利塞膦酸鈉皮膚微透析方法的建立*

梁俊暉，蘇安宇，李亞欣，鄧世森，杜錦顏，王利勝

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006）

雙膦酸鹽是目前臨床應(yīng)用最廣泛的抗骨質(zhì)疏松藥物［1］。美國(guó)臨床內(nèi)分泌學(xué)家協(xié)會(huì)（AACE）和美國(guó)內(nèi)分泌學(xué)會(huì)（TES）制訂的《絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松診斷與治療臨床實(shí)踐指南（2020）》指出，大部分高風(fēng)險(xiǎn)骨折患者可首選雙膦酸鹽進(jìn)行初始治療［2］。雙膦酸鹽的藥品不良反應(yīng)主要為消化道損傷、腎毒性及眼疾，與其口服及靜脈注射的給藥方式密切相關(guān)［3-6］。且口服雙膦酸鹽要求患者空腹并保持30 min 以上的站立或直立坐姿，以減輕藥物對(duì)消化道的損傷［7］，這對(duì)于骨質(zhì)疏松患者尤其是重癥患者難以完成。因此，如何減少雙膦酸鹽的藥品不良反應(yīng)，提高患者用藥便利性及依從性，已成為相關(guān)從業(yè)人員的研究熱點(diǎn)［8-10］。經(jīng)皮給藥系統(tǒng)可通過(guò)皮膚給藥，避免了傳統(tǒng)給藥方式的首過(guò)效應(yīng)、峰谷現(xiàn)象、依從性差等局限［11］，能很好地解決雙膦酸鹽因口服、注射等方式所致的不良反應(yīng)問(wèn)題［12］。目前，已有以壓敏膠、離子配對(duì)、透明質(zhì)酸凝膠、微乳、納米粒等進(jìn)行雙膦酸鹽給藥的研究，生物利用度提升，藥品不良反應(yīng)發(fā)生率降低［13］。微透析技術(shù)是一種將微灌流取樣與透析技術(shù)相結(jié)合的活體取樣技術(shù)，具有動(dòng)態(tài)采樣、定量分析、采樣量小、創(chuàng)傷極小的特點(diǎn)［14］，用于經(jīng)皮局部藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究中，能最大限度地保護(hù)皮膚完整性及活性，在評(píng)價(jià)藥物滲透性能、藥物代謝動(dòng)力學(xué)及藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)方面有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)［15-16］。利塞膦酸鈉為雙膦酸鹽的典型代表藥物，具有強(qiáng)大的抗骨吸收作用及較廣抗骨折譜，已成為臨床上治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的一線藥物［17-18］。本研究中，通過(guò)考察灌流液流速與藥物質(zhì)量濃度對(duì)探針體外回收率與損失率的影響，明確利塞膦酸鈉皮膚微透析的可行性，為后續(xù)利塞膦酸鈉的藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)及雙膦酸鹽類藥物透皮評(píng)價(jià)模式的選擇提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

K2025 型高效液相色譜儀（山東悟空儀器有限公司）；AUW120D 型電子分析天平（日本Shimadzu 公司，精度為十萬(wàn)分之一）；90-1型恒溫磁力攪拌器（上海滬西分析儀器公司）；微透析系統(tǒng)包括MD-1000B型流速控制器，MD-0100型灌注器，MD-1001型灌注器推進(jìn)泵（美國(guó)BAS 公司）；MAB85 雙通道低溫收集器（瑞典MAB 公司）CMA30 型線性探針（瑞典CMA 公司，截留相對(duì)分子質(zhì)量為20 000）；KQ5200DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為200 W，頻率為40 kHz）；UPTA-20 型超純水機(jī)（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；雙通道燒杯（50 mL，四川蜀牛玻璃儀器有限公司）。

1.2 試藥

利塞膦酸鈉對(duì)照品（批號(hào)為Y17N8C48386，純度為98%），四丁基溴化銨（分析純），無(wú)水磷酸二氫鈉（分析純），均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；甲醇（色譜純，北京邁瑞達(dá)科技有限公司）；乙二胺四乙酸二鈉（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；氫氧化鈉（分析純，滬試國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；0.9%氯化鈉注射液（辰欣藥業(yè)股份有限公司）。所有進(jìn)入微透析系統(tǒng)的試劑均經(jīng)0.22μm濾膜濾過(guò)。

2 方法與結(jié)果

2.1 利塞膦酸鈉含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)［19］

色譜柱：ChromCore C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：磷酸二氫鈉緩沖液（含5 mmol/L 磷酸二氫鈉，2 mmol/ L 四丁基溴化銨，1.5 mmol/ L 乙二胺四乙酸二鈉，以4%氫氧化鈉溶液調(diào)pH 至7.2）-甲醇（75∶25，V/V）；流速：1.0 mL/ min；檢測(cè)波長(zhǎng)：262 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20μL。理論板數(shù)按利塞膦酸鈉峰計(jì)應(yīng)不低于4 000。

2.1.2 溶液制備

微透析對(duì)照品溶液：取利塞膦酸鈉對(duì)照品4.80 mg，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，用0.9%氯化鈉注射液溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為48.0μg/mL 的微透析對(duì)照品母液；精密量取12.5，25.0，50.0 mL，分別置100 mL容量瓶中，加0.9%氯化鈉注射液定容，制成質(zhì)量濃度分別為6.0，12.0，24.0μg/mL的微透析對(duì)照品溶液。

對(duì)照品溶液：取利塞膦酸鈉對(duì)照品8.00 mg，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為80.0μg/mL 的高效液相色譜（HPLC）對(duì)照品母液。精密量取5.0 mL，置10 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋定容，制成質(zhì)量濃度為40.0 μg/ mL 的對(duì)照品溶液。同法逐級(jí)稀釋制成質(zhì)量濃度分別為20.0，10.0，5.0，2.5，1.25，0.625μg/mL的系列對(duì)照品溶液。

體外透析液及空白透析液：將微透析探針浸入含50 mL 0.9%氯化鈉注射液的雙通道燒杯中，開(kāi)啟恒溫磁力攪拌器［溫度為（37±0.5）℃，轉(zhuǎn)速為（200 r/min）］，分別以質(zhì)量濃度為12.0μg/mL 的微透析對(duì)照品溶液、0.9%氯化鈉注射液進(jìn)行灌流，灌流速度為1.0μL/min，開(kāi)泵平衡60 min后進(jìn)行收集，即得。

2.1.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取2.1.2 項(xiàng)下體外透析液、質(zhì)量濃度為12.0 μg/ mL 的對(duì)照品溶液、空白透析液各適量，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。利塞膦酸鈉峰形良好，透析液中其他成分無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1。

1.利塞膦酸鈉A.空白透析液 B.對(duì)照品溶液 C.體外透析液圖1 高效液相色譜圖1.Risedronate sodiumA.Blank dialysate B.Reference solution C.In vitro dialysateFig.1 HPLC chromatogram

線性關(guān)系考察：取2.1.2 項(xiàng)下質(zhì)量濃度分別為80.0，40 .0，20.0，10.0，5.0，2.5，1.25，0.625 μg/ mL的對(duì)照品溶液，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得利塞膦酸鈉回歸方程Y =9.056 7X -2.571 7（r2= 0.999 7，n= 3）。結(jié)果表明，利塞膦酸鈉質(zhì)量濃度在0.625～80.0μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取質(zhì)量濃度為40.0μg/mL 的對(duì)照品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果利塞膦酸鈉峰面積的RSD為0.36%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.1.2 項(xiàng)下質(zhì)量濃度分別為48.0，24.0，12.0 μg/ mL 的微透析對(duì)照品溶液，分別于室溫下放置0，12，24，36，48，72 h 時(shí)按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果利塞膦酸鈉峰面積的RSD分別為0.63%，1.48%，1.72%（n=6），表明微透析對(duì)照品溶液在室溫下放置72 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2 微透析探針體外回收率和損失率測(cè)定［20］

增量法：探針外藥物順濃度梯度透過(guò)探針膜進(jìn)入探針，被0.9%氯化鈉注射液接收，使透析液藥物濃度升高，此過(guò)程為藥物的回收。回收率（R）=C透析液/C環(huán)境×100%，其中，C透析液代表透析液中藥物的質(zhì)量濃度，C環(huán)境代表探針外環(huán)境藥物的質(zhì)量濃度。

減量法：灌流液中藥物順濃度梯度透過(guò)探針膜擴(kuò)散到探針外環(huán)境，被外環(huán)境0.9%氯化鈉注射液接收，使透析液藥物質(zhì)量濃度降低，此過(guò)程為藥物的損失。損失率（L）=（C灌流液-C透析液）/C灌流液× 100%。其中，C透析液代表透析液中藥物的質(zhì)量濃度，C灌流液代表灌流液中藥物的質(zhì)量濃度。

2.3 灌流液流速與取樣間隔確定

取0.9%氯化鈉注射液50 mL，置雙通道燒杯中，浸入微透析探針，使探針膜居液體中心，用保鮮膜束口以穩(wěn)定瓶?jī)?nèi)環(huán)境，開(kāi)啟恒溫磁力攪拌器［溫度為（37 ±0.5）℃，轉(zhuǎn)速為100 r/min］，以質(zhì)量濃度為12.0μg/mL的微透析對(duì)照品溶液為灌流液，在0.5，1.0，2.0，3.0，4.0μL/min 流速下進(jìn)行灌注，開(kāi)泵平衡60 min 后收集不同流速下的透析液，每次收集40μL，每個(gè)流速收集3個(gè)樣品，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算探針體外損失率。體外微透析試驗(yàn)裝置示意圖見(jiàn)圖2。同法，將微透析探針浸于質(zhì)量濃度為12.0 μg/ mL 的微透析對(duì)照品溶液中，以0.9%氯化鈉注射液為灌流液，在不同流速下灌注并進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算探針體外回收率。

由表1 可知，流速在0.5～4.0 μL/ min 范圍內(nèi)，利塞膦酸鈉的探針體外回收率隨著流速加快呈類線性下降，當(dāng)流速為0.5 μL/min 時(shí)體外回收率最大（59.76 ±1.85）%。探針存在較固定的誤差范圍［21］，選擇回收率較高的流速能在一定程度上保證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。但過(guò)慢的流速會(huì)導(dǎo)致取樣時(shí)間延長(zhǎng)，潛在的探針免疫排斥現(xiàn)象同樣會(huì)干擾試驗(yàn)的準(zhǔn)確性［22］，且試驗(yàn)效率低下［23］。綜合考慮，確定灌流速度為1.0μL/min，取樣間隔為40 min，此條件下利塞膦酸鈉的探針體外回收率為（45.85±0.63）%。且同一流速下利塞膦酸鈉的探針體外回收率與損失率相當(dāng)（RSD=1.82%），表明反透析法可應(yīng)用于利塞膦酸鈉探針體內(nèi)回收率的計(jì)算。

表1 灌流液不同流速對(duì)探針體外回收率和損失率的影響（%，n=3）Tab.1 Effect of different flow rates of perfusion fluid on the in vitro recovery rates and loss rates of the probe（%，n=3）

2.4 灌流液質(zhì)量濃度確定

取0.9%氯化鈉注射液50 mL，置雙通道燒杯中，浸入微透析探針，使探針膜居于液體中心，用保鮮膜束口以穩(wěn)定瓶?jī)?nèi)環(huán)境，開(kāi)啟恒溫磁力攪拌器［溫度為（37 ±0.5）℃，轉(zhuǎn)速為100 r/ min］，以2.1.2 項(xiàng)下質(zhì)量濃度分別為6.0，12.0，24.0，48.0 μg/ mL 的微透析對(duì)照品溶液為灌流液，在1.0 μL/ min 的流速下進(jìn)行灌注，開(kāi)泵平衡60 min 后收集不同灌流液濃度下的透析液，每次收集40μL，每個(gè)濃度收集3 個(gè)樣品，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算探針體外損失率。同法，將微透析探針浸于4組不同質(zhì)量濃度的微透析對(duì)照品溶液中，以0.9%氯化鈉注射液為灌流液進(jìn)行灌注并進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算探針體外回收率。

由表2 可知，質(zhì)量濃度在6.0～48.0 μg/ mL 范圍內(nèi)，利塞膦酸鈉的探針體外回收率基本一致，相同質(zhì)量濃度下利塞膦酸鈉的探針體外回收率與損失率相當(dāng)，表明質(zhì)量濃度在6.0～48.0μg/mL 范圍內(nèi)的變化對(duì)探針體外回收率影響不顯著，提示反透析法可應(yīng)用于利塞膦酸鈉體內(nèi)回收率的計(jì)算。

表2 灌流液不同質(zhì)量濃度對(duì)探針體外回收率和損失率的影響（%，n=3）Tab.2 Effect of different mass concentrations of perfusion fluid on the in vitro recovery rates and loss rates of the probe（%，n=3）

3 討論

雙膦酸鹽類藥物受限于自身較大的分子量及較差的脂溶性，難以依靠細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的方式吸收，導(dǎo)致口服生物利用度較差。同時(shí)多數(shù)雙膦酸鹽類藥物帶有負(fù)電荷，形成的電離屏障使小腸吸收更困難［24］。此外，有關(guān)使用雙膦酸鹽類藥物引起腎毒性［25］及眼毒性［26-27］等藥品不良反應(yīng)早已報(bào)道，但受限于醫(yī)藥行業(yè)發(fā)展的滯后，一直未找到更好的解決方式。2000 年，RAMACHANDRAN等［28］將雙膦酸鹽做成油包水型微乳進(jìn)行經(jīng)皮給藥，雖然受試動(dòng)物出現(xiàn)了輕微的皮膚刺激反應(yīng)。目前，針對(duì)高分子水溶性物質(zhì)經(jīng)皮給藥難以透過(guò)角質(zhì)屏障的問(wèn)題，出現(xiàn)了以微針給藥、離子導(dǎo)入、超聲導(dǎo)入為代表的多種解決方案，這些新型經(jīng)皮給藥技術(shù)不僅能使藥物有與注射給藥一樣良好的生物利用度，且解決了傳統(tǒng)注射及口服給藥依從性差的問(wèn)題［29］。

雙膦酸鹽類藥物利塞膦酸鈉具有較強(qiáng)的親水性，且分子量相對(duì)較大，難以通過(guò)傳統(tǒng)經(jīng)皮給藥方式通過(guò)角質(zhì)屏障進(jìn)入人體循環(huán)［30］，不僅阻礙了雙膦酸鹽類藥物的經(jīng)皮給藥劑型開(kāi)發(fā)，同時(shí)也無(wú)法通過(guò)體外透皮試驗(yàn)對(duì)該類制劑進(jìn)行評(píng)價(jià)。微透析探針膜因其纖維材料與皮膚結(jié)構(gòu)可區(qū)分，特別適用于水溶性成分及小分子化合物的采集［31］，可考慮用于雙膦酸鹽類藥物新型經(jīng)皮給藥制劑的皮膚滲透性評(píng)價(jià)。

本研究中通過(guò)考察灌流液流速與藥物質(zhì)量濃度對(duì)探針體外回收率與損失率的影響，建立了利塞膦酸鈉皮膚微透析方法。結(jié)果顯示，在1.0 μL/ min 的流速下具有較好的回收率，且取樣間隔科學(xué)、合理，此時(shí)利塞膦酸鈉探針體外回收率為（45.85±0.63）%，與損失率基本一致（RSD= 1.82%）；利塞膦酸鈉質(zhì)量濃度在6.0～48.0 μg/ mL 范圍內(nèi)的探針體外回收率基本一致，表明微透析方法用于評(píng)價(jià)利塞膦酸鈉經(jīng)皮局部給藥的藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)可行。