1-甲基環丙烯結合苯丙氨酸處理對桃花色苷合成的影響

趙 婧，邵小達，趙 晟，潘 泓，馬立杰，張映曈，凌 軍，李鵬霞,4，黃 雯，周宏勝,,4,*

（1.沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110866；2.昆山益群農產品有限公司，江蘇 蘇州 215300；3.江蘇省農業科學院，農業農村部農產品冷鏈物流技術重點實驗室，江蘇 南京 210014；4.江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，江蘇 南京 210014；5.南京市蔬菜科學研究所，江蘇 南京 210042）

桃（Prunuspersica（L.）Batsch.）是深受人們喜愛的核果類水果。外觀顏色是決定桃商品價值的重要指標，而花色苷決定著桃果實的外觀顏色，其生物合成受溫度、光照等環境因素調控，其中合理的光照有利于花色苷的合成[1]。研究表明套袋栽培可以改善桃的外觀品質，包括果面光潔度和顏色[2]，但也有研究認為套袋會抑制花色苷的生物合成，即套袋采收影響了桃果皮花色苷的合成和色澤的呈現[3-4]。因此，尋求一種有效的促進套袋采收桃果實花色苷合成的方法具有重要的意義。

花色苷由苯丙烷途徑和黃酮類化合物生物合成途徑產生[5]，受多個結構基因和調節基因的控制[6]。苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）是花色苷生物合成的直接前體[6-7]，研究表明在培養基中適當添加Phe能促進野生型擬南芥合成更多的花青素[8]；采后Phe處理的李果實具有較高的花色苷和酚類物質含量[9]。外源Phe處理可能是一種有效增加果實花色苷含量和提升果實抗病性的方法[7]。

乙烯是植物產生的最重要的激素之一，能夠直接影響果實的成熟衰老[10]。1-甲基環丙烯（1-methylclopropene，1-MCP）是植物組織中乙烯受體的競爭性抑制劑，1-MCP處理可有效抑制桃果實的呼吸和乙烯釋放，從而延緩果實的軟化，保持果實品質，在桃保鮮中應用廣泛[11-12]。研究表明，1-MCP處理可以抑制薔薇科的蘋果[13]、李[14]、油桃[15]果實著色，但會促進部分梨[16]和桃[3]果實著色。

本課題組前期的研究發現，1-MCP處理可以促進早熟套袋桃的著色[3]，但其對中晚熟套袋桃著色效果的影響尚不明確。目前尚鮮有關于1-MCP結合Phe處理對桃果實花色苷合成影響的相關報道。本研究擬通過Phe、1-MCP及Phe+1-MCP處理采收后的中晚熟套袋桃果實，研究不同處理對桃果實表型、果皮色差、花色苷含量等的影響，為Phe和1-MCP在桃采后保鮮和色澤提升中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

套“內黑外黃”雙層果袋栽培的‘新川中島’桃果實于商業化成熟時采收于山東某商業化果園，當天運至江蘇省農業科學院，挑選成熟度一致、大小形狀均一、無病蟲害和機械傷的桃果實進行實驗。

DL-Phe（99%） 北京百靈威科技有限公司；1-MCP 山東奧維特生物科技有限公司；氯化鉀、六水氯化鋁、鹽酸 國藥集團化學試劑有限公司；甲醇上海凌峰化學試劑有限公司；氫氧化鈉 西隴科學股份有限公司；無水乙酸鈉 廣州市金華大化學試劑有限公司；以上試劑均為分析純。FastPure Plant Total RNA Isolation Kit、HiScript III RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）逆轉錄試劑盒、GreenTaqMix和ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 南京諾唯贊生物科技股份有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純）美國JTBaker公司；矢車菊素3-葡萄糖苷標準品、矢車菊素-3-O-蕓香糖苷標準品 上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Seven multi pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HH-S數顯恒溫水浴鍋 常州萬達升實驗儀器有限公司；BSA124S電子天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；FM40型雪花制冰機 北京長流科學儀器有限公司；UV-1780型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；A11 Basic液氮研磨器 艾卡（廣州）儀器設備有限公司；CR-400全自動測色色差儀 日本Konica Minolta公司；7820A氣相色譜儀、QTRAP高效液相色譜-質譜（high-performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）儀 美國Agilent公司；3K-15離心機 德國SIGMA公司；EDC-810型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀北京東勝創新生物科技有限公司；CFX 96 實時熒光定量PCR（quantitative PCR，qPCR）儀 美國伯樂公司。

1.3 方法

1.3.1 桃果實的處理

將桃果實隨機平均分為4 組，分別進行4 種處理：1）對照組（Control）：清水浸泡10 min后晾干，用0.03 mm厚聚乙烯（polyethylene，PE）保鮮袋扎口密封空氣處理24 h；2）Phe處理組（Phe組）：8 mmol/L Phe溶液中浸泡10 min后晾干，用0.03 mm厚PE保鮮袋扎口密封空氣處理24 h；3）1-MCP處理組（1-MCP組）：清水浸泡10 min后晾干，用0.03 mm厚PE保鮮袋扎口密封1.0 μL/L 1-MCP處理24 h；4）Phe結合1-MCP處理組（Phe+1-MCP組）：8 mmol/L Phe溶液中浸泡10 min后晾干，用0.03 mm厚PE保鮮袋扎口密封1.0 μL/L 1-MCP處理24 h。密封處理結束后通風散氣15 min后分別將各組桃果實置于打孔的保鮮箱內貯藏。處理和貯藏均在常溫環境（（22±2）℃）下進行，每個處理組單個生物學重復處理桃果實50 個，每2 d取樣，每次隨機選取8 個果實用于拍照和測定相關品質指標，其中0 d的樣本為處理前的桃果實，每個處理均進行3 次生物學重復。

取樣時采用美工刀分離桃果皮與果肉，盡量保持桃果皮厚度一致（約1 mm），并迅速置于液氮中冷凍，每個生物學重復的樣本混勻后分別放入－80 ℃冰箱中保存，測定指標時用液氮研磨器粉碎混勻，以保證取樣具有代表性。

1.3.2 桃果實色澤的測定

參照Zhang Yingtong等[3]的方法，采用CR-400色差儀測定每個果實赤道線上十字交叉4 個點的色澤（亮度（L*值）、紅度（a*值）、黃度（b*值）），并計算顏色指數（color index of red grape，CIRG）與色差值（ΔE），每個處理組取24 個桃果實，結果取平均值。

1.3.3 總花色苷含量的測定

采用pH示差法[17]測定桃果皮中總花色苷含量。取研磨碎的0.5 g桃果皮樣品，加入2.5 mL 95%的酸化甲醇（0.1 mol/L HCl），4 ℃避光振蕩提取4 h后離心（12 000 r/min、4 ℃、15 min）提取上清液。上清液分別加入0.025 mol/L氯化鉀緩沖液（pH 1.0）和0.4 mol/L醋酸鈉緩沖液（pH 4.5）稀釋，室溫靜置15 min后測定溶液在520、700 nm波長處吸光度，按下式計算總花色苷含量。重復測定3 次，結果取平均值。

式中：ΔA＝（A520nm－A700nm）pH1.0－（A520nm－A700nm）pH4.5；Mw為矢車菊素-3 -O-葡萄糖苷的摩爾質量（449.2 g/mol）；DF為稀釋倍數；V為提取液總體積/mL；δ為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷摩爾消光系數（26 900 L/（mol·cm））；m為樣品質量/g；L為比色皿寬度（1 cm）。

1.3.4 花色苷單體含量的測定

取研磨碎的果皮0.5 g，加0.5 mL 50%甲醇溶液（含0.1% HCl），樣品渦旋5 min，浸提20 min，超聲5 min，離心10 min，吸取上清液，殘渣內加入0.5 mL 50%酸化甲醇溶液，再將上述操作重復一次，合并兩次上清液，過0.22 μm有機濾膜，采用HPLC-MS技術測定花色苷單體物質并用相應的標準品外標法定量，花色苷單體含量單位為mg/kg[3]。

1.3.5 桃果皮花色苷與乙烯合成代謝相關基因表達水平的測定

采用FastPure Plant Total RNA Isolation Kit從桃果皮組織中提取總RNA。采用瓊脂糖凝膠電泳法和Nanodrop 2000超微量分光光度計測定RNA的質量和濃度。采用HiScript III RT SuperMix for qPCR反轉錄試劑盒進行反轉錄，反轉錄后的cDNA存放于－20 ℃待用。

qPCR檢測操作按照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix說明書進行，引物序列設計如表1所示，以TEF2作為內參基因[18-20]。采用2-ΔΔCt法分析qPCR結果。

表1 qPCR引物序列Table 1 Primer sequences used for qPCR

1.3.6 呼吸速率和乙烯生成速率的測定

參考曹建康[21]和闞娟[22]等的方法測定桃果實呼吸速率和乙烯生成速率。將待檢測樣本常溫（（22±2）℃）放置在密封罐中密閉2 h，抽取10 mL氣樣，采用氣相色譜儀進行測定。

1.4 數據處理與分析

本實驗中數據取3 個重復的平均值。使用Excel 2010軟件進行數據統計，SPSS 24.0軟件進行差異顯著性分析（Duncan法多重比較，以P＜0.05表示差異顯著），Origin 2021軟件制作圖表。

2 結果與分析

2.1 Phe和1-MCP處理對桃果實外觀色澤的影響

果皮色澤是評價桃果實外觀品質的重要指標。由圖1可知，隨著貯藏期的延長，桃果實果面逐漸變紅；貯藏第2天時果面開始逐漸著色，貯藏第6、8天時果面顏色最紅。采后不同處理對果皮著色程度有不同的影響：與Control組相比，Phe、1-MCP和Phe+1-MCP處理均可促進果實著色，其中Phe+1-MCP組著色效果最佳，果面最為鮮紅。貯藏第6天時，處理組果實均已明顯著色，果面的著色程度排序依次為Phe+1-MCP組＞1-MCP組＞Phe組＞Control組。

圖1 Phe和1-MCP處理對桃果實外觀色澤的影響Fig.1 Effects of Phe and/or 1-MCP treatments on the appearance of peach fruits

2.2 Phe和1-MCP處理對桃果皮色澤的影響

色差是反映桃果皮著色情況最直觀的指標，其中，a*值可反映果皮顏色紅綠度的變化，CIRG可反映與花色苷含量有關的果實色澤變化，ΔE能夠反映顏色的總體變化[1,3]。由圖2可知，貯藏過程中果皮a*值、CIRG和ΔE總體均呈上升的趨勢。整個貯藏期間，各處理組果皮的a*值均顯著高于對照組（P＜0.05），且Phe+1-MCP處理組果實的a*值始終最高（圖2A）。貯藏期果皮CIRG的變化趨勢與a*值一致（圖2B），整個貯藏期果面的CIRG由大到小依次為Phe+1-MCP組＞1-MCP組＞Phe組＞Control組。貯藏第8天時，Phe+1-MCP處理組的a*值分別是Control、Phe組和1-MCP組的13.63、1.68 倍和1.33 倍，CIRG分別為Control、Phe組和1-MCP組的1.61、1.16 倍和1.10 倍，說明Phe+1-MCP處理可以有效地促進果皮紅色的形成，增色效果優于Phe和1-MCP單獨處理。在整個貯藏期間，各處理組果皮的ΔE均顯著高于對照組（P＜0.05），且Phe+1-MCP處理組果實的ΔE始終最高，說明Phe+1-MCP處理組果實的色澤變化最明顯。

圖2 Phe和1-MCP處理對桃果皮a*值（A）、CIRG（B）和ΔE（C）的影響Fig.2 Effects of Phe and/or 1-MCP treatments on a* value (A),CIRG (B) and ΔE (C) of peach peel

2.3 Phe和1-MCP處理對桃果皮總花色苷含量的影響

如圖3所示，在整個貯藏期間，桃果皮總花色苷含量呈逐漸上升的趨勢；貯藏第4天時總花色苷含量開始明顯增加。整個貯藏期間，各處理組果皮的總花色苷含量均顯著高于對照組（P＜0.05），總花色苷含量由大到小依次為Phe+1-MCP組＞1-MCP組＞Phe組＞Control組。Phe和1-MCP處理均可顯著促進桃果皮總花色苷含量的增加，且Phe+1-MCP處理的促進效果最好，明顯優于Phe和1-MCP單獨處理。貯藏第4天時，Phe+1-MCP處理組的總花色苷含量已明顯高于其他組，分別是1-MCP、Phe組和Control組的1.24、3.71 倍和6.83 倍；貯藏第6天時，Phe+1-MCP處理組果皮的總花色苷含量為76.71 mg/kg，分別是1-MCP、Phe和Control組的1.33、3.36 倍和7.29 倍。

圖3 Phe和1-MCP處理對桃果皮總花色苷含量的影響Fig.3 Effects of Phe and/or 1-MCP treatments on the content of total anthocyanins in peach peel

2.4 Phe和1-MCP處理對桃果皮主要花色苷類物質含量的影響

矢車菊色素是桃果實最主要的花色苷類物質[23-24]。本研究檢測了第6天時桃果皮中主要的矢車菊色素類物質含量（表2），發現矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和矢車菊素-3-O-蕓香糖苷是果皮主要的呈色物質，其中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量最高。貯藏第0天時，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和矢車菊素-3-O-蕓香糖苷含量均較低；貯藏第6天時，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和矢車菊素-3-O-蕓香糖苷含量明顯上升。貯藏第6天時，Phe+1-MCP處理組的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量分別是1-MCP、Phe組和Control組的1.35、3.39 倍和7.49 倍，矢車菊素-3-O-蕓香糖苷含量分別是1-MCP、Phe組和Control組的1.16、2.81 倍和6.87 倍。

表2 Phe和1-MCP處理對桃果皮花色苷單體含量的影響Table 2 Effects of phenylalanine and/or 1-MCP treatments on the content of anthocyanin monomers in peach peel

2.5 Phe和1-MCP處理對花色苷合成相關基因表達的影響

Phe和1-MCP處理后，桃果皮中大多數花色苷合成相關基因的表達量發生改變（圖4）。貯藏第2天時，與Control組相比，Phe、1-MCP和Phe+1-MCP處理均顯著促進了花色苷合成結構基因（PAL、DFR、ANS和UFGT）和調節基因（bHLH-3和WD40-1）的表達，Phe+1-MCP處理組的基因表達量最高，且顯著高于其他處理組（P＜0.05）。貯藏第4天時，Phe+1-MCP處理顯著提升了所有花色苷合成相關基因的表達，PAL、CHS、CHI、F3H、DFR、ANS、UFGT、MYB10.1、bHLH-3和WD40-1基因的表達量分別為Control組的3.61、2.19、2.23、3.81、3.41、4.00、2.22、1.89、2.38 倍和1.51 倍。貯藏第8天時，大多數花色苷合成相關基因的表達量與貯藏前期相比明顯降低，但Phe+1-MCP處理組的CHS、F3H、DFR、UFGT、MYB10.1、bHLH-3和WD40-1基因表達量仍顯著高于Control組（P＜0.05）。

圖4 Phe和1-MCP處理對桃果皮花色苷合成相關基因表達的影響Fig.4 Effects of Phe and/or 1-MCP treatments on gene expression associated with the synthesis of anthocyanins in peach peel

2.6 Phe和1-MCP處理對桃果實采后生理的影響

由圖5A可知，各組桃果實的呼吸速率在整個貯藏期間均呈現先上升后下降的變化趨勢，桃果實的呼吸速率在貯藏第6天時達到峰值。Control組桃的呼吸速率一直維持在相對較高的水平，1-MCP和Phe+1-MCP處理可以有效抑制果實的呼吸速率上升（P＜0.05），且其整個貯藏期均顯著低于Control組。由圖5B可知，采后桃果實乙烯生成速率隨貯藏時間的延長呈逐漸上升的趨勢。與Control組相比，1-MCP和Phe+1-MCP處理均可明顯抑制乙烯生成速率的上升，且其整個貯藏期均顯著低于Control組，Phe處理組乙烯生成速率在第4、6天時顯著低于Control組。

圖5 Phe和1-MCP處理對桃果實呼吸速率（A）、乙烯生成速率（B）的影響Fig.5 Effects of Phe and/or 1-MCP treatments on the respiration intensity (A) and ethylene production rate (B) of peach fruits

2.7 Phe和1-MCP處理對桃果實乙烯合成和信號轉導相關基因表達的影響

為探究Phe和1-MCP處理的桃果實采后乙烯生物合成減少的原因，對乙烯生物合成和信號轉導相關基因的表達量進行分析。乙烯代謝相關基因表達量在貯藏過程中大多呈現先升高后降低的趨勢（圖6）。與Control組相比，Phe和1-MCP處理明顯降低了貯藏前期（第2、4天）多個乙烯代謝相關基因的表達量，其中Phe+1-MCP處理組多個乙烯代謝相關基因的表達量顯著低于其他各處理組（圖6）。貯藏第2、4天時，Phe+1-MCP處理組中乙烯合成（SAMS、ACS和ACO）和乙烯下游信號元件（CTR1、EIN4、EIN2和EIL）相關基因表達量均顯著低于Control組。貯藏第8天時，Phe+1-MCP處理組中ACS、CTR1、EIN2和EIL基因的表達量顯著低于Control組。

圖6 Phe和1-MCP處理對桃果皮乙烯代謝相關基因表達的影響Fig.6 Effects of Phe and/or 1-MCP treatments on gene expression associated with ethylene metabolism in peach peel

3 討論

花色苷是桃果皮主要的呈色物質，本課題組前期研究發現雙層紙袋套袋會降低桃果實采收時的花色苷含量，導致果實外觀偏白[3-4]；且花色苷的生物合成不僅與光和溫度有關，也可能與乙烯、糖信號等密切相關[3,25]。傳統觀點認為乙烯會促進花色苷的生物合成，1-MCP處理會延緩果實的成熟和衰老，還會抑制果實的著色。例如李秀芳等[13]發現采后1-MCP處理會抑制蘋果花色苷含量的上升；徐燕紅[14]發現1-MCP處理會延緩‘桃形李’果實花色苷含量的增加；Zhang Wanli等[15]發現1-MCP處理會抑制油桃果肉花色苷的積累。但本研究以套袋采收的中晚熟桃品種為實驗材料，發現采后1-MCP處理可以有效地促進桃果實的著色，1-MCP處理后桃果皮的色澤a*值、CIRG和ΔE顯著提高，花色苷含量也顯著高于對照組（P＜0.05）。這與本課題組前期的研究結果一致：乙烯處理會抑制套袋早熟桃‘春美’的著色，1-MCP處理可以緩解其抑制效應[3]。本研究結果說明1-MCP處理可能在套袋采收的早熟和中晚熟桃品種中發揮著相似的作用，即促進桃果實的采后著色。近年來，乙烯對果實花色苷生物合成的負面影響也在一些物種中有所報道，如Ni Junbei等[16]發現乙烯對紅梨花色苷的生物合成具有抑制作用，本研究結果與其一致，可為乙烯對不同果實花色苷積累有負面影響這一結論進行補充。1-MCP處理對蘋果[13]、李[14]、桃[3]、梨[16,26]等水果花色苷含量有不同的影響，這說明1-MCP處理對不同果實中花色苷的形成可能存在不同的作用機制。

Phe是花色苷生物合成的前體物質[6,26]，在花色苷生物合成通路中發揮重要的作用。Aghdam等[27]發現Phe處理能夠促進番茄果實酚類、黃酮類化合物與番茄紅素的積累；Sogvar等[9]的研究證明外源Phe處理促進李果實花色苷及黃酮類化合物含量增加。本研究發現Phe處理可以有效促進桃果實的著色（圖1）和花色苷的積累（圖3），與前人研究結果一致。雖然1-MCP和Phe單獨處理均可促進套袋桃果實花色苷的合成，但本研究發現Phe結合1-MCP處理可以更有效地促進桃果皮色澤的形成，使其花色苷含量明顯高于Phe和1-MCP單獨處理組。在植物培養過程中，適當添加Phe能促進野生型擬南芥合成更多的花青素，說明Phe含量對花青素合成起重要作用[8]。這可能是因為Phe結合1-MCP處理增加了桃果實中花色苷合成前體物質的含量，因此其花色苷合成能力明顯高于1-MCP處理組。本研究還發現Phe和1-MCP處理均可有效促進花色苷合成相關基因（PAL、CHS、CHI、F3H、DFR、ANS、UFGT、MYB10.1、bHLH-3和WD40-1）的表達，且Phe+1-MCP組基因表達量顯著高于Phe和1-MCP單獨處理組，這可能是Phe+1-MCP處理能夠更有效地促進桃果皮花色苷含量升高的直接原因。桃屬于呼吸躍變型果實，在采后貯藏期間呼吸強度和乙烯釋放量會迅速提高[17]。本研究中1-MCP處理可以有效抑制桃果實的呼吸強度和乙烯釋放速率，且顯著抑制貯藏前期桃果實乙烯合成和信號轉導相關基因的表達，與周慧娟等[28]的研究結果一致。本研究還發現Phe+1-MCP處理可以有效降低桃果實乙烯釋放速率和乙烯合成和信號轉導相關基因的表達，這也可能是其能更有效地促進桃果實花色苷含量升高的原因。本課題組前期研究發現抑制乙烯后桃果實花色苷合成量明顯增加[3]。Phe+1-MCP處理對花色苷合成的協同效應還需要進一步驗證和闡明其機制。

Phe、1-MCP和Phe+1-MCP復合處理均能不同程度地改善套袋桃采后著色困難的問題，有效提升桃總花色苷含量及花色苷單體含量，Phe結合1-MCP處理對花色苷的合成具有協同效應。Phe+1-MCP處理可有效提升桃果皮花色苷合成相關基因的表達量，且降低部分乙烯合成和信號轉導相關基因的表達量，本研究可為1-MCP結合Phe在桃采后色澤調控中的應用提供理論依據和技術參考。