UPLC-MS/MS法測定清潔驗證中殘留物三芐糖苷

侯繼鵬,陳美麗,崔祥禎,鄭華,時曉燕,張業華,郝貴周,張貴民

(魯南制藥集團股份有限公司,國家手性制藥工程技術研究中心,山東 臨沂 273400)

三芐糖苷化學名稱為乙基-3,5,6-三芐基-D-呋喃葡萄糖苷,是由α體(α-乙基-3,5,6-三芐氧基-D-呋喃葡萄糖苷)和β體(β-乙基-3,5,6-三芐氧基-D-呋喃葡萄糖苷)兩種光學異構體組成的一種混合物,α體和β體的組成質量比例為1∶2。在強酸、光照及高溫條件下均不穩定,易分解。它是一種毛細血管保護劑,具有抗炎、輕度鎮痛、抗毒素、促進傷口愈合、促進纖維蛋白溶解等特性[1-3]。

在藥品進行生產時,通常會存在不同藥品使用同一生產設備以及生產線的現象,為防止藥品生產造成的交叉污染,需要生產完后設備上藥品殘留物進行清潔研究[4-6]。當生產三芐糖苷軟膠囊時,為防止該產品對其共線藥品的交叉污染,同時根據三芐糖苷軟膠囊的處方組成,選擇三芐糖苷為指標進行設備清潔程度的研究。

根據藥品生產驗證指南及GMP指南要求,殘留物限度計算通常采用以下三種方式:(1)基于日治療劑量的1/1 000計算;(2)基于最低限度10×10-6計算;(3)基于半數致死量計算[7-10]。通過以上3種方式經計算得到生產設備三芐糖苷殘留的限度分別為2.153,0.040,12.558 μg/cm2。為保證共線生產藥品安全,選擇最嚴格的限度0.040 μg/cm2作為三芐糖苷限度要求,研究棉簽擦拭回收設備表面三芐糖苷的殘留量。

目前對于三芐糖苷的檢測僅見HPLC法和高碘酸法[11-13],但這兩種檢測方法靈敏度較低,定量限分別為0.03 mg/mL和12 mg/mL;且使用HPLC法分析樣品需要20 min以上,高碘酸法樣品制備則需要8 h以上,無法滿足三芐糖苷清潔驗證中低限度及快速檢測的要求。本研究建立了滿足檢測靈敏度要求,且樣品分析在5 min內,準確度更高的超高效液相色譜-串聯質譜法(UPLC-MS/MS)法,用于快速檢驗生產設備表面三芐糖苷殘留量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Vanquish TSQ Altis型超高效液相色譜-質譜聯用儀(美國Thermo公司);十萬分之一電子天平MS105DU(瑞士Mettler Toledo公司);Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)。

1.2 試藥

三芐糖苷對照品(高瑞耀業,含量99.5%,批號201001-2101028);乙腈(質譜級、Merck公司);乙醇(色譜級、Merck公司);水(超純水,美國Millipore 公司)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜條件:色譜柱 YMC Triart C18(2.1 mm×100 mm,1.9 μm);流動相10 mmol/mL乙酸銨-乙腈(體積比15∶85);流速 0.2 mL/min;柱溫 40 ℃ ;進樣量 2 μL。

質譜條件:離子源為電噴霧電離源(ESI),正離子模式采集;選擇反應監測模式(SRM),噴霧電壓為3 500 V,監測離子對m/z496.21→181.18。

2.2 溶液配制

對照品溶液:精密稱取三芐糖苷適量,加95%乙醇溶解并定量稀釋制成10 μg/mL的溶液,作為對照品儲備液;精密量取對照品貯備液適量,用95%乙醇稀釋制成每1 mL中約含10 ng的溶液。

供試品溶液:取擦拭過鋼板的棉簽,加95%乙醇50 mL超聲提取2 min后,用95%乙醇定容至100 mL。

2.3 棉簽擦拭方法

取1個棉簽,用一面按圖1 A所示,平穩而緩慢地從水平方向擦拭整個取樣表面。然后翻轉,用另一面按圖1 B所示讓其從垂直方向也進行擦拭取樣。然后取另一支棉簽,依上述方法重復擦拭一遍。擦拭面積25 cm2。

圖1 棉簽擦拭方法

2.4 專屬性

取空白溶液(95%乙醇)、空白棉簽溶液、對照品溶液,分別進樣,結果見圖2。三芐糖苷的β體和α體依次出峰,保留時間分別為2.609,3.155 min,兩者分離度大于1.5。空白溶液及空白棉簽溶液不干擾三芐糖苷的測定。

A.空白溶液;B.空白棉簽溶液;C.對照品溶液圖2 專屬性色譜圖

2.5 線性試驗

精密量取對照品貯備液0.02,0.05,0.08,0.1,0.15,0.2 mL分別置100 mL量瓶中,用95%乙醇稀釋至刻度,搖勻,作為線性與范圍試驗溶液,分別進樣測定,記錄色譜圖。以濃度c為橫坐標,峰面積A(β和α之和)為縱坐標,進行線性回歸,得標準曲線方程A=317.56c-70.54,r=0.999 8,表明三芐糖苷在2.09～20.86 ng/mL范圍內線性關系良好。

2.6 定量限和檢測限

取對照品貯備液,用95%乙醇逐級稀釋至信噪比(S/N)約為10,得定量限溶液;用95%乙醇逐級稀釋至S/N約為3,得檢測限溶液。測得三芐糖苷的檢測限和定量限濃度分別為0.70和2.09 ng/mL。

2.7 方法回收率

配制3個濃度(2,10和15 ng/mL)的樣品溶液,各3份,進樣測定。計算得三芐糖苷方法回收率結果見表1,表明本方法準確度良好。

表1 方法回收率結果

2.8 棉簽回收率

精密移取三芐糖苷對照貯備溶液0.1 mL于棉簽上,干燥后,將棉簽放置于100 mL的容量瓶中,加95%乙醇50 mL超聲提取2 min后,用95%乙醇定容至100 mL,依法配制6份并進樣對照溶液,按外標法計算棉簽回收率,結果見表2,表明棉簽回收率良好。

表2 棉簽回收率結果

2.9 擦拭回收率

取表面光滑的304#不銹鋼平板一塊,劃出5 cm×5 cm的區域。精密移取三芐糖苷對照貯備溶液0.1 mL,在上述區域內涂布均勻后,用棉簽按“2.3”項下方法擦拭。取擦拭過鋼板的棉簽,加95%乙醇50 mL超聲提取2 min后,用95%乙醇定容至100 mL,即得供試品溶液,重復制備6份,依法測定,結果見表3,表明擦拭回收率良好。

表3 擦拭回收率結果

2.10 精密度

精密量取對照品貯備液0.1 mL,置100 mL量瓶中,用95%乙醇稀釋至刻度,搖勻,配制6份,進樣,計算三芐糖苷峰面積為的RSD(n=6)為0.50%,表明本法精密度良好。

2.11 穩定性

取新配制的對照品溶液室溫放置,在0,1,2,4,6,8,10,12 h進樣測定,記錄色譜圖。計算得對照品溶液中三芐糖苷峰面積為的RSD為2.07%,這表明對照品溶液于室溫放置12 h內穩定。

3 討論

生產設備清潔用溶劑根據設備特點、溶劑成本及操作難易程度等一般會選擇水或者95%乙醇作為清潔溶劑[14]。經考察發現因三芐糖苷的極性較小,使用水作為清潔溶劑無法達到清潔限度要求,故將清潔溶劑選擇為95%乙醇,在進行方法開發的時候稀釋液選擇也使用95%乙醇,以達到與清潔用溶劑一致的目的。

通過計算三芐糖苷的清潔限度較低,為納克級別的濃度水平,使用HPLC法已無法達到檢測靈敏度,因此開發了靈敏度更高的UPLC-MS/MS方法。經離子對優化發現三芐糖苷的準分子離子[M+H]響應較小,而加合離子[M+NH4]響應較高,故流動相中加入乙酸銨,保證加合離子的穩定性。

三芐糖苷是由β和α兩種異構體組成的混合物,用外標法以峰面積計算時,采用了β和α峰面積之和。為了色譜圖中積分計算準確,檢測方法中需要將β和α完全分開,通過改變流動相中乙腈的比例,最終選擇10 mmol/L乙酸銨-乙腈(體積比15∶85)等度洗脫,三芐糖苷的兩個異構體的分離較好,且樣品的分析在5 min內,可以更好地配合清潔操作的完成。

綜上所述,本研究中建立的UPLC-MS/MS法準確、簡便、快速、靈敏度高、專屬性強,可用于清潔驗證中三芐糖苷殘留物的快速定量分析。