基于UHPLC - Q - Orbitrap MS/ MS 的扶正抗癌Ⅱ方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其干預(yù)結(jié)腸癌作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究*

周敏華，金 軍△，王紅剛，蔡大可，黃曉霞，劉喜娟，余靖華

（1.廣東省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東 佛山 528200； 2.廣東藥科大學(xué)，廣東 廣州 510006； 3.廣東省第二中醫(yī)院·廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣東 廣州 510095； 4.廣東省佛山市南海區(qū)人民醫(yī)院，廣東 佛山 528200）

結(jié)腸癌每年造成全球80 萬人過早死亡［1］。中醫(yī)認(rèn)為，結(jié)腸癌屬“癥瘕”范疇，是由于正氣虧虛、瘀、毒等在體內(nèi)郁結(jié)而成。已有研究發(fā)現(xiàn)，植物中的化學(xué)物質(zhì)等會(huì)干擾結(jié)腸癌的發(fā)生與發(fā)展［2］。廣東省佛山市南海區(qū)名中醫(yī)金軍教授以扶正培本結(jié)合消痞散結(jié)為治法，自擬扶正抗癌Ⅱ方（FZKAⅡ方）治療結(jié)腸癌，由黨參、五爪金龍、白術(shù)、茯苓、薏苡仁、法半夏、浙貝母、陳皮、青皮、制仙茅、杜衡、山海螺、菝葜等組方，能有效預(yù)防腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，改善癌因性疲乏癥狀［3］。本研究中采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道肼高分辨串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC - Q - Orbitrap MS/ MS）法檢測得到FZKAⅡ方水提液化學(xué)成分，并采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)復(fù)方化學(xué)成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測及在線數(shù)據(jù)庫收集疾病靶點(diǎn)，以探討FZKAⅡ方干預(yù)結(jié)腸癌的作用機(jī)制。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 儀器與試藥

儀器：UHPLC - Q - Orbitrap HRMS 型液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)（美國Thermo Fiser Scientific 公司）；Cubis型電子天平（德國Sartorius 公司，精度為百萬分之一）；98 - Ⅰ- C型數(shù)顯控溫電熱套（湖北泰維科技實(shí)業(yè)股份有限公司）；KQ-300DE型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司，功率為300 W，頻率為40 kHz）；N-1300 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）。

試藥：黨參（批號(hào)為20211101），五爪金龍（批號(hào)為20211201），白術(shù)（批號(hào)為20220101），制仙茅（批號(hào)為20211201），法半夏（批號(hào)為202201228），茯苓（批號(hào)為20220101），杜衡（批號(hào)為20190601），山海螺（批號(hào)為20200701），菝葜（批號(hào)為20210601），浙貝母（批號(hào)為20220201），薏苡仁（批號(hào)為20220101），陳皮（批號(hào)為20211101），青皮（批號(hào)為C22103003），均購自佛山市中天中藥飲片有限公司；松脂醇二葡萄糖苷對(duì)照品（批號(hào)為20011401），蘆丁對(duì)照品（批號(hào)為21010803），齊墩果酸對(duì)照品（批號(hào)為21031204），綠原酸對(duì)照品（批號(hào)為21032502），辛弗林對(duì)照品（批號(hào)為0727 - 200004），均購自成都普菲德生物科技有限公司，含量大于98%；貝母素乙對(duì)照品（批號(hào)為10751-201110），黨參炔苷對(duì)照品（批號(hào)為111732 - 201908），阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)為110773 - 201915），茯 苓 酸 對(duì) 照 品（ 批 號(hào) 為wkq210517054），白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對(duì)照品（批號(hào)為wkq21050705），均購自四川維克奇生物科技有限公司，含量大于98%；β- 谷甾醇對(duì)照品（批號(hào)為0851 - 9601），紫丁香苷對(duì)照品（批號(hào)為111574 - 200603），均購自中國食品藥品檢定研究院，含量大于98%；乙腈（批號(hào)為21101121G118），甲酸（批號(hào)為C12851411），甲醇（批號(hào)為C15443672），均為質(zhì)譜純，購自上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 色譜與質(zhì)譜條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH Shlield RP18柱（100 mm × 2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液（A）- 乙腈（B），梯度洗脫（1～30 min 時(shí)95%A →5%A，5%B →95%B）；流速：0.3 mL/ min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：2μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源：可加熱式電噴霧離子源（HESI）；檢測方式：正負(fù)離子切換模式；噴霧電壓：3 500 V（正離子模式），3 200 V（負(fù)離子模式）；輔助氣加熱溫度：320 ℃；離子傳輸管溫度：320 ℃；鞘氣體積流速：35 arb；輔助氣體積流速：15 arb；掃描模式：一級(jí)質(zhì)譜［全掃描，質(zhì)荷比（m/z）100～1 500，質(zhì)量分辨率為70 000］，動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)依賴性掃描（二級(jí)質(zhì)譜）。

1.3 中藥復(fù)方浸膏制備

取黨參、五爪金龍、白術(shù)、制仙茅、法半夏、茯苓、杜衡、山海螺、菝葜、浙貝母、薏苡仁、陳皮、青皮等藥材各適量，分別粉碎成粗粉，置圓底燒瓶中，加蒸餾水（浸過藥面5 cm）浸泡30 min，煎煮2 次，第1 次煮沸后再用文火煎煮30 min，第2 次煮沸后再用文火煎煮25 min，合并藥液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至浸膏，待用。

1.4 溶液制備

取中藥復(fù)方浸膏1 g，置25 mL 容量瓶中，加適量80%乙醇使溶解，超聲助溶，0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得中藥復(fù)方供試品溶液。分別取松脂醇二葡萄糖苷、蘆丁、齊墩果酸、綠原酸、辛弗林、貝母素乙、茯苓酸、黨參炔苷、蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、β-谷甾醇、阿魏酸、紫丁香苷對(duì)照品各1 mg，精密稱定，分別置5 mL容量瓶中，加50%甲醇使溶解，配制成質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL 的單一對(duì)照品貯備液；精密量取1 mL，加50%甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為25μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

1.5 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

成分靶點(diǎn)收集：將篩選出的化學(xué)成分的英文名稱輸入中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）進(jìn)行檢索，以口服生物利用度（OB）≥20%、類藥性（DL）≥0.1 為篩選條件，其中TCMSP 數(shù)據(jù)庫中未找到的化學(xué)成分，借助Swiss ADME 平臺(tái)（http：//www.swissadme.ch/）進(jìn)行篩選，以胃腸道吸收（GI absorption）的得分為“high”，DL至少通過2 個(gè)“Yes”進(jìn)行篩選。篩選得到的活性成分逐個(gè)輸 入Chemical Book 數(shù) 據(jù) 庫（https：// www.chemical?book.com/ ProductIndex.aspx）或PubChem 數(shù) 據(jù) 庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），記錄化合物的SMILES 號(hào)或下載化合物的結(jié)構(gòu)，保存為.sdf 文件。在Swiss TargetPrediction 數(shù)據(jù)庫（http：// www.swisstarget?prediction.ch/）中輸入化合物的SMILES 號(hào)或打開.sdf文件，以“Homo sapiens”為限定條件預(yù)測成分的作用靶點(diǎn)，并使用PharmMapper 數(shù)據(jù)庫（http：// www.lilab -ecust.cn/pharmmapper/）補(bǔ)充成分靶點(diǎn)。

疾病靶點(diǎn)收集：以“Colon Cancer”為關(guān)鍵詞，分別在DisGeNET 數(shù)據(jù)庫（https：// www.disgenet.org/）、Gene?Cards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org）、OMIM 數(shù)據(jù)庫（https：// omim.org/）中收集結(jié)腸癌的疾病靶點(diǎn)，刪除重復(fù)靶點(diǎn)，保留與結(jié)腸癌相關(guān)的靶點(diǎn)。

關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選：將成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)合并篩選，保留共有靶點(diǎn)，即為FZKAⅡ方干預(yù)結(jié)腸癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

活性成分- 關(guān)鍵靶點(diǎn)- 通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：將關(guān)鍵靶點(diǎn)輸入String 11.5 數(shù)據(jù)庫（https：//cn.string-db.org），以“Homosapiens”為篩選條件，構(gòu)建蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)，設(shè)定閾值“highestconfidence”> 0.9，其余條件均為默認(rèn)。使用Cytoscape 3.9.1 軟件構(gòu)建活性成分- 關(guān)鍵靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)。

GO富集分析和KEGG通路富集分析：使用Ensembl數(shù)據(jù)庫（http：// grch37.ensembl.org/ index.html）將Gene name 轉(zhuǎn)換為Ensembl ID，使用基迪奧生物信息云平臺(tái)（Omicshare，https：//www.omicshare.com/）將關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體論GO 富集分析和KEGG 通路富集分析，前者包括GO 生物過程分析（GO Biological Pro?cesses）、GO 分子功能分析（GO Molecular Functions）、GO 細(xì)胞組分分析（GO Cellular Components），分析條件均為默認(rèn)參數(shù)，并對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.6 分子對(duì)接

為進(jìn)一步分析FZKAⅡ方成分與靶點(diǎn)結(jié)合的強(qiáng)度，使用AutoDock Vina v4.2.6 軟件對(duì)FZKAⅡ方的成分和靶點(diǎn)分別進(jìn)行分子對(duì)接，以受體和配體的結(jié)合能小于- 7 kcal/ mol 為結(jié)合作用較好，結(jié)合能數(shù)值越低，產(chǎn)生相互作用所需的能量就越低［4］。在PubChem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.Gov）中下載化合物的結(jié)構(gòu)，PDB 數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/）中下載靶點(diǎn)的三維（3D）結(jié)構(gòu)；使用Discovery Studio 4.5 Client 刪除蛋白質(zhì)靶點(diǎn)的水分子、配體、離子等，保存為.pdb文件；使用AutoDock Vina v4.2.6 軟件對(duì)化合物和靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)接，在蛋白質(zhì)分子上設(shè)置中心，并設(shè)置X，Y，Z的參數(shù)（設(shè)置為126）以確保蛋白質(zhì)被完全覆蓋，為尋找配體分子的最低能量構(gòu)象以模仿自然體系中的分子穩(wěn)定構(gòu)象，進(jìn)行能量優(yōu)化，優(yōu)化次數(shù)設(shè)置為100［5］，并進(jìn)行柔性對(duì)接；使用PyMOL 2.4.1 軟件對(duì)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 FZKAⅡ方化學(xué)成分分析

UHPLC - Q - Orbitrap MS/MS 正負(fù)離子切換模式下檢測，得到FZKAⅡ方水提液質(zhì)譜總離子流圖（圖1）；通過自建的數(shù)據(jù)庫、對(duì)照品的裂解規(guī)律、特征碎片離子、Compound Discover 3.2軟件的分析、文獻(xiàn)［6-20］對(duì)化學(xué)成分進(jìn)行鑒定，共鑒定出128 個(gè)成分，其中黃酮類35 個(gè)，萜類17 個(gè)，苯丙素類17 個(gè)，木脂素類6 個(gè)，酚類9 個(gè)，生物堿14 個(gè)，有機(jī)酸11 個(gè)，氨基酸6 個(gè)，揮發(fā)油1 個(gè)，炔類3 個(gè)，甾體類1 個(gè)，其他8 個(gè)。結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果，與關(guān)鍵靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)的29個(gè)成分見表1。

表1 FZKAⅡ方水提液中化學(xué)成分鑒別結(jié)果Tab.1 Identification results of chemical components in FZKA Ⅱwater extract

A.負(fù)離子模式 B.正離子模式圖1 FZKAⅡ方水提液質(zhì)譜總離子流圖A.Negative ion mode B.Positive ion modeFig.1 TIC chromatogram of FZKAⅡwater extract

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)確定：使用Swiss TargetPredic?tion 數(shù)據(jù)庫及PharmMapper 數(shù)據(jù)庫對(duì)128 個(gè)化學(xué)成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，剔除未預(yù)測到靶點(diǎn)的29個(gè)化學(xué)成分；其余99個(gè)成分共收集到成分靶點(diǎn)271個(gè)，去除重復(fù)靶點(diǎn)143個(gè)，最終得到128 個(gè)成分靶點(diǎn)。使用DisGeNET 數(shù)據(jù)庫、GeneCard數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫共收集到疾病靶點(diǎn)933個(gè)，去除重復(fù)靶點(diǎn)138個(gè)，最終得到疾病靶點(diǎn)795個(gè)。

關(guān)鍵靶點(diǎn)確定：取128 個(gè)成分靶點(diǎn)和795 個(gè)疾病靶點(diǎn)相互映射，通過繪制維恩圖，獲得FZKAⅡ方干預(yù)結(jié)腸癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)33個(gè)。詳見圖2。

圖2 FZKAⅡ方治療結(jié)腸癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)維恩圖Fig.2 Venn diagram of the key targets of FZKA Ⅱin the treatment of colon cancer

PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：利用Cytoscape 3.9.1 平臺(tái)對(duì)String 11.5 數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果進(jìn)行可視化，連線越緊密、顏色越深說明靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中越重要，排名前10 的靶點(diǎn)分別為絲氨酸/ 蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、雌激素受體1（ESR1）、SRC 表皮生長因子受體（EGFR）、前列腺素內(nèi)過氧化物酶2（PTGS2）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、基質(zhì)金屬蛋白酶- 2（MMP - 2）、激酶插入域受體（KDR）、胰島素樣生長因子受體1R（IGF1R）、CCNB1，提示上述靶點(diǎn)可能是FZKAⅡ方治療結(jié)腸癌的核心靶點(diǎn)，見圖3。

圖3 FZKAⅡ方治療結(jié)腸癌關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI network of key targets of FZKA Ⅱin the treatment of colon cancer

關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO 富集分析和KEGG 通路富集分析：使用Omicshare 平臺(tái)對(duì)33個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析與KEGG 通路富集分析，并對(duì)前20 條富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化。由圖4A可知，生物過程主要涉及生物質(zhì)量的調(diào)節(jié)（GO：0065008）、壓力反應(yīng)的調(diào)節(jié)（GO：0080134）、對(duì)程序性細(xì)胞死亡的調(diào)節(jié)（GO：0043067）等；分子功能主要涉及離子結(jié)合（GO：0043167）、催化活性（GO：0003824）、小分子結(jié)合（GO：0036094）等；由圖4B 可知，細(xì)胞組成主要涉及質(zhì)膜區(qū)、質(zhì)膜部分、膜部件等；由圖4C可知，F(xiàn)ZKAⅡ方治療結(jié)腸癌的通路主要有癌癥通路、人類巨細(xì)胞病毒感染、癌癥中的MicroRNAs、癌癥中的蛋白聚糖、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）信號(hào)通路等。

A.生物過程與分子功能 B.細(xì)胞組成 C.KEGG通路富集分析圖4 FZKAⅡ方治療結(jié)腸癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO富集分析與KEGG通路富集分析A.Biological processes and molecular functions B.Cell composition C.KEGG pathway enrichment analysisFig.4 GO enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis of key targets of FZKAⅡin the treatment of colon cancer

活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：將PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出的關(guān)鍵靶點(diǎn)與成分靶點(diǎn)相關(guān)聯(lián)，剔除與關(guān)鍵靶點(diǎn)無相互作用的成分，最終得到22 個(gè)活性成分與33個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)相關(guān)，選擇前20個(gè)成分并結(jié)合前20條通路，構(gòu)建活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)（圖5）。結(jié)果顯示，癌癥通路富集8 個(gè)靶點(diǎn)，癌癥中的MicroRNAs 富集6 個(gè)靶點(diǎn)，癌癥中的蛋白聚糖富集5 個(gè)靶點(diǎn)；其中，與成分、通路關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)的前5 個(gè)靶點(diǎn)為糖原合酶激酶3B（GSK3B）、SRC、MMP-9、蛋白酪氨酸激酶2（PTK2）、細(xì)胞色素P4501B1（CYP1B1）。

圖5 FZKAⅡ方治療結(jié)腸癌的活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)Fig.5 Active ingredients - key targets - pathway network of FZKAⅡin the treatment of colon cancer

2.3 分子對(duì)接結(jié)果

槲皮素、芹菜素、木犀草素、山柰酚、染料木素和關(guān)鍵靶點(diǎn)的關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)，故選取以上5 個(gè)核心成分分別與關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)接。由圖6可知，結(jié)合能小于-7 kcal/mol的有20 種（83.33%），位于-7～-5 kcal/mol 的有4 種（16.67%）。小于-5 kcal/mol的表示結(jié)合活性良好［21］，占100%。選取結(jié)合活性強(qiáng)的成分和靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化，結(jié)果顯示，F(xiàn)ZKAⅡ方的活性成分治療結(jié)腸癌具有較好的活性。詳見圖7。

注：黃色“0”表示未對(duì)接。圖6 FZKAⅡ方治療結(jié)腸癌的核心成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)果Note：Yellow "0" refers to no molecular docking.Fig.6 Molecular docking results pf key components and targets of FZKAⅡin the treatment of colon cancer

A.槲皮素和糖原合酶激酶3B（GSK3B）對(duì)接 B.芹菜素和PTGS2 對(duì)接 C.木犀草素和MMP - 9 對(duì)接 D.山柰酚和多藥耐藥性蛋白1（ABCB1）對(duì)接 E.染料木素和雌激素受體2（ESR2）對(duì)接注：綠色為化合物，熒光藍(lán)為氨基酸殘基，黃色虛線為氫鍵。圖7 FZKAⅡ方治療結(jié)腸癌的核心成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)果的可視化A.Molecular docking of quercetin and GSK3B B.Molecular docking of apigenin and PTGS2 C.Molecular docking of luteolin and MMP - 9 D.Molecular docking of kaempferol and ABCB1 E.Molecular docking of genistein and ESR2Note：Green refers to chemical components，fluorescent blue refers to amino acid residues，and yellow dashed lines refer to hydrogen bonds.Fig.7 Visualization of the molecular docking results between the key components and targets of FZKAⅡin the treatment of colon cancer

3 討論

FZKAⅡ方中，黨參、五爪金龍、白術(shù)、制仙茅共為君藥，健脾益氣，溫腎壯陽，共同補(bǔ)益先后天之本，扶助正氣；茯苓、薏苡仁、法半夏、浙貝母、杜衡、山海螺和菝葜共為臣藥，利濕導(dǎo)滯，清利腸中濕熱，消痞散結(jié)；陳皮、青皮共為佐藥，理氣破氣，補(bǔ)而不滯，抗邪與扶正兼顧。

本研究中通過高分辨質(zhì)譜技術(shù)分析FZKAⅡ方的成分，共鑒定出化學(xué)成分128 個(gè)，其中黃酮類占比最大（27.34%），表明黃酮可能是FZKAⅡ方的主要活性成分。另有文獻(xiàn)報(bào)道，類黃酮的攝入可能通過抗過氧化、抗氧化和抗炎作用而降低結(jié)直腸癌的發(fā)病率和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)；黃酮類化合物還可調(diào)節(jié)線粒體功能，平衡細(xì)菌菌群，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，通過干擾多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，抑制癌細(xì)胞的增殖、血管生成及癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，促進(jìn)其凋亡等［22-23］。此外，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)128個(gè)化學(xué)成分預(yù)測的靶點(diǎn)與結(jié)腸癌疾病靶點(diǎn)繪制維恩圖得到33個(gè)共同靶點(diǎn)，即為FZKAⅡ方治療結(jié)腸癌可能的關(guān)鍵靶點(diǎn)。通過與成分、通路相關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)槲皮素、芹菜素、木犀草素、山柰酚、染料木素和關(guān)鍵靶點(diǎn)的關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)，上述成分均來源于五爪金龍，表明五爪金龍可能是治療結(jié)腸癌的核心藥材，與方劑組方特點(diǎn)一致。據(jù)報(bào)道，食用富含槲皮素的洋蔥可降低胃癌、結(jié)腸癌、直腸癌的患病風(fēng)險(xiǎn)，尤與結(jié)腸癌的發(fā)病率呈正相關(guān)［24］。山柰酚在多種類型的癌細(xì)胞中發(fā)揮細(xì)胞毒作用，可誘導(dǎo)SW480 人結(jié)腸腺癌細(xì)胞凋亡，具有潛在的抗癌作用［25-28］。終生攝入染料木素可降低由偶氮甲烷誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸癌病變的發(fā)生率和頻率［29］。以上研究結(jié)果均表明，槲皮素、芹菜素、木犀草素、山柰酚和染料木素等可能是FZKAⅡ方治療結(jié)腸癌的主要活性成分，為FZKAⅡ方治療結(jié)腸癌的作用物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了方向。

GSK3B，SRC，CYP1B1，MMP - 9，PTK2 與成分、通路關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)，表明其可能是FZKAⅡ方干預(yù)結(jié)腸癌的核心靶點(diǎn)。有研究表明，抑制GSK3B 的表達(dá)可進(jìn)一步抑制腫瘤生長，同時(shí)還可誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡［30-31］。SRC基因編碼一種與癌癥相關(guān)的非受體酪氨酸激酶SRC 家庭激酶（SFK），SFK 在腫瘤的發(fā)展過程中通過影響肌動(dòng)蛋白、Ras/ 細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶/ 絲裂原活化蛋白激酶（Ras/ERK/MAPK）途徑，以及EGFR 和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）受體等在細(xì)胞黏附、侵襲、增殖、存活和血管生成中起關(guān)鍵作用［32］。MMP-9參與了蛋白激酶C通路的激活，其過表達(dá)與乳腺癌和結(jié)腸癌患者的生存率下降和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移直接相關(guān)［33-34］。與正常組織相比，CYP1B1 mRNA 分別在65%和60%的膀胱和結(jié)腸腫瘤中存在過表達(dá)現(xiàn)象，且在不同來源的人類結(jié)腸癌中檢測到CYP1B1 mRNA 的差異過表達(dá)，故CYP1B1 被認(rèn)為是潛在的腫瘤標(biāo)志物和癌癥治療的確切靶點(diǎn)［35-39］。槲皮素與CYP1B1 和GSK3B 等同時(shí)靶向，且有報(bào)道指出，槲皮素的抗癌作用可能是通過其與多種受體的結(jié)合，尤其是與芳香烴受體（AhR）的結(jié)合。AhR 是一種配體門控轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控CYP 1家族的表達(dá)，CYP1B1作為CYP1的亞型，其過表達(dá)導(dǎo)致CYP1激活［35］，故推測槲皮素可能是干預(yù)結(jié)腸癌的主要因素之一。以上結(jié)果均表明，GSK3B，SRC，CYP1B1，MMP - 9 可能是FZKAⅡ方治療結(jié)腸癌的重要靶點(diǎn)。

GO 富集分析和KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示，F(xiàn)ZKAⅡ方治療結(jié)腸癌與癌細(xì)胞中的MicroRNAs、蛋白聚糖、人類巨細(xì)胞病毒感染等相關(guān)。在惡性腫瘤中，蛋白聚糖可調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的表型、耐藥性及腫瘤間質(zhì)中血管的生成，腫瘤間質(zhì)的廣泛重塑與蛋白聚糖表達(dá)和其結(jié)構(gòu)變異顯著相關(guān)［40］。蛋白聚糖在結(jié)腸癌中過度表達(dá)和分泌，通過與巨噬細(xì)胞表面的Toll樣受體2（TLR2）和Toll樣受體4（TLR4）結(jié)合而激活TLR2/4 信號(hào)通路，釋放炎性因子白細(xì)胞介素1R（IL-1R）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLRP3）［41-42］；TLR2/TLR4 信號(hào)傳導(dǎo)的啟動(dòng)促進(jìn)了癌細(xì)胞的生長，下調(diào)了細(xì)胞凋亡，上調(diào)了腫瘤和基質(zhì)細(xì)胞對(duì)生長因子和炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的合成［43-45］，表明蛋白聚糖活性具有促癌作用。有研究發(fā)現(xiàn)，人類巨細(xì)胞病毒感染與結(jié)腸癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)［46］，結(jié)腸癌細(xì)胞系感染人類巨細(xì)胞病毒后表型顯著改變，與結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和遷移相關(guān)的Wnt 信號(hào)通路在感染人類巨細(xì)胞病毒的細(xì)胞中顯著上調(diào)［47］。MicroRNAs 在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、血管生成、轉(zhuǎn)移及化學(xué)藥物治療耐藥中顯著相關(guān)，MicroRNAs 譜的改變與結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)化和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移有關(guān)［48］。以上結(jié)果均表明，F(xiàn)ZKAⅡ方可能通過癌癥通路，癌癥中的MicroRNAs、蛋白聚糖，人類巨細(xì)胞病毒感染等信號(hào)通路發(fā)揮治療結(jié)腸癌的作用。

綜上所述，本研究中采用UHPLC - Q - Orbitrap MS/MS法鑒定出FZKAⅡ方中128個(gè)化學(xué)成分，其中以黃酮類成分最多，提示黃酮類成分可能是FZKAⅡ方治療結(jié)腸癌的主要作用物質(zhì)基礎(chǔ)；采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)128個(gè)化學(xué)成分進(jìn)行分析，得到GSK3B，SRC，CYP1B1，MMP-9，PTK2 5 個(gè)核心靶點(diǎn)，其可能通過癌癥通路、癌癥中MicroRNAs、癌癥中的蛋白聚糖或人類巨細(xì)胞病毒感染等信號(hào)通路發(fā)揮治療結(jié)腸癌的作用，但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步驗(yàn)證。