粉葛不同外植體的誘導與松散型愈傷組織增殖研究

袁名遠，羅凱，劉玉，吳麗雯，孫慧茹，趙苓云，李宇，何美軍

(1.湖北民族大學生物科學與技術學院，湖北 恩施 445000；2.湖北省農業科學院中藥材研究所/農業農村部中藥材生物學與栽培重點實驗室，湖北 恩施 445000)

粉葛[Pueraria montanavar.thomsonii(Bentham) M.R.Almeida]是豆科(Leguminosae)葛屬(Pueraria)多年生藤本蔓生植物，又名甘葛藤，是國家認定的藥食同源植物之一，主要分布于廣西、江西、湖北以及安徽等地，且多為人工栽培[1，2]。粉葛含有大量的淀粉以及豐富的葛根素、大豆苷、大豆苷元等異黃酮成分[3，4]，具有解酒、抗氧化、降血糖、抗炎、抗腫瘤、抗菌等多種功效，被譽為“南葛北參”“亞洲人參”[5-9]，鑒于粉葛特殊的藥用功效，高效、規模化生產粉葛活性成分具有巨大的市場前景。 目前，粉葛市場正逐漸擴大，對粉葛資源的需求也日漸迫切。

粉葛的傳統繁殖方式主要是葛頭繁殖、塊根繁殖、扦插繁殖和壓條繁殖[10，11]，這些繁殖方式雖然能提供一定量的粉葛資源，但受季節、氣候、病蟲害等自然條件影響，種苗成活率不高、繁殖系數低且繁殖周期較長[12]，限制了粉葛資源的發展。 植物組織培養技術是一種快速、高效的繁殖技術，它的發展為解決粉葛上述問題提供了理論基礎和技術支撐[13]。 愈傷組織誘導是植物組織培養的重要階段，是建立組織培養體系的前提，培養的愈傷組織不僅能用于異黃酮等次生代謝產物的生產，還可用于優良品種的快速繁殖、多倍體誘變育種以及遺傳轉化等研究[14，15]。

目前，關于粉葛愈傷組織培養的研究還不夠系統，對其次生代謝產物生產的研究很少[16，17]。本研究從粉葛的不同外植體入手，利用不同處理組合的外源激素對其進行誘導，篩選出誘導愈傷組織的最適外植體及松散型愈傷組織繼代增殖的條件，運用響應面法對增殖條件進行優化，并檢測愈傷組織中主要次生代謝產物的含量，以期為建立系統、高效的粉葛組織培養和次生代謝產物生產體系提供科學依據，以緩解粉葛資源的短缺問題。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑、儀器

試驗材料為半年生粉葛全株，采集于湖北省恩施市三岔鎮(109.64′E，30.28′N，平均海拔910 m)，由湖北省農業科學院中藥材研究所鑒定。

試劑:次氯酸鈉(NaClO)、無水乙醇、吐溫-80、無水碳酸鈉(Na2CO3)、福林酚、MS 培養基、蔗糖、瓊脂等均購于國藥集團；6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、葛根素、沒食子酸購于阿拉丁試劑公司；氯化汞(HgCl2)領取于湖北省農業科學院中藥材研究所。

儀器:UV-1800 紫外可見分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)；DL-CJ-2NDI 超凈工作臺(上海東聯哈爾儀器制造有限公司)；FA2004B 電子天平(上海佑科儀器儀表有限公司)；JZ-100-B接種器具殺菌器(上海稼豐園藝用品有限公司)等。

1.2 試驗方法

1.2.1 粉葛幼苗培育 剪去粉葛植株的地上部分，切下葛頭，栽入裝有混合基質的栽培盆中，用自來水澆透，瀝去多余水分后放入26℃組培室中培養(培養所需環境條件見表1)，2 ～3 d 澆水一次，并除去雜草，當形成株高10 ～20 cm 的粉葛苗后即可用于組織培養。

表1 愈傷組織培養條件

1.2.2 無菌外植體制備 從粉葛苗上采下粉葛葉片、葉柄(帶小葉柄)以及莖段(帶莖段節)并分類；先用自來水洗去表面的泥土和雜物，隨后置于含有適量吐溫-80 的無菌水中浸泡5 ～10 min；取出，在超凈工作臺上繼續用無菌水清洗3 次，隨后依次用75%乙醇浸泡30 s 左右、0.1%的升汞溶液處理5 ～15 min、2%的次氯酸鈉溶液處理5 ～15 min(每次更換消毒劑時均使用無菌水清洗3 ～5次)；使用無菌濾紙吸干表面水分，然后將葉片剪成0.5 ～1.0 cm2的小塊，葉柄和莖段切成0.5 ～1.0 cm長的小段，作為3 種無菌外植體。

1.2.3 粉葛不同外植體的誘導效果比較 基于前期試驗，設置不同濃度6-BA(0.1、1.0、2.0 mg·L-1)與NAA(0.1、0.5、0.9 mg·L-1)組合處理及不含激素的空白對照，共10 個處理(表2)，對3 種外植體分別進行誘導，每個組培瓶接種6 ～8 個外植體，每個處理接種3 瓶，重復接種3 批，25 d 后統計誘導結果。

表2 不同濃度6-BA 與NAA 組合下的外植體誘導方案 (mg·L-1)

1.2.4 莖段松散型愈傷組織的增殖條件篩選參考1.2.3 中由莖段誘導出較松散愈傷組織的條件，設置不同濃度6-BA(0.5、1.0、2.0 mg·L-1)與NAA(0.25、0.50、0.75 mg·L-1)組合處理及不含激素的空白對照，共10 個處理(表3)，對松散型愈傷組織的增殖條件進行篩選。 每個組培瓶接種3～5塊大小為(0.2±0.02)g 的愈傷組織，每個處理接種3 瓶，25 d 后統計增殖結果。

表3 不同濃度6-BA 與NAA 組合下的松散型愈傷組織增殖方案 (mg·L-1)

1.2.5 響應面法優化松散型愈傷組織的增殖條件 在1.2.4 篩選的增殖條件基礎上引入生長素2，4-D，結合響應面法對松散型愈傷組織的增殖條件進行改善。 利用Design-Expert 8.0.6 軟件，根據Box-Behnken 設計原理，以增殖率為響應值，按表4 方案設計三因素三水平試驗，25 d 后統計相關指標。

表4 響應面設計試驗因素與水平 (mg·L-1)

1.2.6 總黃酮與總酚含量測定 (1)愈傷組織甲醇提取液制備:將愈傷組織取出，去除表面培養基等雜質，放入60℃烘箱中干燥至恒重，粉碎過80目篩。 稱取1 g 粉末加入50 g·mL-1甲醇混勻，200 W 超聲萃取30 min，萃取3 次后合并濾液，于250 mL 容量瓶定容，得到樣品母液，密封后置于4℃保存備用。

(2)總酚含量測定:取上述母液1 mL 定容于10 mL 容量瓶作為檢測樣，參考郭剛軍等[18]的方法進行沒食子酸標準曲線繪制和樣品總酚含量檢測。

(3)總黃酮含量測定:取上述母液1 mL 定容于100 mL 容量瓶作為檢測樣，參考張靜等[19]的方法進行葛根素標準曲線繪制和樣品總黃酮含量檢測。

1.3 數據處理

采用SPSS 軟件進行顯著性分析，Design-Expert 8.0.6 軟件進行響應面分析，Origin 9 進行標準曲線繪制；試驗數據以“平均值±標準偏差”表示，統計0.05、0.01 水平的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 粉葛不同外植體的誘導效果比較

在不同濃度6-BA 與NAA 組合處理下，葉片、葉柄以及莖段3 種外植體在誘導期內均有萌動現象，但對激素的敏感能力差異顯著(圖1)。 葉柄在靠近葉片的小葉柄部位最為敏感，第4 天即有膨大現象產生，而近莖端稍晚，于第7 天開始膨大；莖段在培養第6 天開始從兩端膨大，且帶莖段節處發生較早；葉片外植體先發生卷邊現象，隨之變厚，第10天從葉片邊緣處出愈，少部分從葉脈處隆起出愈。

圖1 外植體材料和誘導中的外植體

如圖2 所示，葉片主要產生黃綠色和綠色的愈傷組織，質地較為緊實；葉柄和莖主要產生黃綠色的愈傷組織，其中莖段多個處理組的愈傷組織質地較為松散。

圖2 誘導完成的愈傷組織

由表5—表7 可見，在本試驗條件下，6-BA濃度較高時愈傷組織的長勢較好，低濃度時易導致外植體和愈傷組織褐化；6-BA 濃度一定時，葉片、葉柄和莖三種外植體的愈傷組織誘導率在0.5、0.9 mg·L-1NAA 時較高，最高分別達到42.86%、95.83%和96.30%，低濃度NAA 處理下外植體誘導不完全，出愈率低；無植物激素的處理組均沒有愈傷組織產生，而且外植體多數褐化死亡。綜合誘導率、褐化程度以及愈傷組織的量考察三種外植體的誘導情況，Y8(2.0 mg·L-16-BA ＋0.5 mg·L-1NAA)、Y7(2.0 mg·L-16-BA＋0.1 mg·L-1NAA)和Y7(2.0 mg·L-16-BA＋0.1 mg·L-1NAA)處理分別為葉片、葉柄和莖段的最適誘導條件。 其中，莖段愈傷組織在多個處理組表現出松散狀態，因此將莖段用于松散型愈傷組織的增殖培養。

表5 不同濃度6-BA 與NAA 組合下葉片愈傷組織的誘導效果

表6 不同濃度6-BA 與NAA 組合下葉柄愈傷組織的誘導效果

表7 不同濃度6-BA 與NAA 組合下莖段愈傷組織的誘導效果

2.2 粉葛松散型愈傷組織的增殖條件篩選

以較松散的莖段愈傷組織為原料進行增殖試驗，結果(表8)顯示，不同濃度6-BA 與NAA 作用下增殖情況差異顯著。 愈傷組織主要為黃綠色和黃色，少量呈現綠色，Z3 ～Z7 處理的愈傷組織具有比較松散的結構。 其中，Z4(1.0 mg·L-16-BA＋0.25 mg·L-1NAA)處理的愈傷組織增殖系數最高，達到7.41±0.58；其次為Z7 處理，達到7.36±0.29；Z1 處理的最低，僅為4.93±0.48；無激素處理組Z0 對愈傷組織沒有增殖效果。 綜合表明，Z4 處理(1.0 mg·L-16-BA＋0.25 mg·L-1NAA)為松散型愈傷組織培養的初步條件。

表8 不同濃度6-BA 與NAA 處理下莖段愈傷組織的增殖狀況

2.3 粉葛松散型愈傷組織增殖條件的優化

2.3.1 響應面設計結果與方差分析 以增殖系數為響應值，利用BBK 法設計2，4-D、6-BA 和NAA 組合方案，對粉葛松散型愈傷組織的增殖條件進行優化。 結果(表9)顯示，愈傷組織主要為黃綠色和黃色，少量為綠色，大部分處理組呈現出比較松散的狀態。 通過響應面法優化后，愈傷組織的增殖系數整體是上升的，最高能達到9.01，這說明2，4-D、6-BA、NAA 組合對松散型愈傷組織增殖存在一定程度的協同作用。

表9 響應面優化后的增殖結果

經回歸分析得到回歸方程Y ＝8.67＋0.27A-0.054B-0.18C＋0.18AB＋0.018AC-0.37BC-0.85A2-0.35B2-0.83C2。 方差分析結果(表10)顯示，模型F 值為16.79，P＜0.01，說明模型達到極顯著水平；模型失擬項F 值僅為0.090，P＞0.05，說明失擬項未達顯著水平；此外，模型決定系數R2為0.9557，預測R2pred(0.8988)與校正R2adj(0.8902)接近。 綜上說明，該模型有意義，可行度高，適用于對愈傷組織增殖結果的分析和預測。

表10 響應面回歸方差分析結果

同時，方差分析也顯示，A2、C2對愈傷組織增殖的影響達到了極顯著水平(P＜0.01)，A、BC 以及B2對愈傷組織增殖的影響達到了顯著水平(P＜0.05)。 3 種植物外源激素對愈傷組織增殖的影響大小為6-BA＞2，4-D＞NAA。

2.3.2 響應面交互作用分析 交互作用是考察因素之間的疊加效應對響應值的影響，通常用響應面的3D 圖和等高線圖呈現。 圖中從藍色往紅色轉變越快，坡度越陡峭，說明響應值的變化越快，響應結果就越顯著，橢圓形的中心點即為響應面的最高點，反之則不顯著。 由圖3 可知，增殖系數受2，4-D 和NAA 交互作用影響較大，隨著2，4-D 和NAA 濃度的增加，呈現先上升后下降的趨勢，其3D 圖坡度表現較為陡峭，等高線圖也呈明顯的橢圓形。 增殖系數受6-BA 與NAA、6-BA與2，4-D交互作用影響較弱，響應結果不顯著。說明2，4-D 和NAA 濃度過高和過低都不利于愈傷組織的增殖。

圖3 響應面各因素交互作用3D 圖和對應等高線圖

2.3.3 最適增殖條件的預測與驗證 根據響應面模型預測結果，粉葛松散型愈傷組織的最優增殖條件為1.08 mg·L-16-BA＋0.25 mg·L-1NAA＋0.94 mg·L-12，4-D，在此條件下所預測松散型愈傷組織的增殖系數為8.70。 考慮到實際生產中的簡便原則，將該條件近似優化為1.10 mg·L-16-BA＋0.25 mg·L-1NAA＋0.95 mg·L-12，4-D。 經過驗證，該條件下愈傷組織以黃綠色為主，呈現明顯的松散狀態(圖4)，實際的增殖系數達到9.34±0.49。 說明該模型能夠合理地預測松散型愈傷組織的增殖結果，具有實際應用價值。

圖4 松散型愈傷組織

2.4 總黃酮與總酚含量檢測結果

由表11、圖5 可見，葛根素和沒食子酸分別在0～10 μg·mL-1和0～50 μg·mL-1范圍內與吸光度有良好的線性關系，線性回歸方程分別為y ＝0.0744x＋0.0015(R2＝0.9994)、y ＝0.0071x＋0.0047(R2＝0.9992)。 在此條件下，采用紫外分光光度法對粉葛愈傷組織的總黃酮和總酚含量進行檢測，總黃酮和總酚含量分別為(25.07±0.30) mg·g-1和(27.44±0.68) mg·g-1。

圖5 葛根素與沒食子酸標準曲線

表11 總黃酮與總酚檢測結果

3 討論與結論

植物的組織培養受外植體、外源激素、溫度、光照、培養基養分等多方面因素影響，合適的外植體和激素處理是組織培養成功的先導條件之一[20]。 本試驗結果表明，在不同濃度的6-BA 和NAA 作用下，粉葛三種外植體表現出了明顯不同的誘導效果，莖段和葉柄對激素的敏感度和誘導率顯著高于葉片，較早出愈；葉片愈傷組織的最適激素組合為2.0 mg·L-16-BA＋0.5 mg·L-1NAA，莖段和葉柄的最適激素組合均為2.0 mg·L-16-BA＋0.1 mg·L-1NAA，其中莖的誘導率最高，達到96.30%。 這可能與組織的分化程度有關，分化程度越高，外植體對激素的敏感度越低，這一結果在北美海棠[21]與五味子[22]等的研究中也有相同體現。 此外，從大田采集的粉葛由于長期生長在野外，所帶微生物較多，而且較長的生長年限使得其木質化程度增加，不利于外植體的消毒和誘導，因此，本試驗采取在組培室中培育粉葛幼苗以提供幼嫩的外植體材料，降低了組培的污染率，明顯提高了愈傷組織的誘導率，優于馬崇堅等[12]的誘導結果。

松散型愈傷組織因結構相對疏松、細胞團顆粒相對較小，適用于作為懸浮細胞的培養材料，且其較薄的細胞壁也給活性次生代謝產物提取提供了巨大的優勢[23，24]。 本試驗從粉葛莖段所誘導的愈傷組織中，選擇松散狀態的愈傷組織進行增殖培養，篩選出1.0 mg·L-16-BA＋0.25 mg·L-1NAA 作為松散型愈傷組織增殖的初步條件，隨后基于該條件引入生長素2，4-D，通過響應面法系統優化了松散型愈傷組織的增殖條件，發現三種激素的組合作用對松散型愈傷組織增殖具有積極影響，最適條件為1.10 mg·L-16-BA＋0.25 mg·L-1NAA＋0.95 mg·L-12，4-D，此條件下愈傷組織以黃綠色為主，呈現明顯的松散狀態，增殖系數達到9.34。

次生代謝產物是藥食同源植物發揮生物活性的主要成分，譚梔恩等[25]對廣西地區數十種葛根的主要活性成分進行了檢測，發現其中16 種粉葛的總黃酮含量僅為3.35 ～15.83 mg·g-1；黃再強等[26]在川產的多種粉葛中也僅檢測出1.4 ～6.2 mg·g-1的總黃酮。 本試驗對培養的粉葛松散型愈傷組織中的主要次生代謝產物含量進行檢測，總黃酮和總酚含量分別達到(25.07±0.30) mg·g-1和(27.44±0.68) mg·g-1，總黃酮含量明顯高于粉葛植株中的，說明愈傷組織可以一定程度地積累總黃酮等次生代謝產物，通過組織培養技術建立高效的次生代謝產物生產體系是可行的。