腱蛋白樣蛋白2 在胃癌中的表達及臨床意義△

吳倍佩，左云，倪晨，朱惠平，張永芹，張王吉，錢曉蘭，張敏，蔣健

蘇州大學附屬張家港醫院腫瘤科，江蘇 張家港 2156000

胃癌是目前全球范圍內第五大腫瘤，每年有超過100 萬新發病例，由于胃癌早期診斷率低，大多數患者在診斷時已是晚期，錯過了最佳的手術時機，病死率很高，因此胃癌是全球范圍內第三大腫瘤死因，在2018 年全球有78.4 萬例胃癌患者死亡[1-2]。晚期胃癌患者的主要治療方法是聯合使用放化療、分子靶向治療和免疫治療，但療效并不理想，患者5 年生存率僅為30%～40%[2-3]。因此，探索具有診治價值的生物標志物對胃癌患者早期診斷、治療及預后評估具有重要臨床意義。骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）屬于轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族，可調控上皮細胞更新、增殖和分化，還具有強大的抗腫瘤活性[4]。腱蛋白樣蛋白2（chordin like 2，CHRDL2）是一種分泌蛋白，是BMP 的拮抗劑，可以阻止BMP 與其識別的細胞表面受體相互作用[5-6]。研究發現，CHRDL2 高表達與乳腺癌、結直腸癌、骨肉瘤的預后不良相關[7-9]。目前國內尚無CHRDL2 表達與胃癌患者預后關系的相關報道，本研究探討胃癌組織中CHRDL2 的表達情況，并分析CHRDL2 表達情況與胃癌患者臨床特征的關系及對預后的影響，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2015 年1 月至2016 年6 月于蘇州大學附屬張家港醫院接受手術治療的86 例胃癌患者作為研究對象，術中取得86 例胃癌組織及79 例對應的癌旁組織。所有患者均經病理檢查確診為胃腺癌，未合并其他腫瘤，并且均未行術前放化療及其他抗腫瘤治療。86 例胃癌患者中，男性56 例，女性30 例；平均年齡（67.74±12.74）歲。本研究經醫院倫理委員會批準通過，所有患者均知情同意。

1.2 主要試劑

兔抗CHRDL2 多克隆抗體購自艾博抗（上海）貿易有限公司，生物素高效標記山羊抗兔二抗、二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）辣根過氧化物酶顯色試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.3 免疫組化染色方法

術中取得的新鮮胃癌組織及癌旁組織標本均經10%甲醛固定，石蠟包埋后進行4 μm 厚連續切片。將石蠟切片進行二甲苯、梯度乙醇脫蠟和水化；用3%過氧化氫消除內源性過氧化物酶活性，室溫避光孵育20 min，磷酸鹽緩沖液洗滌5 min×3次；加入檸檬酸鈉緩沖液進行抗原修復；滴加10%正常山羊血清室溫封閉30 min；滴加兔抗CHRDL2多克隆一抗（1∶100）于4 ℃孵育過夜；待切片復溫后采用磷酸鹽緩沖液洗滌5 min×3 次，加入生物素高效標記的山羊抗兔二抗室溫孵育40 min；磷酸鹽緩沖液洗滌5 min×3 次，滴加鏈霉親和素-生物素復合物（streptavidin-biotin complex，SABC）工作液孵育30 min；磷酸鹽緩沖液洗滌5 min×3 次，滴加DAB 顯色，在光學顯微鏡下控制顯色程度；蘇木精復染、脫水、透明、封片。

1.4 免疫組化染色結果判定

CHRDL2 定位于細胞質，染色細胞中見棕黃色顆粒狀蛋白。免疫組化結果由3 名資深病理科醫師同時讀片評分，若結果不一致，則復閱達成一致意見。每張切片隨機計數10 個高倍視野（×200），每個視野計數100 個細胞并統計分數。按陽性細胞所占比例評分：無陽性細胞計0 分，≤25%計1 分，26%～50%計2 分，51%～75%計3 分，＞75%計4 分。按染色強度評分：無著色計0 分，淡黃色計1 分（+），黃色或棕黃色計2 分（++），棕褐色或褐色計3分（+++）。總評分=陽性細胞所占比例評分×染色強度評分，總評分≤4 分為CHRDL2 低表達，5～12 分為CHRDL2 高表達。

1.5 隨訪

以門診復診或電話等方式對胃癌患者進行隨訪，總生存期為術后至隨訪截止時間（2022 年7 月）或患者死亡時間，記錄患者預后情況，分析CHRDL2 蛋白表達水平與胃癌患者預后的關系。

1.6 統計學方法

采用SPSS 26.0 統計軟件進行數據分析，計數資料以例數及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，生存情況的比較采用Log-rank 檢驗；影響因素分析采用Cox 多因素回歸分析；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌組織與癌旁組織中CHRDL2 表達情況的比較

免疫組化結果顯示，胃癌組織中CHRDL2 陽性表達呈棕黃色，主要位于細胞質（圖1）。79 例胃癌組織標本中，49 例（62.0%）患者CHRDL2 高表達，30 例（38.0%）患者CHRDL2 低表達；79 例癌旁組織標本中，16 例（20.3%）患者CHRDL2 高表達，63 例（79.7%）患者CHRDL2 低表達；胃癌組織中CHRDL2 蛋白高表達率明顯高于癌旁組織，差異有統計學意義（χ2=28.464，P＜0.01）。

圖1 胃癌組織及癌旁組織中CHRDL2的表達情況（免疫組化染色，×200）

2.2 不同臨床特征胃癌患者胃癌組織中CHRDL2蛋白表達情況的比較

不同性別、年齡、病理分級、腫瘤直徑、T分期及TNM 分期胃癌患者的胃癌組織中CHRDL2 蛋白表達情況比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；N1～3期胃癌患者的胃癌組織中CHRDL2 蛋白高表達率高于N0期患者，差異有統計學意義（P＜0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征胃癌患者胃癌組織中CHRDL2 蛋白表達情況的比較

2.3 不同CHRDL2 蛋白表達情況胃癌患者預后的比較

CHRDL2 低表達患者的總生存率高于CHRDL2 高表達患者，差異有統計學意義（χ2=5.196，P=0.023）。（圖2）

圖2 CHRDL2蛋白高表達（n=54）與低表達（n=32）胃癌患者的生存曲線

2.4 胃癌患者預后影響因素的單因素及多因素Cox 回歸分析

單因素Cox 回歸分析結果顯示，CHRDL2 表達、病理分級、腫瘤直徑、T 分期、N 分期、TNM 分期可能是胃癌患者預后的影響因素。將單因素分析中差異有統計學意義的因素納入Cox 多因素回歸分析，結果顯示，腫瘤直徑＞5 cm、TNM 分期為Ⅲ～Ⅳ期均為胃癌患者預后的獨立危險因素（P＜0.05）。（表2）

表2 胃癌患者預后影響因素的單因素及多因素Cox 回歸分析

3 討論

胃癌是一種侵襲性疾病，5 年生存率低，全球疾病負擔沉重。目前，盡管許多基因在胃癌中的作用機制尚不清楚，但它們對預后的預測價值已被確定，可以根據腫瘤的生物學行為和對系統治療的反應來對患者進行分層[10]。

BMP 是一種重要的分泌型細胞因子，是TGF-β超家族中的一員，也是TGF-β超家族的細胞內信號轉導媒介[11-12]，能夠抑制腫瘤的發生[13-16]。CHRDL2是BMP 細胞外拮抗劑，是與BMP 配體結合以干擾其功能的分泌性蛋白，可以下調TGF-β超家族信號，促進腫瘤發展。有研究發現，通過抑制劑Noggin拮抗BMP2 加速了胃癌細胞的增殖[17]。研究表明，CHRDL2 不僅在乳腺癌中高表達，而且在肺癌和結腸癌中也高表達[9]。據報道，高水平CHRDL2 通過上調細胞周期蛋白D1（cyclin D1）和下調p21 來促進結直腸癌細胞在體外和體內的增殖，并且證明高水平CHRDL2 與結直腸癌患者的預后不良相關[8]。此外，CHRDL2 在骨肉瘤中表達上調，并且通過激活BMP9/磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）信號通路促進骨肉瘤細胞的增殖和遷移[7]。為了研究CHRDL2與胃癌發生發展之間的關系，本研究分析了CHRDL2 在胃癌組織及癌旁組織中的表達情況及對預后的影響。

本研究結果表明，CHRDL2 蛋白位于胃癌細胞的細胞質中，并且胃癌組織中CHRDL2 高表達率明顯高于癌旁組織，表明CHRDL2 可能與胃癌發生相關。此外，N1～3期胃癌患者的胃癌組織中CHRDL2 蛋白高表達率高于N0期患者（P＜0.05）；CHRDL2 表達與患者性別、年齡、病理分級、腫瘤直徑、T 分期及TNM 分期無關，這表明CHRDL2 可能參與胃癌淋巴結轉移。生存分析結果顯示，CHRDL2 低表達患者的總生存率高于CHRDL2 高表達患者，表明CHRDL2 可能作為判斷胃癌預后的生物標志物。最后，Cox 多因素分析結果表明，CHRDL2 表達不是胃癌患者預后的獨立影響因素。

然而，本研究的不足之處在于未深入探討CHRDL2 對胃癌發生發展的作用機制；其次本研究樣本量較少，影響因素分析不夠全面，因此在今后的研究工作中需要擴大樣本量，同時對胃癌預后的影響因素進行全面探討。

綜上所述，胃癌組織中CHRDL2 呈高表達，CHRDL2 表達與胃癌患者淋巴結轉移及生存期有關，CHRDL2 可能作為預測腫瘤發生、發展以及患者預后的新的生物標志物，為胃癌臨床診治提供新思路。