特異性頂部盤狀底板反應蛋白3 在結直腸腺癌中的表達△

沈寧辰，王覓柱

1內蒙古科技大學包頭醫學院研究生學院，內蒙古 包頭 014030

2內蒙古科技大學包頭醫學院第二附屬醫院消化科，內蒙古 包頭 0140300

結直腸癌是一種常見的惡性腫瘤，其發病率及病死率均居惡性腫瘤前列。中國結直腸癌發病率呈逐年上升趨勢，世界衛生組織國際癌癥研究機構（International Agency for Research on Cancer，IARC）數據顯示，中國2020 年結直腸癌新發病例56 萬例，病死29 萬例[1]。結直腸癌的發生大多遵循“腺瘤-癌”的發病機制，在該機制下從腺瘤發展到癌一般需要5～10 年，為結直腸癌的早期發現、早期診斷、早期治療提供了重要的窗口期[2]。因此研究結直腸癌分子標志物和治療靶點尤為重要。特異性頂部盤狀底板反應蛋白（roof plate-specific spondin，RSPO）是新興的成年人干細胞調節因子，研究發現，RSPO 在白血病[3]、乳腺癌[4]、宮頸癌[5]、膀胱癌[6]、食管癌[7]、胃癌[8]、結直腸癌[9-10]等多種惡性腫瘤中均異常表達，在各種惡性腫瘤中發揮不同的作用。已有研究發現，RSPO3 在結直腸癌中起著促癌和抑癌兩種截然相反的作用。本研究探討RSPO3 在結直腸腺癌中的表達，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2021 年6—12 月內蒙古科技大學包頭醫學院第二附屬醫院收治的結直腸腺瘤和結直腸腺癌患者。納入標準：均經病理學檢查確診為結直腸腺瘤或結直腸腺癌；既往未接受過放化療；病歷資料完整。排除標準：合并其他惡性腫瘤；合并其他免疫系統疾病；存在遺傳性結直腸癌家族史。依據納入和排除標準，本研究共納入30 例結直腸腺瘤和30 例結直腸腺癌患者。結直腸腺癌患者中，男19 例，女11 例；年齡49～86 歲；分化程度：低分化4 例，中分化25 例，高分化1 例；淋巴結轉移2例，無淋巴結轉移28 例。結直腸腺瘤患者中，男14例，女16 例；年齡37～66 歲。兩組患者性別、年齡比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準通過，所有患者均知情同意。

1.2 蛋白質印跡法（Western blot）檢測RSPO3 及β-catenin、Bcl-2 相關X 蛋白（Bcl-2-associated X protein，BAX）的相對表達量

取30 例結直腸腺瘤組織及瘤旁5 cm 處正常組織、30 例結直腸腺癌組織及癌旁5 cm 處正常組織。研磨、裂解細胞提取蛋白，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測定蛋白濃度，根據蛋白濃度，定量定體積配置上樣液。制備8%分離膠和濃縮膠，將膠板固定于電泳儀中，加入電泳液，定量定體積加入上樣液，以恒定電壓進行電泳，上樣液在濃縮膠內使用恒壓80 V，約30 min，當上樣液進入分離膠后，調整為恒壓120 V，約70 min，當溴酚藍到達下膠邊緣關掉電源。將聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜置于無水甲醇中激活1 min，制作轉膜“三明治”，由陰極至陽極，依次以海綿、濾紙、凝膠、PVDF 膜、濾紙、海綿的順序疊放，置入轉膜儀中，以390 mA 的恒定電流轉膜70 min。封閉并孵育一抗、二抗。將電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）液的A 液和B 液按1∶1的比例配置，現配現用，將配置好的ECL工作液滴加至膜上，孵育1 min，在暗室內進行顯影，根據顯影的效果，調整曝光的時間，以β-actin 為內參，計算RSPO3、BAX、β-catenin蛋白的相對表達量。

1.3 免疫組化法檢測RSPO3、BAX、β-catenin 蛋白的表達情況

取30 例結直腸腺瘤組織及瘤旁5 cm 處正常組織、30 例結直腸腺癌組織及癌旁5 cm 處正常組織，固定于載玻片上，65 ℃、90 min 進行烤片，于100%二甲苯中脫蠟3 次，每次10 min，按100%、95%、85%、75%梯度乙醇水化，每次5 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗3 次，每次3 min。稀釋乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）抗原修復液至pH 值=8.0 進行抗原修復，高溫高壓修復20 min，室溫下自然冷卻，PBS 沖洗3 次，每次3 min。濕化盒中，滴加3%H2O2覆蓋組織，室溫放置10 min，PBS 沖洗3 次，每次3 min。濕化盒中，滴加正常山羊血清封閉液，室溫放置20 min，甩去多余液體，免沖洗。滴加一抗兔抗人RSPO3、BAX、β-catenin 單克隆抗體（稀釋比例1∶100），每張切片40 μl，每種樣品留片1 張，更替抗體為生理鹽水40 μl（陰性對照），置于濕化盒中防止干燥，4 ℃孵育過夜，次日復溫40 min，濕化盒中，滴加酶標山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）聚合物，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3 次，每次3 min。濕化盒中滴加鏈霉親和素-POD 工作液，37 ℃孵育30 min，PBS 沖洗4 次，每次5 min。滴加二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）溶液顯色，顯微鏡下觀察顯色完成后，蒸餾水沖洗終止染色，蘇木素復染，流動水沖洗2 min。鹽酸乙醇分化5 s，流動水沖洗2 min，氨水返藍。75%、85%、95%、100%梯度乙醇脫水，每次5 min，二甲苯脫蠟透明5 min，蓋玻片封片，顯微鏡下觀察RSPO3、BAX、β-catenin 蛋白的表達情況。

結果判定：RSPO3、BAX 主要定位于細胞質，β-catenin 主要定位于細胞質和細胞核，呈棕黃色顆粒判定為陽性細胞。根據染色強度和陽性細胞所占比例進行評分，未著色計0 分，淡黃色染色計1分，棕黃色染色計2 分，黃褐色染色計3 分；陽性細胞所占比例為0%計0分，陽性細胞所占比例為1%～33%計1 分，陽性細胞所占比例為34%～66%計2分，陽性細胞所占比例為67%～100%計3 分。將染色強度評分和陽性細胞所占比例評分相加，≤3 分判定為低表達，≥4 分判定為高表達。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0 軟件對所有數據進行統計分析，正態分布計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Spearman 相關分析；以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RSPO3、β-catenin、BAX 蛋白相對表達量的比較

結直腸腺癌組織中RSPO3、β-catenin 的相對表達量均高于結直腸腺癌癌旁正常組織，結直腸腺瘤組織中RSPO3、β-catenin 的相對表達量均高于結直腸腺瘤瘤旁正常組織，結直腸腺癌組織中RSPO3、β-catenin 的相對表達量均高于結直腸腺瘤組織，差異均有統計學意義（P＜0.05）。結直腸腺癌組織中BAX 的相對表達量低于結直腸腺癌癌旁正常組織，結直腸腺瘤組織中BAX 的相對表達量低于結直腸腺瘤瘤旁正常組織，結直腸腺癌組織中BAX 的相對表達量低于結直腸腺瘤組織，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（圖1、表1）

表1 結直腸腺癌及癌旁正常組織、結直腸腺瘤及瘤旁正常組織中RSPO3、β-catenin、BAX 相對表達量的比較（x-x-±s）

圖1 Western blot檢測結直腸腺癌及癌旁正常組織、結直腸腺瘤及瘤旁正常組織中RSPO3、β-catenin、BAX 的表達情況

2.2 RSPO3、β-catenin、BAX 蛋白表達情況的比較

結直腸腺癌組織、結直腸腺癌癌旁正常組織及結直腸腺瘤組織中RSPO3、β-catenin、BAX 蛋白表達情況比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；結直腸腺癌組織中RSPO3、β-catenin 蛋白高表達率均高于結直腸腺癌癌旁正常組織及結直腸腺瘤組織，BAX 蛋白高表達率低于結直腸腺癌癌旁正常組織及結直腸腺瘤組織，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表2、圖2）

表2 結直腸腺癌組織、結直腸腺癌癌旁正常組織及結直腸腺瘤組織中RSPO3、β-catenin、BAX蛋白表達情況的比較[n（%）]

圖2 免疫組化法檢測結直腸腺癌組織、結直腸腺癌癌旁正常組織及結直腸腺瘤組織中RSPO3、β-catenin、BAX蛋白的表達情況（鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶染色，×400）

2.3 結直腸腺癌組織中RSPO3 與β-catenin、BAX表達的相關性

Spearman 相關分析結果顯示，結直腸腺癌組織中RSPO3 的表達與β-catenin 的表達呈正相關（r=0.936，P＜0.05），RSPO3 的表達與BAX 的表達無相關性（r=0.333，P＞0.05）。

3 討論

RSPO 是新興的成年人干細胞調節因子，影響干細胞的增殖與分化。RSPO 的結構域高度保守：N 末端疏水的分泌信號肽序列，兩個富含半胱氨酸的furin-like 結構域，一個血小板反應蛋白結構域，C 末端帶有不同電量的正電荷。RSPO 蛋白家族（RSPO1～4）在胚胎的發育過程中發揮作用，并且每種蛋白都具有獨特的作用[11]。研究顯示，RSPO家族蛋白主要通過WNT/β-catenin 信號通路發揮生物學效應[12]。β-catenin 是WNT 信號通路的重要調節蛋白，在WNT 信號通路激活的細胞中由細胞質進入細胞核成為轉錄激活因子，激活促使細胞分裂的基因。

本研究結果顯示，結直腸腺癌組織中RSPO3的表達上調，且高于結直腸腺癌癌旁正常組織及結直腸腺瘤組織。Spearman 相關分析結果顯示，結直腸腺癌組織中RSPO3 的表達與β-catenin 的表達呈正相關（P＜0.05）。RSPO3 可通過WNT 信號通路激活下游信號因子β-catenin 的表達，促使β-catenin 由細胞質進入細胞核，激活相關的轉錄激活因子，啟動促使細胞激活的基因。RSPO3、β-catenin 可作為結直腸腺癌侵襲和轉移的標志物。本研究初步證實了RSPO3、WNT/β-catenin 信號通路可能參與了結直腸腺癌的惡性生物學行為，RSPO3 可能作為結直腸腺癌潛在的治療靶點。

綜上所述，RSPO3 在結直腸腺癌組織中高表達，可能作為結直腸腺癌臨床治療的潛在靶點。