基于生物信息學分析NOP56基因在肝細胞癌中的表達及意義

李 芹 湯勁松

1 揚州市職業大學,江蘇省揚州市 225000; 2 江蘇省蘇北人民醫院

肝癌是一種常見的惡性腫瘤,其死亡率極高。大約85%的肝惡性腫瘤為肝細胞癌,且非常容易惡化及轉移,肝細胞癌患者的5年生存率很低,預后極差[1]。因此迫切需要進一步深層次了解肝細胞癌的發生發展機制,發現新的肝細胞癌治療靶點,為肝癌的診療提供新的方向。NOP56是一種核仁蛋白,在腫瘤細胞中對snoRNA的生成和snoRNA的穩定性維持中起著至關重要的作用[2]。研究表明,在某種情況下snoRNA的失調是癌變的必要條件[3-4]。因此可以推測NOP56可能在腫瘤的發生發展過程中起到至關重要的作用。本研究通過生物信息學探討NOP56的臨床意義及潛在的分子機制,為肝細胞癌的診斷與治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 NOP56在肝細胞癌的總體表達情況 利用Oncomine數據庫及HCCDB數據庫分析肝細胞癌組織中NOP56基因在肝癌及正常或癌旁組織的表達水平,P<0.01被認為具有統計學意義。

1.2 臨床相關分析 TCGA數據庫下載在轉錄組數據及對應的臨床信息,并排除了臨床信息不完整的樣本。

1.3 生存分析 通過Kaplan-Meier plotter(http://kmplot.com/)評估NOP56對于肝癌患者及其各個亞組的預后價值。利用多因素Cox回歸模型評估NOP56是否為影響肝癌患者總生存期的獨立危險因素。

1.4 NOP56互相作用基因篩選和功能及藥物富集分析 利用GeneMANIA(https://genemania.org/)建立NOP56互作蛋白網絡,并且對此網絡進行了富集分析。此外,通過使用WebGestalt(http://www.webgestalt.org/)對該網絡進行了靶向藥物的預測。

1.5 GSEA富集分析 利用R軟件通過Spearman檢驗將肝細胞癌mRNA表達譜分成NOP56的正相關組及負相關組。使用基因集富集分析(GSEA)對NOP56正負相關的基因進行基于京都基因與基因組百科全書(KEGG)注釋。

1.6 統計學方法 采用非配得t檢驗對兩組滿足正態分布的連續性變量進行統計學檢查。兩組以上正態分布的連續性變量,采用方差分析。利用多因素Cox回歸模型評估NOP56是否為影響肝癌患者總生存期的獨立危險因素。P<0.05時差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 NOP56在肝細胞癌中高表達 筆者利用HCCDB數據庫中發現,與鄰近的正常組織相比,HCC中NOP56 mRNA表達更高(P<0.01)。Oncomine數據庫中得出類似的結果(P<0.01 &logFC>2)。此外,值得注意的是,肝硬化中NOP56 mRNA水平高于正常組織(P<0.01 &logFC=1.3)。因此,這些結果表明NOP56可能是正常肝組織發展至肝硬化、肝癌的關鍵分子。

2.2 NOP56與臨床相關性 通過下載TCGA的肝細胞癌數據進行分析,進一步證明了NOP56 mRNA在HCC組織的高表達。NOP56的表達與肝細胞癌分級正相關(P<0.01),無肝細胞癌家族史患者NOP56的表達高于有肝細胞癌家族史患者(P<0.01),有鄰近肝組織驗證患者NOP56的表達高于無鄰近肝組織驗證患者(P<0.01)。

2.3 NOP56高表達的患者具有相對差的預后 為了進一步評估NOP56評估肝細胞癌的預后價值,筆者使用了KMPLOT對肝細胞患者進行生存分析。這些結果表明,在NOP56 mRNA高表達組中,肝細胞癌患者的OS(總體生存期)(log-rank test,P<0.05)、PFS(無進展生存期)(log-rank test,P<0.05)、RFS(無復發生存期)(log-rank test,P<0.05)和DSS(疾病特異性生存期)(log-rank test,P<0.05)相對于NOP56低表達組顯著減少。此外,筆者對370個肝細胞癌患者進行了亞組生存分析并發現除女性肝癌患者、肝癌Ⅱ期患者和飲酒的肝癌患者以外,所有肝癌亞組中NOP56 mRNA高表達的患者均與較差的OS及PFS相關(P<0.05)。此外NOP56 mRNA高表達的女性肝癌患者及飲酒肝癌患者與較短的OS相關。多因素COX回歸分析提示NOP56是OS的獨立危險因素。

2.4 NOP56的基因網絡 通過GeneMAINA數據庫構建基于NOP56的蛋白互作網絡,這些分子富集于核糖體生物發生和rRNA代謝過程,表明NOP56可能通過這些生物學過程促進腫瘤的發生發展。 通過WebGestalt數據庫分析上述網絡,筆者發現放射菌素D可能是影響NOP56蛋白分子的關鍵藥物(見表1)。

表1 靶向基因藥物

2.5 NOP56 表達的生物學功能分析 為了進一步探索NOP56潛在的生物學機制,通過Spearman檢驗將肝細胞癌mRNA表達譜分為正相關組(cor>0)和負相關組(cor<0),然后進行以KEGG注釋的GSEA。如圖1所示,正相關組主要富集于核糖體、DNA復制、細胞周期。此外,負相關組富集于脂肪酸、氨基酸和丁酸等的代謝。

圖1 NOP56的KEGG富集分析

3 討論

筆者使用了不同的數據庫評估了NOP56在肝細胞癌中的表達,這些結果都表明肝細胞癌NOP56 mRNA的表達顯著高于正常組織。此外,NOP56高表達組的OS、PFS、RFS和DSS明顯少于NOP56的低表達組。然而, Ⅱ期肝細胞癌患者NOP56高低表達組的OS無明顯差異(P>0.05),考慮到Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ肝癌患者的高低表達組存在顯著差異(P<0.05)。筆者認為Ⅱ期肝細胞癌患者NOP56高低表達組無明顯差異的原因可能是抽樣誤差。因此,這些結果強烈表明NOP56的表達可能有助于肝癌患者的診斷和預后評估。然而TCGA數據庫中的Ⅳ期肝癌患者相對較少,但這些患者剛發現肝癌已經就是肝癌晚期,預后極差。因此,有必要通過足夠的不同階段的樣本來進一步證明筆者的結論。

基因的調控就像多米諾骨牌,只要存在單個基因的錯誤調控就會導致下游基因的失調,這是導致癌癥發生發展的根本原因之一。筆者對以NOP56為核心的蛋白互作網絡進行富集分析,發現這些基因主要參與核糖體生物發生和rRNA代謝,這些功能與目前的研究一致[5-6],筆者接著使用了WebGestalt數據庫分析NOP56網絡,發現了放射菌素D是影響NOP56發揮致癌作用的關鍵藥物。事實上,放射菌素D是臨床上常見的抗腫瘤藥物,目前主要應用于一些小兒腫瘤,如肌肉瘤、腎母細胞瘤、尤文氏肉瘤等[7-8]。多項研究表明,低濃度的放射菌素D可以破壞核糖體的生物學過程,最終導致細胞周期停滯和凋亡[9]。最新研究表明,放射菌素D通過調控CD133顯著抑制肝癌干細胞(LCSCs),并且不損傷正常的肝細胞[10]。根據這些研究筆者可以推測放射菌素D對肝細胞癌的治療作用也可以通過靶向NOP56來實現,有待進一步的實驗證據。為了進一步揭示NOP56的潛在功能,筆者對NOP56正負相關組進行可富集分析。結果表明,正相關組富集于DNA復制、核糖體、細胞周期,負相關組富集于脂肪酸、氨基酸和丁酸等的代謝。結合對以NOP56為中心的基因網絡的功能分析,筆者的研究進一步證明NOP56可能通過調節核糖體影響癌癥的發展。一項研究表明,在NOP56基因敲除后,乳腺癌細胞G0/G1細胞周期明顯停滯[11]。另一項研究表明,在促進NOP56過度表達后,HEK293細胞凋亡或S期數量減少,而G2/M期細胞數量增加2倍[12]。因此,NOP56可能通過影響細胞周期通路促進肝細胞癌的發生發展。

本研究通過多個隊列研究證明了NOP56在肝細胞癌的高表達,并通過KM法及構建多因素COX回歸證明的NOP56在肝細胞癌的預后價值。此外,構建了以NOP56為核心的基因網絡,并預測了靶向該網絡的藥物。最后通過GSEA計算了NOP56在肝細胞癌所影響的潛在通路。綜上所述,NOP56是評估肝細胞癌患者的一種新型的預后指標,可能為潛在的治療靶標。