溴氰蟲酰胺對小菜蛾幼蟲腸道真菌群落的影響

陳華璋，鄭蘋，田旭，汪漢成，向立剛，李文紅

(1.貴州省農業科學院旱糧研究所，貴州 貴陽 550006；2.貴州省煙草科學研究院，貴州 貴陽 550081；3.長江大學農學院，湖北 荊州 434000；4.貴州省農業科學院植物保護研究所，貴州 貴陽 550006)

昆蟲體內微生物與其生命活動密切相關，影響昆蟲的交配[1]、對寄主植物的選擇[2]、昆蟲壽命[3]以及對病原菌的抵抗力[4]等。 小菜蛾[Plutella xylostella(L.)]是危害十字花科作物最為嚴重的害蟲之一，常導致甘藍、西蘭花、芥菜、油菜、蘿卜和花菜等多種重要蔬菜嚴重的經濟損失[5]。腸道是其重要的生命器官，棲息著大量的微生物，其中細菌的豐富度和多樣性較高。 目前，已報道的小菜蛾腸道細菌有蒙氏腸球菌(Enterococcus mundtii)、粘質沙雷菌(Serratia marcescens)、肉桿菌(Carnobacterium maltaromaticum)等[6-8]。 這些腸道細菌對食物的消化、宿主的生長發育與環境適應性均起著積極作用[6，8]。 相較而言，有關小菜蛾腸道真菌群落的研究較少。

當前，化學方法是防控小菜蛾最為經濟有效的手段。 溴氰蟲酰胺為雙酰胺類殺蟲劑，以昆蟲魚尼丁受體為靶標，導致昆蟲細胞無限制釋放鈣離子，使其肌肉麻痹、癱瘓、停止取食，最終死亡[9，10]。 該藥劑自2012 年上市以來便被廣泛應用于小菜蛾的防治，且效果良好[11]。 殺蟲劑在發揮其作用的同時也影響著昆蟲腸道微生物的組成和生理代謝活動[12，13]；同時部分腸道微生物也影響著宿主對包括農藥在內的有害物質的降解[14]、抗藥性的產生[15]以及抵御病原微生物的入侵[16]等。 前期研究發現溴氰蟲酰胺浸葉飼喂小菜蛾，其腸道厚壁菌門和腸球菌屬相對豐度均顯著降低，而藍細菌門和血桿菌屬相對豐度均顯著增加，同時小菜蛾腸道細菌群落多樣性、均勻度和豐富度整體呈增加趨勢，且多樣性和豐富度增幅顯著(待發表)。 但該藥劑是否對小菜蛾腸道真菌群落結構存在影響尚不清楚。 微生物純培養方法為傳統研究技術，能順利獲得后續研究的微生物菌株材料[17]，高通量測序技術雖不能獲得活的菌株材料，但能夠較為全面了解腸道微生物菌群組成與多樣性特征[18]。 將兩種技術相結合用于小菜蛾腸道真菌的研究可以更全面地了解小菜蛾腸道真菌菌群結構與多樣性特征，從而深入探尋溴氰蟲酰胺浸葉飼喂處理對其腸道真菌群落的影響規律。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試小菜蛾為溴氰蟲酰胺敏感品系，由貴州省農業科學研究院植物保護研究所昆蟲研究室長期室內飼養。 97%溴氰蟲酰胺(cyantraniliprole)原藥由美國杜邦公司生產。 PDA 培養基(HB0233-12，青島海博生物技術有限公司)，DNA 提取試劑盒(DP307，TIANGEN)。

1.2 試驗方法

1.2.1 基于傳統分離培養法的小菜蛾腸道真菌群落研究 前期研究發現溴氰蟲酰胺對小菜蛾的半致死濃度(LC50)為0.143 mg/L。 本研究用含0.1% Triton X-100(T8200，Solarbio)的無菌水配制1 mg/L 溴氰蟲酰胺藥液，浸泡新鮮甘藍葉片30 s后取出晾干至表面無水痕，放入小菜蛾飼養盒中，并接入生長一致的3 齡小菜蛾幼蟲，以相同體積的含0.1% Triton X-100 無菌水處理甘藍葉片飼喂的小菜蛾幼蟲作為對照。 12 h 后，從對照組和溴氰蟲酰胺處理組中分別隨機挑選健康且大小一致的小菜蛾幼蟲100 頭，饑餓4 h 后置于75%乙醇中體表消毒90 s，再用0.8%生理鹽水沖洗3 次，最后在超凈工作臺上解剖挑取腸道。 腸道組織放入2 mL 無菌離心管中4℃保存備用。

向離心管中加入1 mL PBS 緩沖液(P1022，Solarbio)后使用組織研磨器進行充分研磨，隨后用PBS 緩沖液將研磨液分別稀釋成10-1、10-2、10-3。 分別取50 μL 上述不同濃度稀釋液均勻涂布于含1%硫酸鏈霉素(S8290，Solarbio)和氨芐青霉素鈉(A8180，Solarbio)的PDA 培養基上，每個濃度3 次重復，置于28℃恒溫培養箱黑暗培養7 d。 期間每天觀察培養基上菌落的生長情況，一旦有新菌落出現，便從菌落邊緣挑取菌絲轉接至新的PDA 培養基上進行純化。 對純化后的菌株進行編號，并接種于PDA 斜面培養基上，4℃冰箱保存備用。

使用真菌基因組DNA 提取試劑盒提取純化菌株的DNA，基因組經稀釋后，以ITS1/ITS4 為引物擴增其轉錄間隔區ITS 區，PCR 反應條件及體系參考吳燕燕等[17]的方法。 擴增產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結果在GenBank 數據庫中進行BLASTn 比對分析。

1.2.2 基于高通量測序技術的小菜蛾腸道真菌群落研究 按1.2.1 方法處理小菜蛾，對照組和溴氰蟲酰胺處理組分別隨機挑選小菜蛾幼蟲200頭，收集腸道組織。 采用土壤基因組DNA 提取試劑盒(DP336，TIANGEN)提取小菜蛾幼蟲腸道微生物總DNA，每樣品取100 頭幼蟲腸道，每組重復2 次(對照組:SCK1、SCK2；溴氰蟲酰胺處理組:SJY1、SJY2)。 隨后采用超微量分光光度計檢測其質量與濃度。 以檢測合格的DNA 為模板，采用ITS1F 和ITS2 通用引物進行PCR 擴增，擴增體系與程序參考蘇日娜等[19]的方法。 擴增產物經純化后送至北京諾禾致源生物科技有限公司，采用PacBio Sequel 平臺進行三代擴增子測序。

首先通過QIIME2(2019.4)軟件qiime cutadapt trim-paired 程序切除序列的引物片段，棄去未匹配引物的序列；DADA2 進行質控、去噪、拼接、去嵌合體；采用classify-sklearn 算法[20]將過濾后的序列與UNITE 數據庫進行物種分類學注釋；使用qiime feature-table rarefy 功能，對樣品中的序列進行抽平，用于后續Alpha、Beta 多樣性分析等；運用R 語言和ggplot2 包計算樣品微生物群落香 農( Shannon)[21]、 辛 普 森( Simpson)[22]、Chao1[23]、測序深度指數(Observed species)、皮諾(Pielou)[24]和覆蓋度(Good’s coverage)[25]等Alpha 多樣性指數；通過R 語言、ape 包等基于Bray-Curtis距離[26]進行Beta 多樣性分析及主坐標分析(PCoA)；使用FunGuild 對真菌群落進行功能預測分析。

2 結果與分析

2.1 溴氰蟲酰胺對小菜蛾幼蟲腸道可培養真菌的影響

由表1 可知，溴氰蟲酰胺處理顯著增加了小菜蛾腸道可培養真菌種類，但明顯降低了真菌總數。 對照組共獲得57 株真菌，溴氰蟲酰胺處理組共獲得22 株真菌。 根據真菌的形態及分子鑒定，對照組的57 株真菌分別為青霉菌(Penicilliumsp.，42 株)和盾殼霉菌(Coniothyriumsp.，15 株)；溴氰蟲酰胺處理組的22 株真菌分別屬于曲霉菌(Aspergillussp.，4 株)、青霉菌(Penicilliumsp.，8株)、盾殼霉菌(Coniothyriumsp.，6 株)和黃瓜織球殼菌(Plectosphaerella cucumerina，4 株)。

表1 小菜蛾腸道可培養真菌分類及統計

2.2 溴氰蟲酰胺對小菜蛾腸道真菌群落的影響

2.2.1 數據質控及OTU 聚類 Illumina NovaSeq測序得到原始數據經過拼接和質控處理之后，溴氰蟲酰胺處理組2 個樣本共得到93 616 條高質量序列，25 595 467 個堿基，序列平均長度分別為266、280 bp，序列中GC 含量分別為50.48%、50.68%，測序錯誤率小于0.01(Q20)和0.001(Q30)的堿基數分別占總堿基數的92.32%、86.13%和91.73%、85.23%。 對照組中2 個樣本共得到131 208 條高質量序列，35 074 595 個堿基，序列平均長度分別為277、259 bp，序列中GC含量分別為51.79%、51.81%，測序錯誤率小于0.01(Q20)和0.001(Q30)的堿基數分別占總堿基數的93.55%、87.87%和95.17%、90.51%(表2)。

表2 樣本測序數據統計及質控

在97%的相似度水平下對樣品序列進行OTU 聚類，如表3 所示，溴氰蟲酰胺處理組中2 個樣本共鑒定得出真菌10 門，33 綱，80 目，159 科，271 屬，380 種；對照組中2 個樣本共鑒定得出真菌10 門，35 綱，82 目，163 科，279 屬，397 種。

表3 各樣本真菌群落不同分類水平下數目

2.2.2 ITS 序列測序深度分析 稀釋曲線(rarefaction curve)是描述組內樣本多樣性的重要工具，可以直接反映測序數據量的合理性，并間接反映樣本的物種豐富程度。 本試驗中兩組共4 個樣品在測序數據為33 000 時曲線趨于平緩(圖1)，說明此次測序數據深度已經足夠，能夠反映樣品中大多數的真菌多樣性信息，進一步測序對新OTU 的產生貢獻不大。 因此，本研究測序量能反映小菜蛾腸道真菌群落的組成情況。

圖1 OTU 水平稀釋曲線

2.2.3 小菜蛾腸道真菌群落組成 在門水平上溴氰蟲酰胺處理組和對照組的優勢菌門均為子囊菌門(Ascomycota)，其次是擔子菌門(Basidiomycota)；經溴氰蟲酰胺處理后的小菜蛾腸道上擔子菌門豐度顯著低于未處理組，其他真菌種類無顯著性差異(圖2)。 溴氰蟲酰胺處理組和對照組中相對豐度前10 的菌門分別是子囊菌門(80%/77%)、擔子菌門(4%/18%)、毛霉門(Mucoromycota，0.04%/0.27%)、被孢霉門(Mortierellomycota，0.25%/0.17%)、 羅 茲 菌 門(Rozellomycota，0.10%/0.06%)、油壺菌門(Olpidiomycota，0.05%/0.08%)、壺菌門(Chytridiomycota，0.05%/0.04%)、球囊菌門(Glomeromycota，0.03%/0.02%)、捕蟲霉門(Zoopagomycota，＜0.01%)和Aphelidiomycota(＜0.01%)。

圖2 小菜蛾腸道真菌門水平群落組成

在屬水平上，平臍蠕孢屬(Bipolaris)為絕對優勢菌，其次為鐮刀菌屬(Fusarium)和散尾鬼筆屬(Lysurus)。 溴氰蟲酰胺處理組和對照組相對豐度前10 的真菌屬中平臍蠕孢屬(66%/41%)、鐮刀菌屬(3.9%/18%)、散尾鬼筆屬(2.9%/16%)、枝孢屬(Cladosporium，0.6%/3.5%)、赤霉菌屬(Gibberella，0.5%/2.3%)、鏈格孢屬(Alternaria，0.8%/1.7%)、曲霉屬(Aspergillus，0.3%/0.9%)和Pseudopithomyces(0.1%/0.9%)為二者共有菌屬；Archaeorhizomyces和伊薩酵母屬(Issatchenkia)僅存在于溴氰蟲酰胺處理組中，相對豐度分別為2.9%和0.5%，帚枝霉屬(Sarocladium)和畢赤酵母屬(Pichia)僅存在于對照組中，相對豐度分別為1.1%和0.7%(圖3)。

圖3 小菜蛾腸道屬水平真菌群落組成

2.2.4 小菜蛾腸道真菌群落Alpha 多樣性 由表4 可知，溴氰蟲酰胺處理后小菜蛾腸道真菌群落的豐富度(Chao1、ACE 指數)、測序深度指數(Observed species)、系統發育多樣性指數(PD wholetree)均增加，除PD whole tree 指數外，與對照組無顯著性差異，Simpson 指數和Good’s coverage指數均有所下降。 對照組中小菜蛾腸道真菌群落Shannon、Simpson 指數分別為3.9±0.2、0.82±0.04，Chao1、ACE 指數分為980±88、993±46，Observed species 指數為830±13，PD whole tree 指數為473±14，Good’s coverage 指數為0.995±0.001；溴氰蟲酰胺處理組中小菜蛾腸道真菌群落Shannon、Simpson 指數分別為3.9±0.7、0.67±0.09，Chao1、ACE 指數分別為1 505±561、1 324±287，Observed species 指數為1 096±129，PD whole tree 指數為745±64，Good’s coverage 指數為0.993±0.003。

表4 真菌群落Alpha 多樣性指數

2.2.5 小菜蛾腸道真菌群落Beta 多樣性 PCoA主坐標分析表明，對照組2 個樣品與溴氰蟲酰胺處理組2 個樣品距離較遠，真菌群落組成差異較大；對照兩樣品間距離較小，真菌組成差異較小，而溴氰蟲酰胺處理組的SJY1 和SJY2 樣品之間距離較遠，表明其真菌群落組成差異較大(圖4)。

圖4 基于Weighted Unifrac 距離PCoA 分析

2.2.6 小菜蛾腸道真菌FunGuild 功能預測 真菌FunGuild 功能預測(圖5)表明:溴氰蟲酰胺處理組和對照組小菜蛾腸道真菌群落的主要功能包括植物病原菌(Plant Pathogen，67%/45%)、未指定的(Unassigned，17%/7%)、植物病原-土壤腐生微生物-木材腐生微生物(Plant Pathogen-Soil Saprotroph-Wood Saprotroph，4%/18%)、糞便腐生微生物-土壤腐生微生物(Dung Saprotroph-Soil Saprotroph，3%/16%)、未定義的腐生微生物(Undefined Saprotroph，3%/5%)、內生植物病原(Endophyte-Plant Pathogen，0.6%/3.6%)、動物病原-內生菌-植物病原-木材腐生菌(Animal Pathogen-Endophyte - Plant Pathogen - Wood Saprotroph，0.8%/1.7%)。

圖5 FunGuild 功能注釋相對豐度柱形圖

3 討論與結論

腸道中真菌群落相比細菌群落所占比例較小，但其對于腸道菌群穩態至關重要[27]。 本研究通過傳統分離培養技術從未經溴氰蟲酰胺處理的小菜蛾腸道中分離出了青霉屬和盾殼霉屬真菌，而從溴氰蟲酰胺處理的小菜蛾腸道中還分離出了曲霉屬真菌和黃瓜織球殼菌。 江宇航等[28]從云南松毛蟲腸道中也分離出了曲霉菌屬和青霉菌屬，但其分離到的根霉菌、鐮刀菌和念珠菌等本試驗未獲得，而高通量測序結果表明小菜蛾腸道中存在相關菌屬，可能由于分離培養基和培養條件的差異未能分離出純菌株。 青霉菌作為常見的產纖維素酶菌株[29]，可幫助宿主更好地消化植物組織。 研究表明青霉屬、曲霉屬和鐮刀菌屬均可作為昆蟲腸道共生真菌，為宿主的生長發育和繁殖提供營養物質[30]。 黃瓜織球殼菌可導致甘藍[31]、土豆[32]、番茄[33]等作物發生萎蔫。 此次在小菜蛾腸道中檢測到黃瓜織球殼菌可能是因為其作為病原菌附著在甘藍葉上，最后因取食進入腸道。

高通量測序結果表明，平臍蠕孢屬、鐮刀菌屬、散尾鬼筆屬、枝孢屬、赤霉菌屬、鏈格孢屬、曲霉屬和Pseudopithomyces為腸道中優勢真菌屬。其中平臍蠕孢屬可引起玉米[34]、水稻[35]和狗尾草[36]等禾本科植物的葉斑病，但尚未有其導致甘藍感病的報道；鐮刀菌屬作為一種常見菌屬，可以是有益菌、病原菌以及中性菌；散尾鬼筆屬是可形成大型子實體的真菌；枝孢屬、赤霉菌屬和鏈格孢屬中均包含大量植物病原菌。 食物是腸道微生物的重要來源，因此小菜蛾腸道中包含了大量植物病原菌菌屬，雖然多數并非甘藍病原菌，但由于降雨和風力等自然因素也會導致其它植物的病原菌散播到甘藍葉上，最終進入到小菜蛾腸道中。 功能預測結果表明小菜蛾腸道中真菌群落主要為植物病原菌，其次為土壤木材腐生微生物以及植物內生菌，這也印證了小菜蛾腸道中的真菌多來自食物和土壤等。

溴氰蟲酰胺處理后小菜蛾腸道平臍蠕孢屬的相對豐度顯著增加，鐮刀菌屬、散尾鬼筆屬相對豐度顯著降低。 物種群落方面，溴氰蟲酰胺處理后小菜蛾腸道真菌群落豐富度指數、系統發育多樣性指數等均有不同程度的上升。 PCoA 的結果也證明了這一點，經溴氰蟲酰胺處理后不同小菜蛾腸道真菌群落樣本距離較遠，物種組成差異較大。這可能是由于溴氰蟲酰胺作用使得小菜蛾的防御機能降低，環境中的大量微生物群落進入到了小菜蛾腸道中，相關假設將在后續試驗進一步驗證。

本研究檢測了溴氰蟲酰胺處理后小菜蛾腸道真菌群落結構的變化，結果顯示溴氰蟲酰胺處理后小菜蛾腸道真菌群落數量和多樣性均有不同程度的增加。 研究結果為小菜蛾腸道微生物功能的研究提供了借鑒，同時也為溴氰蟲酰胺與小菜蛾的互作研究提供了參考。