層生鐮刀菌產(chǎn)生的有機揮發(fā)物對黃粉蟲取食行為的影響

郭志青，許曼琳，張霞，李瑩，遲玉成，曹建敏

(1.山東省花生研究所，山東 青島 266100 ；2.中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所，山東 青島 266101)

糧食安全直接關系到國家安全和社會穩(wěn)定，儲糧害蟲是直接影響糧食產(chǎn)量和品質的重要因素之一。 儲糧害蟲種類多、適應性強、分布廣、繁殖力高，可使儲藏主糧、中藥材、食品、干果等遭受巨大損失。 近年來，隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，尋找綠色儲糧害蟲防治方法來替代化學保護劑和熏蒸劑的研究越來越受到人們的重視。

真菌揮發(fā)性物質(volatile organic compounds，VOCs)是指真菌產(chǎn)生的各種含碳氣態(tài)化合物的混合物，具有分子量小、易揮發(fā)、能在空氣和土壤中自由擴散等特性[1]。 真菌VOCs 可介導微生物和昆蟲之間的生態(tài)相互作用[2-5]，如銹菌可以侵染蕓苔科植物，通過改變寄主葉片形態(tài)產(chǎn)生真菌假花(fungal “pseudoflowers”)，真菌假花通過分泌花蜜釋放花香來吸引傳粉昆蟲，幫助真菌完成有性繁殖；樹蜂(Sirex noctilioF.)可非常敏感地躲避伴生菌(Leptographium wingfieldii)定殖的寄主植物，這表明具有相似生活史的昆蟲可能通過VOCs分割宿主資源以減少競爭相互作用；白僵菌(Beauveria bassiana)侵染葉片釋放的VOCs 對捕食者花蝽(Anthocoris nemorumL.)有驅避作用。真菌VOCs 也可用于食品生產(chǎn):通過檢測VOCs 建立模型可推測田間作物真菌侵染程度[6-8]或儲存糧食和食品中的真菌腐敗程度[9-11]。 因其在植物病害防治中具有獨特應用價值，利用不同VOCs控制植物病蟲害已成為當前國內外研究的熱點。多種真菌VOCS的殺蟲活性已被證實，例如，Muscodorspp.產(chǎn)生的揮發(fā)性有機物，包括亞硝基酰胺(nitrosoamide)，已被證明可以殺死昆蟲[12]，Muscodor vitigenus產(chǎn)生的萘用于制造“樟腦丸”，是一種非常有效的驅蟲劑[13]。

β-石竹烯(β-caryophyllene)是一種常見的萜類化合物。 β-石竹烯的藥理作用主要有局部麻醉作用、治療結腸炎、鎮(zhèn)咳等[14]。 β-石竹烯在昆蟲化學通訊中的意義已經(jīng)被報道，但對于不同昆蟲行為的影響不同。 比如:β-石竹烯是越冬期異色瓢蟲(Harmonia axyridis)成蟲的聚集素，對雌蟲和雄蟲都有很強引誘作用；對桃蚜(Myzus persica)和棉蚜(Aphis gossypii)有驅避作用[15，16]；對蛇麻疣額蚜(Phorodon humuli)有引誘作用[17]。 β-石竹烯目前主要從青篙、松節(jié)油中獲得，而真菌產(chǎn)生β-石竹烯以及β-石竹烯對于黃粉蟲取食行為的影響未見報道。 本研究旨在探索β-石竹烯對黃粉蟲(儲糧害蟲)取食行為的影響。

黃粉蟲(Tenebrio molitor)又稱面包蟲，屬鞘翅目擬步甲殼粉甲屬，是一種造成損失較為嚴重的世界性儲糧害蟲。 Morales-Ramos 等[18]的試驗表明，黃粉蟲具有從多種不同組分的食物中選擇最有利于自身膳食平衡的食物的能力，由此推斷黃粉蟲具有能夠躲避取食對本身健康造成威脅食物的能力。

前期試驗發(fā)現(xiàn)，盡管取食真菌侵染的小麥后因為真菌毒素的污染會導致黃粉蟲幼蟲死亡，但黃粉蟲幼蟲對層生鐮刀菌侵染的小麥顆粒取食具有趨向性。 我們推斷這種取食趨向可能與層生鐮刀菌的揮發(fā)物有關，此種揮發(fā)物對黃粉蟲幼蟲有吸引作用，然而具體是哪種揮發(fā)物起作用并不清楚。 本研究用層生鐮刀菌21.1 侵染大米、小麥和玉米3 種基質，觀察黃粉蟲幼蟲對3 種被侵染基質的取食反應，并運用頂空-固相微萃取(SPME)技術收集，氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(GC-MS)鑒定、分析層生鐮刀菌21.1 在不同基質上的揮發(fā)物組分，最終明確吸引黃粉蟲幼蟲的有機揮發(fā)物成分，為控制倉儲害蟲、提高農(nóng)產(chǎn)品品質提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

層生鐮刀菌菌株21.1(Fusarium proliferatum)由山東省花生研究所分離并保存。

大米品種為稻花香，小麥品種為濟麥22，玉米品種為登海605。

黃粉蟲幼蟲購于山東德州黃粉蟲生態(tài)養(yǎng)殖場，于溫度(26±1)℃、相對濕度70% ～80%的BSC-400 恒溫恒濕培養(yǎng)箱內養(yǎng)殖，挑選發(fā)育良好、身體健壯的幼蟲用做試驗。

1.2 層生鐮刀菌21.1 侵染不同基質

用滅菌水浸泡大米(小麥、玉米)18 h，瀝水，稱取20 g(玉米稱取30 g)分裝到滅菌的100 mL錐形瓶中，加入4 mL 滅菌水(補給高溫滅菌過程中蒸發(fā)掉的水分) 后121℃高溫滅菌15 min，冷卻到室溫。 將6 mL 層生鐮刀菌孢子懸浮液(106～107個/mL)菌液接種到滅菌大米(小麥、玉米)上，混合均勻后用封口膜將錐形瓶封上；對照組用滅菌水代替孢子懸浮液。 每個處理重復3 次。 侵染后的大米、小麥和玉米28℃恒溫培養(yǎng)7 d。

1.3 層生鐮刀菌侵染的基質對黃粉蟲幼蟲取食影響

用記號筆將直徑為14 cm 的滅菌培養(yǎng)皿平均分為4 個部分，稱取層生鐮刀菌完全侵染和滅菌沒有侵染(對照)的大米各3 g，依次放在培養(yǎng)皿4個區(qū)域的邊緣位置并確保從培養(yǎng)皿中心到基質的距離相等，在培養(yǎng)皿中心放入10 只黃粉蟲幼蟲(黃粉蟲幼蟲在試驗前24 h 停止喂食)。 將培養(yǎng)皿放在黑暗中10 ～15 min，每次10 個重復，共進行3 次試驗。 黃粉蟲幼蟲對層生鐮刀菌侵染的小麥、玉米的取食趨向試驗同上。 統(tǒng)計3 種基質黃粉蟲幼蟲在培養(yǎng)皿4 個不同區(qū)域的數(shù)量并進行數(shù)據(jù)分析。

黃粉蟲幼蟲取食偏好(%)＝目標基質所在區(qū)域黃粉蟲數(shù)量之和/10×100 。

1.4 層生鐮刀菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物鑒定

1.4.1 儀器與試劑 美國安捷倫7890B-5975C氣相色譜質譜儀；手動萃取手柄，50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭；250 mL 透明錐形瓶；正構烷烴(C10-C20)，購自北京百靈威科技有限公司。

GC-MS 所用條件:DB-5MS 彈性毛細管色譜柱，規(guī)格為30 m × 0.25 mm × 0.25 μm；襯管為0.75 mm SPME 專用襯管，分流比為100 ∶1；進樣口溫度250℃；載氣為99.999%的氦氣，流速為1.0 mL/min；柱溫箱:初始溫度50℃，保持2 min，以15℃/min 速率升至125℃，以3℃/min 速率升至170℃，最后以10℃/min 速率升至280℃，保持5 min；EI 離子源，全掃描模式，掃描范圍33 ～350 amu。

1.4.2 層生鐮刀菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物收集 將1.2中獲得的層生鐮刀菌侵染的不同基質和空白對照室溫下靜置0.5 h 后進行采樣。 用鐵架臺固定萃取探針和頂空瓶，將SPME 針管刺入錐形瓶中，推動手柄桿使纖維頭伸出針管。 萃取頭置于錐形瓶的上部空間，采樣時間為0.5 h。 收集完畢后將萃取頭收起，并將針管拔出樣品瓶，待GC-MS 分析。

實施過程中先采集空白對照，目的是為了排除培養(yǎng)基釋放的揮發(fā)物和萃取頭涂層流失對細菌揮發(fā)物鑒定結果的干擾。

1.4.3 吸附正構烷烴(C10-C20)探針制作 量取一定量正構烷烴(C10-C20)溶液于錐形瓶中，在室溫中靜置0.5 h 后，進行采樣。 采樣時用鐵架臺固定萃取探針，將SPME 針管刺入錐形瓶，推動手柄桿使纖維頭伸出針管。 萃取頭置于樣品的上部空間，采樣時間為0.5 h。 收集完畢后將萃取頭收起，并將針管拔出樣品瓶，待GC-MS 分析。

1.4.4 層生鐮刀菌揮發(fā)性代謝物定量分析 以揮發(fā)性代謝物總離子流色譜圖峰面積的相對比例表示產(chǎn)生代謝物的相對量。 以大米、小麥和玉米3 種基質中β-石竹烯總離子流色譜峰面積為100%，計算相同基質中層生鐮刀菌其他代謝組分相對于β-石竹烯的含量。 以大米中產(chǎn)生的每種揮發(fā)性代謝物總離子流色譜峰面積為100%，計算小麥和玉米中揮發(fā)性代謝物相對大米中該組分的相對含量。

1.5 β-石竹烯對黃粉蟲幼蟲吸引的驗證試驗

為驗證層生鐮刀菌產(chǎn)生的β-石竹烯是吸引黃粉蟲幼蟲的主要成分，將β-石竹烯標準品配制成1 000 mg/L的標準品溶液，并分別添加1 mL 到盛有滅菌的大米、小麥及玉米基質的錐形瓶中。 3種基質的重量及錐形瓶的規(guī)格同1.2，密封平衡3 h 后，將空白對照基質和加入β-石竹烯處理的基質分別放在直徑為14 cm 的培養(yǎng)皿中。 培養(yǎng)皿的劃分及基質的放置同1.3，在培養(yǎng)皿的中間放入10 只黃粉蟲幼蟲，每次10 個重復。 將培養(yǎng)皿放在黑暗中10 ～15 min，統(tǒng)計黃粉蟲幼蟲在4 個劃分區(qū)域的數(shù)量。 試驗重復3 次。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用Microsoft Excel 2019 進行數(shù)據(jù)整理，圖表數(shù)據(jù)均以平均值±標準誤表示。

2 結果與分析

2.1 層生鐮刀菌侵染的基質對黃粉蟲幼蟲取食影響

結果(圖1)表明:黃粉蟲幼蟲偏愛取食層生鐮刀菌侵染過的基質。 層生鐮刀菌侵染的基質對黃粉蟲幼蟲有不同程度的吸引，相較于對照，侵染大米能夠吸引75%的黃粉蟲幼蟲；侵染小麥能吸引73%的黃粉蟲幼蟲；侵染玉米吸引59%的黃粉蟲幼蟲。 層生鐮刀菌侵染的玉米吸引黃粉蟲的效果相對較差。

圖1 黃粉蟲幼蟲對層生鐮刀菌侵染大米、小麥、玉米取食偏好

2.2 層生鐮刀菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物分析

2.2.1 揮發(fā)物GC-MS 分析 將1.4.2 獲得的吸附揮發(fā)物的萃取頭在全掃描模式下進行分析，得到不同培養(yǎng)基質中空白對照樣品揮發(fā)物、層生鐮刀菌揮發(fā)性代謝物和正構烷烴(C10-C20)的總離子流圖，其中大米、小麥和玉米3 種培養(yǎng)基質中層生鐮刀菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物GC-MS 總離子流圖分別見圖2、圖3、圖4。

圖3 層生鐮刀菌侵染小麥基質后產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝物總離子流圖

圖4 層生鐮刀菌侵染玉米基質后產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝物總離子流圖

2.2.2 目標揮發(fā)物譜庫檢索 將層生鐮刀菌揮發(fā)物總離子流圖與空白樣品揮發(fā)物總離子流圖中共有色譜峰扣除，即為層生鐮刀菌在不同培養(yǎng)基質下釋放的揮發(fā)性特征指紋峰，使用NIST 和WILIY 譜庫對特征指紋峰進行定性識別，設置匹配度閾值為80，結果見表1。 層生鐮刀菌的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物主要有4 種，其中β-石竹烯產(chǎn)量最高，其他3 種組分在NIST 和WILIY 庫中匹配率雖然大于80%，但計算得到正構烷烴保留指數(shù)與文獻報道相差較大，所以不能確定揮發(fā)物結構式，暫定為未知1、未知2、未知3。

表1 層生鐮刀菌揮發(fā)性代謝物定性鑒定結果

2.2.3 層生鐮刀菌揮發(fā)性代謝物定量分析 以大米、小麥和玉米三種基質中β-石竹烯總離子流色譜峰面積為100%，計算相同基質中層生鐮刀菌其他代謝組分相對于β-石竹烯的含量。 由表2 可知，大米中未知1、2、3 組分含量均低于β-石竹烯含量的2%，小麥和玉米基質中未知組分1 所占比例高于大米，占β-石竹烯含量的30%以上，另外兩種均不到β-石竹烯含量的2%。

表2 相同基質中層生鐮刀菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物相對含量(以β-石竹烯為參照) (%)

以大米中產(chǎn)生的每種揮發(fā)性代謝物總離子流色譜峰面積為100%，計算小麥和玉米中揮發(fā)性代謝物相對大米中該組分的相對含量，結果見表3。 大米基質中層生鐮刀菌產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝物總量最高，其次為小麥，玉米最少。

表3 不同基質中鐮刀菌侵染揮發(fā)性代謝產(chǎn)物相對含量(以大米為參照) (%)

2.3 β-石竹烯對黃粉蟲幼蟲吸引的驗證試驗

由圖5 可知，黃粉蟲幼蟲偏愛取食β-石竹烯處理過的基質。 β-石竹烯處理過的基質對黃粉蟲幼蟲有不同程度的吸引，相較于對照，β-石竹烯處理的大米能夠吸引79%的黃粉蟲幼蟲來取食；β-石竹烯處理的小麥能夠吸引77%的黃粉蟲幼蟲；β-石竹烯處理的玉米吸引69%的黃粉蟲幼蟲。 β-石竹烯處理的基質吸引黃粉蟲幼蟲明顯高于層生鐮刀菌侵染的，這可能與層生鐮刀菌侵染的基質有其他有機揮發(fā)物的干擾有關。

圖5 黃粉蟲幼蟲對β-石竹烯處理大米、小麥、玉米的取食偏好

3 討論與結論

本試驗研究了層生鐮刀菌有機揮發(fā)物對黃粉蟲取食的影響。 在前期試驗的基礎上[19]，本試驗增加了大米、玉米兩種基質，結果發(fā)現(xiàn)層生鐮刀菌侵染后的大米、小麥、玉米對黃粉蟲幼蟲有不同程度的吸引作用。 因此，我們推斷層生鐮刀菌產(chǎn)生的VOCs 對黃粉蟲的取食有吸引作用。 運用GSMS 技術對層生鐮刀菌揮發(fā)性代謝物進行定性、定量分析，初步判斷層生鐮刀菌吸引黃粉蟲幼蟲的主要有機揮發(fā)物成分為β-石竹烯。

層生鐮刀菌產(chǎn)生的VOCs 不止本試驗檢測到的4 種，本研究只關注峰面積最高的物質，并在NIST 和WILIY 庫中匹配判定為β-石竹烯。 此外，不同菌株的VOCs 種類不同，利用實時直接分析質譜(DART-MS)繪制的VOCs 圖譜指紋顯示產(chǎn)毒鐮刀菌真菌的物種具有特異性[20]。

β-石竹烯除了藥理方面作用，在環(huán)境保護、清潔空氣等方面也有比較廣的用途。 在工作和生活的各種環(huán)境中均存在臭氧，低濃度的臭氧對人體無害，但濃度過高會對身體產(chǎn)生傷害。 目前使用的空氣清潔劑多為萜類化合物，由于β-石竹烯的二萜結構上含有兩個雙鍵，很容易和臭氧反應，可以很好地除去空氣中的臭氧，起到凈化空氣的作用[21]。

本研究中層生鐮刀菌的揮發(fā)物β-石竹烯對儲糧害蟲黃粉蟲幼蟲有吸引作用，對于誘殺儲糧害蟲有很好的應用前景。 并且，我國國家標準化管理委員會規(guī)定β-石竹烯可以用作食品用天然香料(GB 2760—2007)。 因此，β-石竹烯對人畜無害，可以作為引誘劑用于儲糧害蟲的防治，有效控制和降低糧食產(chǎn)品中儲糧害蟲的危害，對于提高農(nóng)產(chǎn)品品質有重要意義。