LC-MS/MS法研究阿托伐他汀鈣對大鼠體內丁苯酞藥代動力學影響

賀少龍,文恩輝,費平霞,黨宏萬,魏世杰*

(1.寧夏醫科大學總醫院 藥劑科,寧夏 銀川 750000;2.寧夏醫科大學總醫院 臨床藥理研究室,寧夏 銀川 750000;3.西安醫學院第一附屬醫院,陜西 西安 710077)

丁苯酞(Butyphthalide,NBP)是我國藥學人員自主研發的國家一類新藥(商品名為恩必妥),其主要作用機制為改善腦缺血區微循環,《中國急性缺血性腦卒中診治指南》推薦其作為腦卒中患者改善腦血循環的藥物[1];阿托伐他汀鈣(Atorvastatin Calcium,ATV)為國際上急性缺血性卒中的治療和二級預防的推薦藥物[2],在臨床輕、中度急性缺血性腦卒中治療中,兩藥聯用可明顯改善患者的神經功能和血管彈性[3-4],但其藥代動力學相互作用仍需探討研究。旨在建立一種簡單高效測定丁苯酞血藥濃度的方法,為臨床血藥濃度檢測和藥動學研究奠定理論基礎;并研究ATV對大鼠體內NBP藥動學參數是否存在影響,為NBP臨床合理配伍應用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Shimadzu 30A超高液相色譜儀,日本島津公司產品;API 4000四極桿串聯質譜儀和Analyst 1.5.1分析操作軟件均為美國AB公司產品;Centrifuge 5804R低溫離心機,德國Eppendorf公司產品;XH-B渦旋混合器,姜堰市康健醫療器具有限公司;AE240分析天平,梅特勒-托利多儀器上海有限公司。

1.2 藥品與試劑

丁苯酞對照品(純度>99.6%,批號:101035-201502),購自中國藥品生物制品檢定研究院;地西泮對照品純度>99.9%,批號:110805-200508),購自中國藥品生物制品檢定研究院;丁苯酞軟膠囊(批號118170609,國藥準字H20050299,規格0.1 g/粒),由石藥集團恩必普藥業有限公司生產;阿托伐他汀鈣片(批號201710001,國藥準字H20133127,規格10 mg/片),羧甲基纖維素鈉(Sodium carboxymethyl cellulose,CMC-Na 批號:20150812),均由浙江新東港藥業股份有限公司生產;市售植物油;色譜甲醇和乙腈(美國Fisher公司);實驗用水為超純水;其他溶劑均為分析純。

1.3 實驗動物

健康成年清潔級SD大鼠14只,雌雄各半,體重(250±30)g,由寧夏醫科大學實驗動物中心提供。動物許可證號:SCXK(寧)2016-0021。實驗前12 h 禁食不禁水。

2 方法

2.1 色譜、質譜條件

色譜條件 色譜柱:Phenomenex Kinetex-C18色譜柱(50.0 mm×2.1 mm,1.7 μm);流動相:0.1%甲酸(A相)-乙腈(B相),梯度洗脫(0～0.6 min,90%A;0.6～1.2 min,90% → 7% A;1.2～2.6 min,7% A;2.6～3.0 min,7% → 90% A;3.5 min停止);柱溫:40 ℃;流速:0.3 mL·min-1;進樣量:3 μL。

質譜條件 電噴霧電離源(ESI),正離子模式多反應監測(MRM);離子源噴霧電壓:5.5 kV;源溫:500 ℃;霧化氣:276 kPa;輔助加熱氣:276 kPa;氣簾氣:69 kPa;碰撞氣:55 kPa。NBP和內標(地西泮)在MRM 模式下的定量監測離子對分別為m/z 191.1→145.1(NBP),m/z 285.6→193.1(內標)。

2.2 溶液配置

NBP、地西泮儲備液和工作液:分別精密稱取NBP對照品、地西泮適量,用甲醇溶解,配置成質量濃度為1 mg·mL-1的標準儲備液。取一定量的內標(地西泮)儲備液,用甲醇稀釋制備內標工作液(10 ng·mL-1),置于-20 ℃冰箱中保存備用。

NBP油溶液:取NBP軟膠囊6粒(規格0.1 g/粒),使用注射器將膠囊內全部藥液移出,用植物油將收集的藥液稀釋成30 mg·mL-1NBP油溶液備用。

ATV混懸液:精密稱取ATV原料藥12.011 mg,用0.25% CMC-Na溶液配置ATV(1 mg·mL-1)混懸液。

2.3 分組給藥方法及血樣采集

采用隨機平行對照實驗設計,將雌雄各半共14只健康成年SD大鼠隨機分為對照組(A組)和實驗組(B組),每組7只,單次灌胃給藥。A組灌胃給予NBP油溶液(70 mg·kg-1)+0.25% CMC-Na溶液;B組灌胃給予NBP油溶液(70 mg·kg-1)+ ATV混懸液(用0.25% CMC-Na配制,8 mg·kg-1)。單次給藥前(0 h)和給藥后0.083,0.167,0.25,0.5,1,1.5,2,3,4,6,8,12,24 h采集血樣,每次眼眶采血0.3 mL至肝素鈉涂壁的EP管中,4 000 r·min-1離心5 min,移取上層血漿置于-70 ℃低溫冷凍冰箱中備用。

2.4 血漿樣品處理

準確移取大鼠血漿100 μL置1.5 mLEP管中,加內標(地西泮1 mg·mL-1)20 μL,旋渦振蕩1 min,加乙腈300 μL,旋渦混合振蕩3 min,在4 ℃下,以1.4×104r·min-1離心10 min,取上清液3 μL進樣分析。

2.5 方法學評價

2.5.1 專屬性

分別取不同的來源的6份空白大鼠血漿100 μL,除不加內標地西泮溶液外,其余步驟按“血漿樣品處理”項下操作,進樣后得到空白樣品的色譜圖。另取一定質量濃度的NBP、地西泮標準溶液加入到空白血漿中,采用上述相同步驟處理。

2.5.2 標準曲線及定量下限

取大鼠空白血漿190 μL,依次加入標準系列溶液10 μL,配制成NBP質量 濃度為5,10,20,50,100,500,1 000 ng·mL-1的標準含藥血漿,按“血漿樣品處理”項下操作。以待測物的峰面積與內標峰面積之比(A/Ai)為縱坐標Y,待測物濃度(c)為橫坐標X用加權最小二乘法進行線性回歸,計算標準曲線。

2.5.3 精密度與回收率

取大鼠空白血漿190 μL,標準系列溶液10 μL依次加入,配制成NBP質量濃度為10,100,800 ng·mL-1的標準含藥血漿,每個濃度6份平行樣本,按“血漿樣品處理”項下操作。同法連續操作3 d,計算日內、日間精密度和絕對提取回收率。

2.5.4 基質效應

按“血漿樣品處理”項下方法操作,處理來源不同的6份空白大鼠血漿,依次加入低、中、高3個質量濃度的NBP對照品溶液和內標溶液,將得到的NBP和內標峰面積除以相應濃度的NBP對照品溶液及內標溶液直接同體積進樣得到的峰面積,計算血漿中內源性物質對NBP和內標的絕對基質效應,再以NBP的絕對基質效應除以內標的絕對基質效應,得到NBP的內標歸一化的基質效應。

2.5.5 稀釋因子試驗

將濃度為4 000 ng·mL-1NBP溶液稀釋5倍后其測定值乘以相應的稀釋因子后與對應的理論值做比較。

2.5.6 穩定性

用大鼠空白血漿配制含NBP質量濃度為10,100,800 ng·mL-1各6份,室溫條件下放置24 h,按“血漿樣品處理”項處理進樣,考察室溫放置24 h血漿樣本的穩定性。

2.6 統計學處理

實驗數據的結果以表示,運用DAS 2.0軟件計算藥代動力學參數,用11.0版SPSS統計軟件進行統計分析。

3 結果

3.1 方法學驗證

3.1.1 專屬性

待測物NBP和內標地西泮的色譜圖如圖1所示,在本測定條件下,NBP和內標的保留時間分別為2.10 min和2.05 min,空白血漿中的內源性物質不干擾NBP和內標的測定。

A: 空白血漿大鼠體內的藥動學參數改變;B: 空白血漿+地西泮;C: 空白血漿+NBP;D: 灌胃NBP 0.5 h后采集的大鼠血漿樣品圖1 待測物NBP和內標地西泮的色譜圖

3.1.2 線性范圍

NBP的線性范圍為5～1 000 ng·mL-1,定量下限為5 ng·mL-1,定量下限的相對偏差(RE)在-3.4%～7.2%,精密度RSD為11.43%,得到線性回歸方程:Y=0.012 7X+0.266(r=0.997 3),結果表明待測物在濃度范圍內具有良好的線性。

3.1.3 精密度與準確度

表1結果顯示,測得NBP的三個濃度的質控樣品相對回收率均>85%,日內和日間精密度RSD均小于15%,提示該方法準確、可靠、重現性較好,可以用于血漿中NBP含量測定。

表1 血漿中NBP的精密度及回收率

3.1.4 基質效應與稀釋效應

質量濃度為10,100,800 ng·mL-1的NBP血漿樣品經內標歸一化的基質效應分別為(99.9±0.11)%,(93.6±0.05)%和(96.1±0.03)%;大鼠血漿中內標的基質效應為(84.8 ± 2.4)%,生物樣品的基質效應不影響待測物濃度測定,符合定量要求。稀釋效應試驗結果表明,待測物實際值與測定值RE和RSD分別為-3.13%和3.73%,提示待測血漿藥品超過標準曲線定量上限時,將樣品稀釋5倍后測定,結果仍然可靠。

3.1.5 穩定性

低、中、高濃度的NBP大鼠血漿樣品在室溫下放置24 h后的RSD分別為13.54%,7.87%和9.05%,說明含NBP血漿樣品在室溫條件、24 h內測定分析過程穩定性良好。溶液穩定性、凍融穩定性、長期穩定性已有文獻報道,故未重復驗證[5-6]。

3.2 藥動學相互作用

3.2.1 血藥濃度-時間曲線

A組和B組單次灌胃給藥后丁苯酞的平均血藥濃度-時間曲線見圖2 。

A組:NBP;B組:NBP+ATV

3.2.2 藥代動力學參數

采用DAS 2.0軟件計算NBP藥動學參數,結果表明ATV與NBP聯合使用會導致后者在大鼠體內的藥動學參數改變。ATV引起NBP藥動學參數改變:Vz增加、t1/2、MRT0-t延長,見表2。

表2 NBP在大鼠體內的藥代動力學參數

4 討論

本研究采用HPLC-MS/MS法可在3 min內測定丁苯酞血藥濃度,采用乙腈沉淀蛋白,檢測效率高,操作簡單,回收率高,能滿足臨床血藥濃度快速檢測和相關藥動學研究的需要。

藥動學相互作用可以發生在藥物進入機體內的吸收、分布、代謝和排泄等階段[7-8]。本研究顯示NBP在兩組大鼠體內主要藥動學參數Cmax、AUC0-t和Vz值改變無統計學差異,表明ATV對NBP吸收和組織分布影響不大。藥物體內代謝性相互作用主要由肝臟CYP450酶系介導,NBP在大鼠及人體內主要經過CYP2E、CYP3A和CYP2C代謝[9];ATV在體內主要經過CYP3A代謝,部分經過CYP2C代謝[10]。研究結果顯示:單次NBP灌胃給藥與聯合使用后,聯合用藥組使得藥物滯留時間延長,其在體內暴露增多,這可能與ATV和NBP兩藥競爭共同的代謝酶有關。在臨床應用時,兩藥聯合應注意調整劑量。

目前多種藥物聯合使用在臨床治療中非常普遍,尤其NBP作為一類新藥上市后藥物相互作用研究較少,并且相互作用機制復雜多樣[11]。對于長期同服NBP及ATV的腦梗患者,本研究初步表明ATV可能與NBP競爭共同作用代謝酶CYP3A和CYP2C,從而產生體內藥物代謝相互作用,引起NBP藥理作用的改變。但研究結果來自于動物單次給藥實驗,其在人體的藥代動力學相互作用有必要進一步設計探究。