基于三角梅的病毒誘導基因沉默體系的建立與優化

劉珍銀 段郅臻 彭婷 王童欣 王健

（1.海南大學林學院 熱帶特色林木花卉遺傳與種質創新教育部重點實驗室 海南省熱帶特色花木資源生物學重點實驗室，海口 570228；2.貴州大學農學院，貴陽 550025）

三角梅（Bougainvilleaspp.）具有花色豐富、花期長、抗逆性強等優點，是南方地區城市園林綠化和家庭觀賞中不可缺少的植物之一［1］。近年來有關三角梅的研究主要集中在栽培繁殖、種質資源、園林應用等方面，基因功能相關研究較少。隨著測序技術的發展，三角梅生長發育、葉色調控、花色調控等方面的相關基因功能開發將成為研究趨勢，簡單快速的功能驗證方法的建立變得尤為重要。

病毒誘導的基因沉默（virus-induced gene silencing, VIGS）是通過構建攜帶目的基因的重組病毒載體侵染植株，使目標基因表達被抑制，從而以表型變化分析基因功能的技術［2-3］。與其他基因功能研究方法相比，該方法不需要完整的基因序列，不需要遺傳轉化，周期短，操作簡單，在非模式植物研究中具有明顯優勢［2］。煙草脆裂病毒（tobacco rattle virus, TRV），作為常用的VIGS病毒載體，具有適應宿主范圍廣、沉默持續時間長、病毒癥狀不明顯、沉默效率高等優點［4］。基于TRV的VIGS系統已被應用于多種觀賞植物的基因功能驗證［5-11］。八氫番茄紅素脫氫酶（phytoene desaturase，PDS）是類胡蘿卜素合成途徑的關鍵酶。PDS基因沉默會直接影響類胡蘿卜素的積累，植株會出現光漂白現象，以表型變化評價沉默效果［12-14］。由于表型明顯，易于觀察，且適用于植株不同部位，PDS基因成為VIGS技術最常用的指示基因之一［15］。

本研究以三角梅‘金心雙色’（Bougainvillea peruviana‘Thimma’）品種為試驗材料，以PDS基因為標記基因，TRV為病毒載體，構建不同長度沉默基因片段的病毒重組載體，采用摩擦注射農桿菌侵染法，探索三角梅VIGS沉默體系，旨在為后續基因功能研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗使用材料‘金心雙色’三角梅種植于海南大學儋州校區農科基地。煙草脆裂病毒載體pTRV1、pTRV2保存于本實驗室，大腸桿菌DH5α感受態細胞和農桿菌GV3101感受態細胞采購于上海唯地生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因克隆 根據NCBI數據庫中的擬南芥PDS基因序列（GenBank登錄號：NM_117498.4）和煙草PDS基因序列（GenBank登錄號：DQ469932.1），與課題組現有三角梅轉錄組數據（NCBI，PRJNA812995）進行Blast比對，獲取PDS基因片段，命名為BpPDS。在ORF框內選取336 bp和457 bp長度的片段，參考In-fusion引物設計原則設計特異性引物，在引物上設計EcoRI酶切位點，引物由上海生工生物工程公司合成，序列見表1。

表1 本文中使用的引物序列Table 1 Primers used in this study

采用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）提取嫩葉總RNA。利用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒（寶日醫生物技術有限公司，大連）反轉錄合成cDNA。PCR反應體系為：2 × Phanta Max Master Mix（諾唯贊生物技術股份有限公司，南京）12.5 μL、正向引物（10 μmol/L）和反向引物（10 μmol/L）各1 μL、cDNA 1 μL，補充ddH2O至25 μL。采用Touch down PCR反應程序，94℃ 6 min；94℃30 s，67-64℃ 30 s，72℃ 1 min，-0.5℃/循環，8個循環；94℃ 30 s，64℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環；72℃ 7 min。PCR產物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。利用Universal DNA純化回收試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）回收目的基因片段。

1.2.2 沉默載體構建 利用限制性內切酶EcoRI（賽默飛世爾科技有限公司，上海）對pTRV2載體進行單酶切，獲得pTRV2線性片段并分別純化酶切產物。利用In-Fusion? HD Cloning Kit試劑盒（寶日醫生物技術有限公司，大連）連接目的基因片段及pTRV2線性片段，構建pTRV2-BpPDS336和pTRV2-BpPDS457重組載體。將重組載體轉化大腸桿菌DH5α（上海唯地生物技術有限公司），在卡那霉素（100 μmol/L）抗性篩選和菌液PCR檢測后，進行測序驗證。

1.2.3 農桿菌轉化與侵染 利用凍融法，將陽性重組質粒pTRV2-BpPDS336和pTRV2-BpPDS457轉入農桿菌GV3101感受態（上海唯地生物技術有限公司），在卡那霉素（100 mg/L）和利福平霉素（20 mg/L）抗性條件和菌液PCR檢測下篩選陽性轉化子。

分別培養含有pTRV1、pTRV2、pTRV2-BpPDS336及pTRV2-BpPDS457質粒的農桿菌GV3101于YEP液體培養基（含100 mg/L卡那霉素和20 mg/L利福平霉素）中，28℃振蕩培養至OD600約為0.8-1.1。取菌液離心棄上清，加入現配侵染液（10 mmol/L MES，10 mmol/L MgCl2，148 μmol/L乙酰丁香酮）重懸菌體，OD600調至約1.0。將含pTRV1的農桿菌重懸液分別與含pTRV2（陰性對照）、重組質粒pTRV2-BpPDS336及pTRV2-BpPDS457農桿菌重懸液以1∶1的比例充分混勻，在室溫黑暗條件下靜置處理2-3 h后用于注射侵染。

注射侵染前在植株頂芽莖稈和嫩葉上制造輕微創傷面，將混合菌液注射進嫩葉（頂端3-4片葉）及頂芽莖稈，并在接種部位覆蓋無菌紗布，保鮮膜包裹以保持濕潤。侵染后的植株用黑色塑料袋包裹黑暗處理24 h，隨后置于25℃、濕度60%、光周期16 h（光）/8 h（暗）條件下培養。在初次侵染處理一周后，對相同侵染部位進行二次處理以保證侵染效果。觀察記錄各處理植株表型變化。

1.2.4 三角梅葉片光合色素含量測定 參考李瑞雪等［13］的方法測定對照組（pTRV2）和兩種沉默組（pTRV2-BpPDS336及pTRV2-BpPDS457）的葉片葉綠素及類胡蘿卜素含量，各處理設置3次生物學重復。

1.2.5 熒光定量PCR檢測 利用快速DNA提取檢測試劑盒和RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）提取陰性對照組和沉默組的DNA 和RNA，分別用于載體檢測和基因表達量檢測。利用HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）試劑盒（諾唯贊生物科技有限公司，南京）反轉錄合成cDNA。BpActin作為內參基因，RT-qPCR引物序列見表1。參照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒（諾唯贊生物科技有限公司，南京），在熒光定量PCR檢測儀（LineGene 9600，杭州博日科技股份有限公司）完成檢測，每個處理設置3個平行試驗。反應體系（10 μL）：cDNA 1 μL，正向引物（10 μmol/L）和反向引物（10 μmol/L）各0.5 μL，2 ×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 5 μL，ddH2O 3 μL。反應程序為：95℃ 1 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，40個循環。溶解程序：95℃ 30 s，60℃ 30 s，95℃30 s。

1.2.6 數據處理 運用2-ΔΔCT方法計算目的基因相對表達量。試驗數據用Excel 2010進行統計，利用SPSS 25.0對所有數據在P＜0.05水平上進行差異分析，使用GraphPad Prism 8.0軟件作圖。

2 結果

2.1 目的基因克隆

由圖1可知，三角梅葉片RNA電泳結果可觀察到清晰完整的2條帶，且OD260/OD280值在1.8-2.0之間，說明RNA質量良好，可用于后續試驗。

圖1 三角梅葉片總RNAFig.1 Total RNA of B.peruviana ‘Thimma’

考慮到引物5'端10 bp TRV2同源序列和6 bpEcoRI酶切位點，與336 bp的BpPDS片段相連后，片段長度為368 bp；與457 bp的BpPDS片段連接后，片段長度為489 bp。如圖2電泳圖所示，BpPDS336基因條帶位于300 bp左右，BpPDS457基因條帶接近500 bp，條帶單一清晰，且片段大小與預期結果一致。

圖2 目的基因片段擴增Fig.2 Amplification of target genes

2.2 沉默載體構建

pTRV2載體檢測引物可擴增321 bp的條帶，重組沉默載體pTRV2-BpPDS336和pTRV2-BpPDS457擴增片段分別為657 bp和778 bp。由圖3可知，電泳條帶分別在650 bp和780 bp左右，條帶單一清晰，且片段大小與預期結果一致，經測序與轉錄組數據一致，說明載體構建成功。

圖3 目的基因TRV2載體擴增檢測Fig.3 Detection of target genes on constructed TRV2 vector

2.3 農桿菌侵染

在初次侵染2-3周后，頂端嫩莖侵染處理，兩種沉默組均未發現葉片有明顯黃化或白化現象。相反，在葉片侵染部位周圍顏色變淺，形成淺黃色斑塊（圖4）。陰性對照（圖4-B）同空白對照（圖4-A）無明顯顏色差異，兩個沉默處理組的葉片表型存在一定差別，pTRV2-BpPDS457（圖4-C, D）相比pTRV2-BpPDS336（圖4-E, F）侵染處理的葉片黃化效果更加明顯。

圖4 沉默三角梅BpPDS葉片表型Fig.4 Phenotype of BpPDS silenced B.peruviana ‘Thimma’

由圖5所示，利用PCR檢測pTRV1和pTRV2載體發現空白對照中無pTRV1和pTRV2載體；陰性對照3個樣品均在257 bp和321 bp處有清晰單一條帶，說明葉片中存在pTRV1和pTRV2載體；在pTRV2-BpPDS336和pTRV2-BpPDS457沉默處理組中擴增條帶單一且與重組載體長度相符，表明pTRV2-BpPDS336和pTRV2-BpPDS457重組載體均成功轉入三角梅植株。

圖5 pTRV1和pTRV2病毒載體PCR檢測Fig.5 PCR amplification of virus veetor pTRV1 and pTRV2

2.4 光合色素含量檢測

由表2顯示，空白對照和陰性對照之間總葉綠素和類胡蘿卜素含量沒有顯著差異，陰性對照與兩個沉默處理pTRV2-BpPDS336和pTRV2-BpPDS457之間存在顯著差異（P＜ 0.05）。兩個沉默處理之間在總葉綠素和類胡蘿卜素含量上沒有顯著差異，但pTRV2-BpPDS457沉默處理葉片葉綠素a和葉綠素b含量相比pTRV2-BpPDS336顯著降低。綜上所述，BpPDS沉默處理會降低類胡蘿卜素和葉綠素含量的合成，與表型觀察相一致。

表2 不同處理三角梅葉片光合色素含量Table 2 Content of photosynthetic pigments in the leaves of B.peruviana ‘Thimma’ under different treatments

2.5 RT-qPCR檢測

如圖6所示，空白對照與陰性對照中BpPDS表達量之間無顯著差異，pTRV2-BpPDS336和pTRV2-BpPDS457沉默處理的葉片BpPDS基因的表達量顯著降低，其中pTRV2-BpPDS336處理的葉片中BpPDS表達量顯著降低。結果表明，三角梅PDS基因沉默體系可以有效沉默內源BpPDS基因，沉默體系初步建立。

圖6 RT-qPCR檢測BpPDS基因相對表達量Fig.6 RT-qPCR detection of relative expression of BpPDS

3 討論

隨著三角梅測序技術的開發，更多的研究逐漸傾向于基因功能驗證［16］。三角梅作為木本植物，其穩定遺傳體系尚不成熟，因此快速、簡便的研究方法對基因功能鑒定至關重要。VIGS作為一種快速基因分析技術，已經成功運用在牡丹、玫瑰、觀賞海棠等木本花卉植物的基因研究中［9,17-18］。目前，三角梅VIGS體系研究尚未見報道。本研究利用農桿菌介導法，構建三角梅VIGS體系，為三角梅基因功能研究奠定基礎。

表型變化是檢測基因沉默效果最直觀的方法。因此，選擇合適的指示基因有助于表型觀察，可以快速建立高效的VIGS體系。PDS作為類胡蘿卜素合成途徑關鍵基因，主要在植物葉片、花瓣和果實中表達，該基因表達受阻時植株出現光漂白現象，表型直觀易觀察［13］。其他指示基因也有應用，如鎂螯合酶（CHLH）參與葉綠素合成，基因沉默會產生葉片發黃表型［15］。查爾酮合成酶（CHS）參與花青素合成，基因沉默效果可通過花色變化判斷［19］。‘金心雙色’三角梅因其特有的雙色葉片，極具觀賞價值，也將是葉色調控研究的最佳材料。在本研究中，克隆了‘金心雙色’三角梅葉片轉錄組中BpPDS基因，構建病毒重組載體，研究基因片段大小、不同接種方法等對基因沉默效果的影響，旨在建立一套穩定快速的三角梅沉默體系。

高效VIGS體系的建立主要包含載體構建、侵染處理、基因沉默評價等［20］。合適的病毒載體是體系構建成功的關鍵。目前應用于VIGS技術的病毒載體主要有煙草花葉病毒（tomato mosaic virus,TMV）［21］、煙草脆裂病毒（tobacco rattle virus,TRV）［22］、番茄金色花葉病毒（tomato golden mosaic virus, TGMV）［23］等。不同病毒載體接種效果和沉默效果均不同。其中，TRV病毒載體應用較廣泛，且TRV感染引起的癥狀較輕，沉默表型相對集中且均勻［11］。在本研究中，選擇TRV病毒載體，構建了pTRV2-BpPDS重組載體，并獲得了較均勻清晰的沉默表型的葉片，光合色素也有顯著的降低，沉默效果比較理想，說明TRV病毒載體可以應用于三角梅沉默體系構建。載體能否順利進入植物并實現基因沉默與農桿菌侵染體系密不可分。不同植物對農桿菌侵染的敏感性不同［15］。珊瑚櫻VIGS體系構建中對LBA4404和GV3101兩種農桿菌侵染效果比較發現，GV3101侵染產生的沉默效率相對高［24］。在水稻中，LBA4404則表現出更強的侵染能力［25］。本試驗選用GV3101作為侵染農桿菌，侵染處理的葉片未觀察到明顯的病菌侵染造成的萎縮或壞死情況，說明該農桿菌適用于三角梅侵染處理。

選擇正確的目的基因片段也是確保沉默效果的關鍵因素。病毒載體中插入片段與靶基因同源性越高，基因沉默效果會越好［26］。當基因片段不合適，會出現沉默基因脫靶現象，繼而無法獲得預期沉默表型［27］。研究表明大麥條紋花葉病毒（barley stripe mosaic virus, BSMV）誘導小麥VIGS體系插入片段長度在120-500 bp范圍內沉默效率高，更短或更長的片段沉默效果低［28］。TRV病毒載體誘導的煙草PDS基因沉默體系插入片段在192-1 304 bp內都會出現葉片光漂白現象，長度達到1 661 bp時沉默效果明顯降低［22］。由此可知，最適插入片段要依據不同物種的特性進行試驗和選擇以獲得最佳沉默效果。本試驗中，利用本課題組‘金心雙色’三角梅轉錄組數據克隆了兩個不同長度的BpPDS插入片段，分別為336 bp和457 bp。兩個重組病毒載體均實現了一定的沉默效果。其中pTRV2-BpPDS457侵染處理的葉片黃化表型相對pTRV2-BpPDS336更加明顯，色素含量也相對更低，由此可見，457 bp長度的插入片段構建的沉默載體更適用于三角梅，也對后期基因驗證中插入片段的選擇提供了一定參考。

侵染處理方法和接種部位的選擇與目的基因表達部位密切相關。常用的VIGS接種方法主要有真空滲透法［18,29］、摩擦接種法［15,24］、灌根法［30］等。Liu等［31］在枸杞VIGS體系構建時采用的發芽種子真空滲透法相比幼苗真空深空和農桿菌澆灌沉默效率高。Xu等［24］在珊瑚櫻VIGS體系構建中采用摩擦加子葉注射法比發芽種子真空滲透沉默效率要高。不同物種選擇的接種方法不同，接種部位同樣影響VIGS技術的沉默效率。本試驗選用PDS基因作為沉默目標，在綠色葉片中正常表達。因此，選擇頂端嫩莖和嫩葉作為接種對象，以摩擦注射法接種，對比兩者沉默效果發現頂端嫩莖接種的頂端新生嫩葉沒有明顯的黃化或白化表型，可能同三角梅植株木質化有關。相反，接種的嫩葉表現出黃化，且葉片無明顯病態。因此，葉片摩擦接種法可用于三角梅葉色調控、發育代謝等基因驗證。

由此可見，建立一個高效的VIGS體系，需要綜合考慮各種因素，合適的病毒載體、農桿菌菌系、插入片段大小、接種方法、培養環境等［20］。本研究綜合考慮各因素，獲得了一定的沉默效果，初步建立了三角梅的VIGS體系，為未來基因功能組學研究奠定了基礎。但是，試驗中并未獲得明顯光漂白葉片，體系條件仍需進一步優化，期望建立更高侵染效率的VIGS體系。

4 結論

本研究以三角梅‘金心雙色’作為試驗材料，TRV病毒為載體，BpPDS為指示基因，采用摩擦接種葉片法，結合表型、光合色素含量測定及基因表達水平，初步構建了三角梅的VIGS基因沉默體系，為后續基因功能研究提供參考。