2021年崔雙［30］獲得一株貝萊斯芽孢桿菌，能夠拮抗魔芋軟腐病菌P.atroseptica，溫室防效為43%，但鮮見貝萊斯芽孢桿菌抑制Pseudomonasspp.和B.gladioli的報道。本團(tuán)隊前期從黑龍江省多個種植地腐爛的白菜、圓蔥、娃娃菜上獲得3株病原菌（P.atroseptica、B.gladioli、Pseudomonassp.），本研究以 3 種病原菌為靶標(biāo)，首次從蔬菜根際土壤中分離獲得一株對3種病原菌均具有抑制作用的生防菌株，經(jīng)過形態(tài)、生理生化和分子鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。該菌株生長溫度和pH寬泛，耐鹽抗逆性較強，預(yù)示該菌株具有良好的環(huán)境適應(yīng)性。抑菌譜較廣，不僅對3種軟腐病菌具有抑制作用，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等人類致病菌以及8種植物病原真菌也具有較好的抑制作用，其中對水稻綿腐病菌（A.oryzae）、黃瓜枯萎病菌（F.oxysporum）、水稻稻瘟病菌（P.oryzae）、番茄灰霉病菌（Botrytis.inerea）、豆角炭疽病菌（C.gloeosporioides）、玉米莖基腐病菌（F.graminearum）防效均在60%以上，具有廣譜抑菌活性。說明該菌株具有較好的實用性，因為蔬菜細(xì)菌和真菌病害常常混發(fā)，廣譜性拮抗菌株具有更大的應(yīng)用潛力，而且該菌株對白菜軟腐病的田間防效高于已有報道，是一株具有應(yīng)用前景的優(yōu)良生防菌株。今后將對其他蔬菜軟腐病田間防效、制劑研制等開展系列深入研究，為該菌株的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

從蔬菜根際土中篩選到 18 株具有拮抗效果的菌株，其中 1 株菌DJ1對3種軟腐病菌抑制效果較好，并具有一定降解白菜軟腐病菌群體感應(yīng)信號因子能力，經(jīng)鑒定為貝萊斯芽孢桿菌，其對2種人源性病原細(xì)菌以及8種植物病原真菌也具有明顯抑制作用，具有廣譜抑菌活性。對白菜、圓蔥、娃娃菜軟腐病離體防效分別為84.30%、60.21%和69.96%，且對白菜田間防效達(dá)79.91%，因而表明菌株DJ1在蔬菜軟腐病生物防治方面具有一定的開發(fā)和應(yīng)用價值。