高效液相色譜法測定雞血漿中L-肉堿含量

孫雯可，王佳璐，劉鼎闊，李源，于曉雪*，李留安*

（1.天津農學院動物科學與動物醫學學院，天津市農業動物繁育與健康養殖重點實驗室，天津 300392；2.鼎正新興生物技術（天津）有限公司，天津市生物飼料添加劑企業重點實驗室，天津 300383）

L-肉堿（L-carnitine），又名肉毒堿、左卡尼汀，化學式為C7H15O3N，相對分子質量為162.2，常溫下為白色，呈結晶粉末狀，在植物中含量少，主要存在于動物肝臟和骨骼肌內[1]。L-肉堿具有多種生理功能：L-肉堿作為轉運長鏈脂肪酸到線粒體內的載體，可通過促進脂肪酸的β-氧化，降低機體內多余的脂肪含量[2-3]；L-肉堿可清除過氧化氫、超氧陰離子，保護內源抗氧化酶系統，起到抗氧化作用[4-5]；外源補充L-肉堿可以減少氨基酸類添加劑和維生素的用量，提高飼料蛋白質的利用率，從而動物體內多余的氨基酸和相關活性離子可用來供給動物體其他生理活動。有研究證明，蛋雞日糧添加L-肉堿可改善生長期蛋雞的生產性能，提高產蛋量、雞蛋蛋品質和種蛋的孵化率[6]；肉雞日糧添加L-肉堿有助于提髙肉雞的飼料利用率、降低死亡率[7]。L-肉堿在畜禽養殖、水產養殖中的應用日益廣泛，建立準確、快速、高靈敏度檢測生物樣品中L-肉堿含量的方法，具有重要現實意義。

目前，L-肉堿的檢測方法有酶法測定法、分光光度色譜法、毛細管電泳色譜法[8]、液相色譜法等[9]。酶法測定方法易受干擾，影響結果準確性；分光光度色譜法重復性差，不適合大批量樣本檢測[10]；毛細管電泳色譜法的操作程序復雜性較高[11]。目前，常用高效液相色譜法來檢測L-肉堿，但L-肉堿極性強，不易在色譜柱上保留，故本試驗采用反向色譜分離技術，通過優化流動相組成和比例，改變流速及樣品提取方法，建立一種測定雞血漿中L-肉堿含量的高效液相色譜法，以期能夠快速簡便地檢測出雞血漿中的L-肉堿。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 材料與試劑

雞血漿由華北柴雞翅下采血，抗凝處理，4 000 r/min離心取上清液獲得，-80 ℃凍存；乙腈、甲醇（均為色譜純）：德國Merck 公司；L-肉堿標準品：北京索萊寶生物科技有限公司；庚烷磺酸鈉：上海吉至生化科技有限公司；磷酸（分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司。

1.1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀（1260）：美國安捷倫公司；色譜柱ACE Excel 5 Super C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）：廣州菲羅門科學儀器有限公司；超聲波清洗機（SB-100D）：昆山市超聲儀器有限公司；離心機（H1850R）：長沙高新技術產業開發區湘儀離心機儀器有限公司；0.22 μm濾膜：天津市南開區青創儀器儀表銷售商行。

1.2 反向色譜條件

色譜柱：ACE Excel 5 Super C18型色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-5mmol/L 庚烷磺酸鈉（加入0.1%磷酸）水溶液（15∶85，體積比）；流速0.6 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長210 nm；進樣量20 μL。

1.3 試驗方法

1.3.1 流動相的選擇

考察3 種不同流動相對L-肉堿檢測結果的影響：1）乙腈-5 mmol/L 庚烷磺酸鈉水溶液=10∶90（體積比）；2）乙腈-5 mmol/L 庚烷磺酸鈉（加入0.1%磷酸）水溶液=10∶90（體積比）；3）乙腈-5 mmol/L 庚烷磺酸鈉（加入0.1%磷酸）水溶液=15∶85（體積比）。

1.3.2 流速的選擇

0.4 mg/mL L-肉堿標準品在流速為0.6 mL/min 和0.7 mL/min 時分別進樣，考察流速對L-肉堿分離效果的影響。

1.3.3 樣品處理方法

處理方法1：取200 μL 血漿，加入2 mL 乙腈，4 000 r/min 離心，取上清液于5 mL 容量瓶中，用純水定容，抽取1 mL 溶液經0.22 μm 的有機濾膜注射入進樣瓶中，備用。

處理方法2：取200 μL 血漿，加入2 mL 乙腈甲醇混合液（9∶1，體積比），后續步驟同處理方法1。

1.3.4 標準曲線的繪制

取20 mg L-肉堿標準品，用20 mL 純水溶解，制成1 mg/mL 的標準品儲備液。準確吸取不同量標準品儲備液分別至于5 mL 容量瓶中，加純水稀釋至刻度并搖勻，分別配制成濃度為0.01、0.05、0.10、0.20、0.40、0.60 mg/mL 的標準品溶液，取20 μL 進樣，測定峰面積。以峰面積為縱坐標，標準品溶液濃度（mg/mL）為橫坐標，進行線性回歸分析。

1.4 數據處理

標準曲線、精密度、回收率和穩定性試驗數據由Microsoft Office Excel 軟件處理，數據為3 次測定的平均值。

2 結果與分析

2.1 流動相選擇

不同流動相對色譜峰的影響如圖1 所示。

圖1 不同流動相條件試驗色譜圖Fig.1 Chromatograms of different mobile phase conditions

圖1A、B 可知，流動相為乙腈-5 mmol/L 庚烷磺酸鈉水溶液=10∶90（體積比）時，0.1 mg/mL L-肉堿標準品保留時間為4.364 min，但在此條件下檢測不出樣品中L-肉堿；圖1C、D 可知，當流動相為乙腈-5 mmol/L庚烷磺酸鈉（加入0.1%磷酸）水溶液=10∶90（體積比）時，0.1 mg/mL L-肉堿標準品保留時間為11.278 min，但檢測不出樣品中L-肉堿；圖1E、F 可知，當流動相為乙腈-5 mmol/L 庚烷磺酸鈉（加入0.1%磷酸）水溶液=15∶85（體積比）時，0.1 mg/mL L-肉堿標準品保留時間為10.039 min，檢測樣品中L-肉堿峰形良好；圖1G、H可知，在乙腈-5 mmol/L 庚烷磺酸鈉（加入0.1%磷酸）水溶液=15∶85（體積比）的流動相條件下，標準品溶劑和樣品溶劑在10 min 處均無峰。因此后續試驗選擇乙腈-5 mmol/L 庚烷磺酸鈉（加入0.1%磷酸）水溶液=15∶85（體積比）為流動相。

2.2 流速選擇

不同流速對色譜峰的影響如圖2 所示。

圖2 不同流速對L-肉堿色譜峰的影響Fig.2 Influence of different flow rates on the chromatographic peak of L-carnitine

由圖2 可知，在流速為0.6 mL/min 時，L-肉堿保留時間為10.094 min，峰形良好且能與雜峰完全分離；在流速為0.7 mL/min 時，L-肉堿保留時間為8.708 min，峰形不好，拖尾嚴重，故流速選定為0.6 mL/min。

2.3 不同前處理條件優化

不同前處理條件對色譜圖的影響結果見圖3。

圖3 不同前處理方法提取L-肉堿對色譜峰的影響Fig.3 Effect of L-carnitine extraction by different pretreatment methods on chromatogram

由圖2 可知，用處理方法1 提取樣品，檢測出樣品中L-肉堿保留時間為10.075 min，峰面積響應值為2.732 mAU；用處理方法2 提取樣品，檢測出樣品中L-肉堿保留時間為10.118 min，峰面積響應值為4.076 mAU，峰形好，與雜質完全分離。處理方法2 比處理方法1 提取的L-肉堿量高，故本試驗采用處理方法2：乙腈甲醇混合液（9∶1，體積比）進行樣品處理。

2.4 標準曲線與線性范圍

對配制的標準系列溶液進行高效液相色譜法檢測，線性試驗結果見圖4。

圖4 標準曲線Fig.4 The diagram of standard curve

由圖4 可知，L-肉堿標準曲線方程為y=402.35x-0.228 3（R2=0.999 8），表明L-肉堿在0.01～0.60 mg/mL濃度范圍內具有良好線性關系。

2.5 檢出限與定量限

L-肉堿的檢出限為0.005 mg/mL，定量限為0.017 mg/mL。

2.6 精密度

相同色譜條件下將0.6 mg/mL 的L-肉堿標準品連續進樣6 次，檢測精密度，結果見表1。

表1 精密度試驗結果Table 1 Precision test results

如表1 所示，本方法精密度相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為0.8%（n=6），精密度良好。

2.7 回收率

將加標濃度為0.01、0.02、0.05 mg/mL 的雞血漿樣品分別進樣3 次，結果見表2。

表2 回收率試驗結果Table 2 Results of recovery rates

由表2 可知，L-肉堿的平均回收率在97.393%～98.703%，表明該前處理方法具有較高的回收率，能更準確地反映血漿中肉堿的含量。

2.8 穩定性

穩定性結果如表3 所示。

表3 穩定性試驗結果Table 3 Results of stability

由表3 可知，該方法穩定性RSD 為0.056%（n=5），表明該方法穩定性良好。

2.9 樣品分析

采用上述建立的方法對分離的血漿進行前處理和分析，測得雞血漿中L-肉堿含量為0.284 mg/mL。

3 討論

3.1 檢測條件的優化

L-肉堿的極性較強，在常規色譜系統中不易保留，但在酸性條件下，L-肉堿可以和離子對試劑反應生成離子對，延長在色譜柱上的保留時間，且在波長為210 nm 時，檢測出最大吸收峰[12-13]。本試驗在考察流動相的pH 值對L-肉堿出峰時間的影響時，發現在酸性條件下，L-肉堿保留時間更長且檢測樣品中L-肉堿峰形良好，這與周文清[9]試驗結果相似，其研究發現，改變流動相pH 值能夠改變物質出峰時間，改善峰形，防止目標峰拖尾。有機試劑洗脫能力強，在色譜系統中，有機相比例增大會縮短物質保留時間。莫紫梅等[14]在檢測口服液中L-肉堿含量時發現，L-肉堿的保留時間隨著有機相比例增大而縮短，與本研究結果一致，本研究發現當乙腈比例為10%時，L-肉堿標準品保留時間為11.278 min，當乙腈比例為15%時，L-肉堿保留時間為10.039 min，但是在乙腈比例為10%時，檢測不出樣品中L-肉堿峰，乙腈比例為15%時，樣品中L-肉堿峰峰形良好，無雜峰干擾。綜合考慮峰形、物質分離度、保留時間等因素，最終選擇流動相條件為乙腈-5 mmol/L庚烷磺酸鈉（0.1%磷酸）水溶液（15∶85，體積比）。

流速主要影響柱壓和出峰時間，提升流速會使出峰時間提前，整體分析時間變短，但柱壓也會隨之上升，柱壓過高則會導致漏液，并且目標峰與雜峰不能很好地分離[15]。本試驗考察0.6 mL/min 和0.7 mL/min流速對L-肉堿出峰時間的影響，分析在不同流速進樣時，L-肉堿峰形及出峰時間的區別。結果表明，流速變化對分離效果有明顯影響，當流速為0.7 mL/min時L-肉堿保留時間為8.708 min，峰形拖尾；流速為0.6 mL/min 時，L-肉堿保留時間為10.094 min，峰形良好。綜合考慮峰形、柱壓和干擾峰等因素，最終選擇流速為0.6 mL/min。

3.2 樣品處理條件優化

L-肉堿具有良好的水溶性，易溶于甲醇、乙腈、乙醇等有機試劑[16-17]，且甲醇、乙腈具有沉淀蛋白的作用，可在去除雞血漿中蛋白質的同時有效提取L-肉堿，但單一試劑提取效果不好[18]，因此本試驗比較了純乙腈和乙腈甲醇（9∶1，體積比）混合液兩種前處理方法，分析不同處理對L-肉堿提取量及峰形的影響。結果顯示，用純乙腈提取時，L-肉堿提取濃度為0.146 mg/mL，峰形拖尾且與雜峰距離較近；用乙腈甲醇（9∶1，體積比）混合液提取時，L-肉堿提取濃度為0.284 mg/mL，峰形好，能與雜質完全分離。樣品處理時間影響檢測樣品數量，處理時間越短，檢測樣品數量越多，可大幅提高工作效率。目前提取血漿中L-肉堿的方法多為衍生化處理，步驟繁瑣，分析時間較長。唐笑等[19]在檢測羅非魚血漿中L-肉堿時，經沉淀蛋白質后，用衍生試劑反應90 min；丁峰等[20]、謝根英等[21]在提取病患血液中L-肉堿時，均采用衍生法進行提取，反應時間在1.5 h 左右。本試驗處理方法簡便且所用時間較短，綜合考慮提取量、峰形及分析時間，最終選擇樣品用乙腈甲醇混合液（9∶1，體積比）進行處理。

4 結論

采用乙腈甲醇混合液（9∶1，體積比）提取雞血漿中L-肉堿，經過色譜條件優化，確定流動相為乙腈-5 mmol/L 庚烷磺酸鈉（0.1%磷酸）水溶液（15∶85，體積比），流速為0.6 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長210 nm，進樣量20 μL 的色譜條件，該方法精密度、回收率、穩定性高，適合于雞血漿中L-肉堿的檢測。