蘇北沿海保護地耐鹽堿辣椒品系(種)對炭疽病的果期抗性評價

張麗娜 梅燚 王薇薇 吳永成 陳長軍 劉哲 沈峰 馮汝超 祖艷俠 鄭佳秋

摘要：辣椒炭疽病是辣椒生產的主要病害之一，是一種由復合真菌類群引起的真菌性病害，多危害果實，嚴重降低辣椒品質和市場價值，抗性品種培育是重要的育種目標。通過對鹽城、連云港、南通地區辣椒種植區進行炭疽病病原菌分離、純化，分析其形態特征，同時通過基因序列分析確定當地炭疽病優勢致病菌，以高致病力炭疽病優勢致病菌尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）C18為接種菌，采用菌碟接種法對128份沿海地區耐鹽堿辣椒材料進行抗炭疽病篩選。結果表明，沿海地區辣椒炭疽病的優勢致病菌為尖孢炭疽菌；羊角椒資源中，有7份高抗辣椒資源，有21份抗病資源，23份耐病資源，以漢豐一號作為對照，炭疽病抗性顯著優于漢豐一號的羊角椒資源有23份，其中包括沿海地區農業科學研究所最新登記的鹽椒4號品種；牛角椒資源中，有7份耐病資源。沿海地區炭疽病原菌多樣性調研和高抗炭疽病辣椒材料的篩選發掘為沿海地區辣椒抗病育種和抗性基因發掘提供了堅實的材料基礎。

關鍵詞：辣椒；炭疽??；致病菌；抗性鑒定

中圖分類號：S436.418.1+1? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）13-0121-06

辣椒（Capsicum annum L.）是我國產值最大的蔬菜之一，且我國辣椒種植面積及產量均呈逐年增長的趨勢，是全球產量最多的地區。據聯合國糧食與農業組織（FAO）統計，2021年我國辣椒種植面積約82.7萬hm2，產量達2 013萬t（https：//www.fao.org/faostat/）。辣椒也是江蘇沿海地區主栽蔬菜作物，由于沿海地區土壤含鹽量高，辣椒風味獨特［1］，深受消費者青睞。但由于沿海地區辣椒的連年種植，辣椒生產過程中病害問題愈發嚴重，尤其是辣椒炭疽病發病率持續增長，一般年份辣椒平均果實發病率為10%～15%，最嚴重時甚至達到50%以上［2］，已經嚴重威脅到辣椒的種植和產業發展。

目前，辣椒炭疽病的防治手段主要包括農業防治、化學防治和生物防治。但農業防治效果有限，化學防治帶來的抗藥性、農藥殘留、環境污染和健康問題日益嚴重，而生物防治手段尚不成熟，防治效果不穩定，難以廣泛應用于生產實踐，因此推廣和使用抗病品種是辣椒生產上防治炭疽病最經濟有效的方法。優質抗炭疽病品種是發掘抗性基因的材料基礎，由于沿海地區辣椒品種的選育一直集中在耐鹽堿特性的篩選，免疫和高抗炭疽病辣椒資源匱乏，使得沿海地區辣椒炭疽病抗病育種一直未取得有效突破，迫切需要在沿海地區耐鹽堿種質資源的基礎上篩選炭疽病高抗種質資源。

辣椒炭疽病主要侵染辣椒葉片和果實［3］。葉片病斑初為褪綠水漬狀斑點，逐漸變為褐色，病斑近圓形而中間為淡灰色。果實上發病，先產生水浸狀黃褐色斑，擴大后呈圓形或不規則形斑、稍凹陷，具稍隆起的同心環狀斑，斑上生黑色或紅色小點，潮濕時溢出淡紅色黏質物（病菌的分生孢子盤和分生孢子），干燥時病斑常干縮似羊皮紙，易破裂［2］。不同地區辣椒炭疽病病菌種類不同，同一地區不同辣椒品種辣椒炭疽病菌也不同［4-6］，已報道的辣椒炭疽病的病原菌主要為膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporoides）、黑色炭疽菌（C. nigrum）、黑點炭疽菌（C. capsici）、尖孢炭疽菌（C. acutatum），但沿海地區辣椒炭疽病的優勢致病菌尚不明確。確定沿海地區辣椒炭疽優勢病原菌，對制定辣椒炭疽病的防治方案及選育抗病品種具有重要的意義。

針對上述問題，本研究自江蘇鹽城、連云港、南通地區采集了辣椒炭疽病病樣，分離鑒定沿海地區辣椒炭疽病的優勢致病菌小種，并在沿海地區耐鹽堿種質資源的基礎上篩選出能夠高抗炭疽病當地優勢致病小種的種質資源。研究結果旨在為沿海地區優質辣椒炭疽病抗病品種的培育建立優質的抗病種質資源庫，對滿足生產需求、提高辣椒產能具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試標準菌株C18為南京農業大學殺菌劑生物學實驗室陳長軍教授提供的尖孢炭疽病菌（C. acutatum）高致病力菌株，該菌株分離自江蘇鹽城。尖孢炭疽菌株轉接到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）平板上，在26 ℃恒溫培養箱中黑暗培養5 d后備用。

本研究以江蘇沿海地區農業科學研究所多年選育的辣椒品系為試材，穴盤育苗，塑料大棚栽培，采收成熟期無病、整齊的青果接種，重復3次，每個重復16果，每果根據果實大小接種1～3處。

1.2 試驗方法

1.2.1 辣椒炭疽病菌菌株分離

辣椒病樣2021年采集自江蘇鹽城、連云港和南通。病樣采回后從病健交界處切取小塊組織，經75%乙醇浸泡3 s后，用滅菌水沖洗，晾干，置于含有硫酸鏈霉素的PDA平板上培養5 d，取菌落邊緣的小塊菌碟轉接到新的PDA平板上，培養5 d后，保存，備用。

1.2.2 病原菌的形態學鑒定

病原菌在26 ℃下于PDA平板培養5 d，菌落邊緣取5 mm大小菌餅至新PDA平板，26 ℃培養7 d后，觀察菌落形態生長變化。光學顯微鏡下觀察炭疽病菌的分生孢子大小、形態等顯微特征。

1.2.3 病原菌的分子鑒定

采用真菌DNA快速提取試劑盒（廣州索萊寶生物科技有限公司）提取菌株DNA，0.8%瓊脂凝膠電泳檢測提取產物，-20 ℃保存備用。采用ITS1/ITS4通用引物對ITS序列進行PCR擴增，選取陽性克隆送至南京金斯瑞生物科技有限公司測序。將測序所得序列在GenBank數據庫里進行序列比對，在MEGA 11軟件中采用Clustal W方法進行序列比對，進而采用最大簡約法（maximum parsimony，簡稱MP）構建系統發育樹，分析親緣關系。

1.2.4 病原菌的致病力測定

病原菌致病力測定采用針刺法接種辣椒［7］。選取分離到的16株尖孢炭疽病菌和C18菌株到PDA平板，5 d后從菌落外周處取直徑5 mm菌碟。用滅菌的1 mm注射器針頭在漢豐一號辣椒表面人為制造深約為1 mm的傷口，將制備好的菌碟隨機接種在辣椒傷口表面，以無菌瓊脂塊接種作為對照，每個處理6次重復，每個重復5個果實。接種好的辣椒放置于26 ℃培養箱保濕培養5 d后記錄病斑直徑。

1.2.5 炭疽病抗性鑒定

辣椒果期抗病性鑒定采用針刺法［7-8］，略有改進。將活化的尖孢炭疽菌株轉接到PDA平板上，5 d后從菌落外周1/3處制備菌碟。試驗于2021年進行，辣椒材料種植于江蘇沿海地區農業科學研究所新洋試驗基地，采集轉色期果實，75%乙醇表面消毒并晾干后，用直徑1 mm的注射器針頭刺穿果實表皮，制造深約1 mm的傷口，將制備好的菌碟隨機接種在辣椒傷口表面，每種品系（種）辣椒設置3～6次重復，每個重復5個果實。接種好的辣椒放置于26 ℃培養箱保濕培養5 d后檢查結果。

成熟果病級調查分級標準：0 級，無病斑；1級，病斑直徑≤0.5 cm；2級，病斑直徑>0.5～1.0 cm；3級，病斑直徑>1.0～2.0 cm，病斑上無霉或有少量霉層；4級，病斑直徑>2.0～3.0 cm，病斑上霉層較多；5級，病斑直徑>3.0 cm，病斑上有大量霉層。

病害嚴重度=∑（發病植株數×病級數）/（總植株數×最高病級數）×100%；

品系群體抗病性劃分標準：高抗（HR），病害嚴重度0～20.0；抗?。≧），病害嚴重度20.1～40.0；耐?。═），病害嚴重度40.1～50.0；感?。⊿），病害嚴重度>50.0。

1.3 數據處理

試驗數據以“平均值±標準差”表示，在Excel中進行基本處理后，使用SPSS進行差異顯著性分析，使用LSD Test（α=0.05）。

2 結果與分析

2.1 病原菌的菌落特征和形態

試驗共分離18個菌株。經ITS鑒定，其中16株為尖孢炭疽病菌（C. acutatum），1株為鏈格孢屬（Alternaria spp.）菌株，1株為鐮刀菌屬（Fusarium spp.）菌株。因此，沿海地區炭疽病主要致病菌為尖孢炭疽病菌。尖孢炭疽菌引起的辣椒炭疽病果上病斑褐色，水漬狀，呈橢圓形；菌落初期呈灰白色，絨毛狀，后期呈灰色，輪紋狀（圖1）。

2.2 病原菌的分子鑒定

將分離得到的16株尖孢炭疽菌的rDNA-ITS序列與炭疽菌屬所得序列進行序列比對和尖孢炭疽菌3株代表菌株及C18、膠孢炭疽菌、黑色炭疽菌、黑點炭疽菌進行系統發育分析，發現16株尖孢炭疽病菌與尖孢炭疽菌KJ627844、AJ749679、MH818319、C18聚在同一分支，親緣關系置信度99%，膠孢炭疽菌、黑色炭疽菌、黑點炭疽菌聚在另一分支（圖2）。

2.3 病原菌致病力測試

將尖孢炭疽菌標準菌株C18和16株分離到的尖孢炭疽菌接種到漢豐一號辣椒上，根據漢豐一號的病斑大小確定分離得到的幾株病原菌的致病力。結果表明（表1），標準菌株C18致病力和YC14、NT01、NT02、LYG03致病力相差不大，病斑直徑約為10 mm；YC11致病力最強，病斑直徑為14.05 mm；LYG18致病力最弱，病斑直徑為2.55 mm。

2.4 沿海地區耐鹽辣椒品系對炭疽病抗性鑒定

利用尖孢炭疽病原菌標準菌株C18對110份羊角椒資源和18份牛角椒資源進行炭疽抗性篩選（圖3）。結果表明，羊角椒資源（表2）中，有12份資源辣椒平均病斑直徑＜5 mm，有23份資源平均病斑直徑滿足5 mm≤R＜10 mm，剩余75份資源平均病斑直徑≥10 mm；牛角椒資源（表3）中，6份平均病斑直徑滿足5 mm≤R＜10 mm的資源，其他12份資源平均病斑直徑≥10 mm。根據品系抗病性劃分，羊角椒資源中，高抗辣椒資源有YHS1715、YHS0519、YHS1512、YHS0498、YHS1198、YHS2131、YHS1037共7份，抗病資源有YHS0247、YHS1933、YHS1c10、YHS5471、YHS1372、YHS0972、YHS2551、YHS3852、YHS9823、YHS6621、YHS5523、鹽椒4號、YHS4131、YHS5522、YHS85a1、YHS5520、YHS3861、YHS5614、YHS3121、YHS5243、YHS3833共21份，23份耐病資源，59份感病資源；牛角椒資源中，7份耐病資源，11份感病資源。目前，羊角椒是沿海地區廣泛種植的辣椒，其中漢豐一號是沿海地區種植規模最大，經濟效益最高的羊角椒品種，以漢豐一號作為對照，炭疽病抗性顯著優于漢豐一號的有23份羊角椒資源，其中包括了沿海地區農業科學研究所最新登記的鹽椒4號品種，是目前最優的值得推廣的抗炭疽病辣椒品種。

3 討論與結論

國內抗炭疽病辣椒品種十分稀缺，種質資源較少。張世才等對74份美國、西班牙等的辣椒種質資源進行尖孢炭疽菌的抗性鑒定，共篩選到2份高抗材料和2份抗病材料，抗病資源的僅占5.4%［9］。馬蓉群等以青島當地主要致病菌紅色炭疽菌對收集的73份辣椒資源進行炭疽病抗性鑒定，篩選到7份抗病材料，未篩選到免疫和高抗材料，抗病材料占比9.6%［10］。呂玲玲等對全國不同地區采集到的62份辣椒材料進行炭疽病抗性鑒別，共篩選到2份免疫資源，3份高抗資源，5份抗病資源，抗病性材料占比16.1%［11］。種質資源是育種工作的基石，而篩選抗病材料是抗病性育種的關鍵，所以對耐炭疽病辣椒資源的篩選與鑒定，對辣椒抗病性選育有重要意義。對于辣椒耐炭疽病材料的室內鑒定，國內多采取苗期噴霧接種的方式，在實際生產中，由于辣椒炭疽病菌主要在結果期侵染果實，因此，以接種離體果實的方法來評價辣椒對炭疽病抗性于辣椒育種而言更為準確［12］。同時，辣椒炭疽是一種復合侵染的真菌性病害，不同地區優勢致病菌存在差異，致病性也各不相同［3］，這也為炭疽病抗病材料的篩選帶來巨大的挑戰。

目前，辣椒炭疽病抗病性的鑒定主要依賴接種后觀察發病，外觀表現是受基因控制的，所以通過分子輔助篩選材料是否具備抗病基因是最可靠、最直接的鑒定材料抗病性的方法［13-14］。根據正向遺傳學研究思路，抗性基因的篩選，首先要基于抗原材料，構建分離群體，結合抗性表型和分子標記分離情況，找到與炭疽病抗性緊密連鎖的基因，為辣椒抗炭疽病育種提供依據［15-17］。

本研究對沿海地區辣椒炭疽病果實進行了病原菌分離純化和鑒定，共分離得到16株尖孢炭疽病菌，1株鏈格孢屬和1株鐮刀菌屬病原真菌，因此，沿海地區辣椒炭疽病的優勢致病菌為尖孢炭疽病菌。為篩選適應沿海地區的抗炭疽病辣椒種質資源，本研究對128份耐鹽辣椒種質資源進行尖孢炭疽菌抗性篩選，共篩選出7份高抗資源，21份抗病資源，為后期辣椒抗炭疽病品種的研發及抗性基因的遺傳和定位研究提供了材料基礎。本次鑒定僅用沿海地區主要致病菌尖孢炭疽病菌進行接種，但炭疽病的田間發病還存在其他致病菌，此次篩選到的抗病材料仍需進行進一步的鑒定和篩選，抗病資源的抗病機制及抗病遺傳規律尚不清楚，是下一步的研究重點。

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