超高效液相色譜-串聯質譜法同時檢測毛發中3種新精神活性物質

祁觀,仇文璞,白登文,柴一麟,楊淑頤,楊麗

(四川省毒品監測技術中心(國家毒品實驗室四川分中心),四川 成都 610000)

合成大麻素是新型精神活性物質(New Psychoactive Substances,NPS)中濫用最嚴重、更新迭代最快的一類毒品,其種類占已知新精神活性物質的31.2%[1]。

與傳統毒品四氫大麻酚(Δ9-tetrahydrocannabinol,Δ9-THC)相類似,合成大麻素進入人體后與CB1和CB2受體結合,入體后能夠模擬△9-THC發揮作用且效力更顯著,致幻性更強,有更好的成癮性效果[2-5]。因為其隱蔽、低廉且難以被檢測,常被用作傳統毒品的替代品進行吸食,并且常被不法分子通過互聯網渠道銷售,常見形態有電子煙油、草藥、香料等[6-7]。與此同時,近年來濫用合成大麻素的人數激加,導致急性中毒或死亡的案件越來越多,對人口的健康和公共安全構成嚴重威脅。合成大麻素是我國第一批受到管制的新型精神活性物質[8-9],對合成大麻素類新精神活性物質的進一步監測和精細化管理迫在眉睫。

近年來,國內外出現采用GC-MS、LC-MS/MS、UPLC-HR-MS對尿液、血液、體外肝微粒體中合成大麻素類物質經過液相萃取、固相萃取等方法處理后進行檢測的報道[10-14],也有采用GC-MS、GC-MS/MS、LC/MS/MS對毛發檢測的報道[15-18],但涵蓋物質種類有限,難以滿足實際案件檢驗鑒定需求。本文建立了一種靈敏、準確、高效的毛發中合成大麻素的檢測方法,對肅清毒情隱患、服務禁毒大局具有重要意義。

由于合成大麻素在人體內廣泛代謝,尿液、血液和唾液中幾乎沒有原型,因而針對毒品原型的檢測方法極易導致該類毒品無法被檢出,造成假陰性的結果[19]。毛發作為一種特殊的載體,在吸毒檢驗方面與尿液、血液、唾液等相比有不可比擬的優勢:它檢測窗口長,易收集和保存,無損傷性,不易摻假,靈敏度高,可長時間保留吸毒信息,同時,可以反映吸毒的時間范圍、吸毒的程度和吸毒的變化,可以提供吸毒者長期用藥情況,且可以避免暫時性藥物切斷或摻假毛的干擾。

毒品及其代謝物在毛發檢材中的分布具有特殊性,人類頭發是由角質層衍生而來的獨特基質,其主要成分是角蛋白,按照血液中的毒品及其代謝物通過擴散進入毛囊的機制,血液中的毒品及其代謝物進入毛發中的能力是不同的。毒品及其代謝物進入毛發是在毛發形成期間,并且可以隨著毛發生長進入發干[20]一般脂溶性強(極性小)的組分進入毛發的能力強,因此,毛發中的毒品及其代謝物的分布與血液、尿液中的分布不同,毛發中的毒品多以母體形式存在,代謝物的含量相對較低[21],正是由于毛發檢材的獨特優勢,使毛發檢測成為對合成大麻素類新精神活性物質監測最理想的檢測手段[22]。

筆者所在實驗室近1年來接收合成大麻素類相關案件數百例,其中最常見的為N-(1-氨甲酰基-2,2-二甲基丙基)-1-丁基吲唑-3-甲酰胺(ADB-BUTINACA)、1-戊基吲哚-3-甲酸-8-喹啉酯(PB-22)、N-(1-氨基-3,3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基)-1-(4-戊烯-1-基)-1H-吲唑-3-甲酰胺(ADB-4en-PINACA)3種合成大麻素類新精神活性物質。基于實際案件需要,設計本實驗。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

ACQUITY UPLC I-Class TQ-XS 超高效液相色譜-串聯質譜儀(美國 Waters 公司);Milli-Q Advantage 超純水系統;YETO Vortex-2旋渦混合器;SCINTZ SB-5200D超聲波清洗器。

標準品:ADB-BUTINACA,ADB-4en-PINACA,PB-22(國家毒品實驗室);甲醇(色譜純,Thermo Fisher Scientific);乙腈(色譜純,Thermo Fisher Scientific);甲酸(色譜純,Thermo Fisher Scientific);超純水;空白毛發樣品采集自10名無吸毒史的健康志愿者(男女性各5名,平均年齡26歲),用于制備校正曲線和質量控制(Quality Control,QC)樣品。ADB-BUTINACA毛發實際樣品(案件中繳獲)。

1.2 色譜-質譜條件

1.2.1 色譜條件

選用ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm ×100 mm,1.7 μm);A相(0.1%甲酸-水緩沖液);B相(0.1%甲酸-乙腈);流速0.4 mL/min;柱溫40 ℃;洗脫梯度見表1。

表1 色譜洗脫梯度

1.2.2 質譜條件

離子化源模式:ESI+;霧化溫度:450 ℃;掃描方式:多反應監測方式(MRM);毛細管電壓:3.00 kV;脫溶劑氣流量:800 L/h;碰撞氣流量:0.15 mL/min;錐孔電壓:20 V。各化合物參數見表2。

表2 3種化合物的質譜參數T

1.3 標準工作溶液與質控樣的制備

3種NPS標準品均取適量溶于甲醇中,配制成質量濃度為10 μg/mL 的一級儲備液,儲存于冰箱(-20 ℃)中備用。取3種NPS的儲備液各適量,用甲醇稀釋成各組分質量濃度均為200 ng/mL的二級儲備液。取二級儲備液適量,加入等體積的A相緩沖液,配置成各NPS組分質量濃度均為100 ng/mL的標準使用液。取等體積的A相緩沖液與甲醇配置成稀釋液,以100 ng/mL標準使用液為第一級使用稀釋液逐級稀釋,配置成0.2～40 ng/mL的系列標準溶液備用。

1.4 樣品前處理

取頭發置于蒸發皿中,用含0.1%十二烷基磺酸鈉水溶液、去離子水、甲醇依次清洗,將蒸發皿中頭發置于通風櫥晾干,最后一次清洗液留存分析。稱取頭發20 mg裝入破碎管,加入1 mL提取液(甲醇)。將破碎管放入研磨儀冷凍研磨5 min后,加入1 mL 0.1%甲酸水溶液,混勻,冰浴超聲30 min后提取,經0.22 μm有機膜過濾后分析。

采用相同步驟做空白毛發試驗。

2 定性實驗方案及結果確認

2.1 選擇性

2.1.1 目的

測試不同毛發基質和各種常見毒品是否會對ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22的定性分析造成干擾。

2.1.2 實驗方案

選取3種不同來源的空白毛發分別測定后按定性評價標準進行判定,確認不同空白基質是否導致假陽性情況。

將ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22標準工作溶液加入空白毛發中,經前處理后得到ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22質量濃度為20 ng/mL的溶液,分別測定后按定性評價標準進行判定,確認各物質是否會對除本身外其他2種目標物的分析導致假陽性情況。

2.1.3 實驗結果

選擇性實驗結果見表3。

表3 選擇性實驗結果

由表3可知:空白毛發基質不會對ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22等3種目標物的定性分析造成干擾;ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22等3種目標物均不會對毛發中除本身以外的其他目標物的定性分析造成干擾。

2.2 檢出限

2.2.1 目的

測試毛發中ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22能被準確定性的最低濃度。

2.2.2 實驗方案

將ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22標準工作溶液加入空白毛發中,經前處理后得到ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22的5個不同質量濃度的溶液,分別為0.01,0.02,0.05,0.1和0.2 ng/mL,每個濃度重復測定10次,按定性評價標準進行判定,確認各濃度的陽性檢出率,以陽性率100%的最低濃度作為定性檢出限。

2.2.3 實驗結果

檢出限實驗結果見表4。

表4 檢出限實驗結果

由表4可知:ADB-BUTINACA最低檢出限為:0.1 ng/mL,ADB-4en-PINACA最低檢出限為:0.2 ng/mL,PB-22最低檢出限為:0.05 ng/mL。

2.3 穩健度

2.3.1 目的

測試實驗中合理變化因素對定性結果的影響。

2.3.2 實驗方案

將ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22標準工作溶液加入空白毛發中,經前處理后得到PB-22質量濃度為0.05 ng/mL的溶液1 份,ADB-BUTINACA質量濃度為0.1 ng/mL的溶液1 份,ADB-4en-PINACA質量濃度為0.2 ng/mL的溶液1份提取液放置24 h后再進行測定。

2.3.3 實驗結果

穩健度實驗結果見表5。

表5 穩健度實驗結果

由表5可知:樣品提取溶劑放置24 h對定性結果不會造成影響。

3 定量實驗方案及結果確認

3.1 定量限和線性范圍

3.1.1 目的

測試毛發中ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22能被確定量的最低濃度,以及ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22的色譜峰面積與濃度呈線性關系的濃度范圍。

3.1.2 實驗方案

將ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22標準工作溶液加入空白毛發中,經前處理后得到含ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22的8個校準標準濃度點溶液,分別為0.2,0.5,1.0,2.0,5.0,10,20,40 ng/mL,每個校準標準濃度點重復測定10次,計算各濃度點的相對標準偏差RSD,確定RSD小于15%的最低濃度。以所有RSD小于15%的濃度為橫坐標、各濃度點測得的面積為縱坐標繪制標準曲線,標準曲線采用線性回歸,權重1/X。如果線性回歸相關系數r大于0.998,且所有濃度擬合相對誤差小于15%,則參與擬合的最低濃度為定量限,最低濃度至最高濃度為線性范圍。如果線性回歸相關系數小于0.998,或存在某個濃度擬合相對誤差大于10%或在最低定量限附近RSD大于15%,則應舍去最低濃度,重新進行線性回歸直至符合要求為止。

3.1.3 實驗結果

各濃度點測定結果精密度分析結果見表6,線性范圍分析結果見表7。

表6 各濃度點測定結果精密度分析

表7 線性范圍分析

由表6、7可知,ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22最低定量限均為:0.2 ng/mL,在 0.2～40 ng/mL范圍內具有良好的線性關系,R2均大于0.998。

3.2 準確度

3.2.1 目的

測試毛發中ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22的定量結果是否存在偏倚。

3.2.2 實驗方案

將ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22標準工作溶液加入空白毛發中,經前處理后得到ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22質量濃度為0.2,6,50 ng/mL的溶液,每個濃度點平行測定10次。準確度為測定平均值與參照值的百分比,其值應在90%～110%范圍內,在最低定量限附近可在85%～115%范圍內。

3.2.3 實驗結果

準確度實驗結果見表8。

表8 準確度實驗結果

由表8可知:ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22各濃度點準確度均滿足要求。

3.3 重復性

3.3.1 目的

測試毛發中ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22在重復性測量條件下測定結果的精密度。

3.3.2 實驗方案

將ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22標準工作溶液加入空白毛發中,經前處理后得到ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22質量濃度為0.2,6,40 ng/mL的溶液。由同一實驗人員使用同一儀器對樣品平行測定10次,計算10次測定結果的相對標準偏差RSD。相對標準偏差RSD應小于10%,在最低定量限附近RSD可小于15%。

3.3.3 實驗結果

重復性實驗結果見表9。

表9 重復性實驗結果

由表9可知:ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22各濃度點重復性均滿足要求。

3.4 提取回收率

3.4.1 目的

測試毛發中ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22測定結果的提取回收率。

3.4.2 實驗方案

將ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22標準工作溶液加入空白毛發中,經前處理后得到質量濃度為0.2和40 ng/mL的ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22溶液,每個濃度點6個平行樣本,記錄峰面積,計算6份樣本平均峰面積Aa。分別利用空白毛發提取液配制對應濃度的分析物,每個濃度點6個平行樣本,記錄檢測峰面積,計算6份樣本平均峰面積Ab,提取回收率=Aa/Ab。提取回收率應在85%～115%范圍,在最低定量限附近可在80%～120%范圍。

3.4.3 實驗結果

回收率實驗結果見表10。

表10 回收率實驗結果

由表10可知:ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22回收率在94.63%～100.4%范圍內。

3.5 基質效應

3.5.1 目的

測試毛發中ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22測定結果的基質效應。

3.5.2 實驗方案

分別利用空白毛發提取液配制質量濃度為0.2和40 ng/mL的ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22溶液,每個濃度點6個平行樣本,記錄檢測峰面積,計算6份樣本平均峰面積Ab。配制質量濃度為0.2和40 ng/mL的ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22標準工作溶液,每個濃度點6 個平行樣本,記錄峰面積,計算6份樣本平均峰面積Ac,基質效應=Ab/Ac。基質效應應在50%～150%范圍。

3.5.3 實驗結果

基質效應實驗結果見表11。

表11 基質效應實驗結果

由表11可知:ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22基質效應在93.47%～130.27%范圍內。

4 實驗結論

本實驗定性檢測的選擇性和穩健度,定量檢測的選擇性、準確度、重復性、提取回收率和基質效應等特性參數均達到預期要求。本方法檢出限、定量限、線性范圍如表12所示。

表12 實驗結論

該方法具有快速、靈敏、準確、適用性廣等突出特點,能夠滿足相關合成大麻素在毛發中定性定量分析的要求,可以為相關案件中毛發中的新精神活性物質的檢驗鑒定提供借鑒。對于打擊毒品犯罪、服務和保障人民群眾的人身安全以及維護社會穩定具有重要的意義。

5 實際案例分析

將3份嫌疑人毛發樣品經甲醇提取液破碎溶解后,與0.1%甲酸水溶液按1∶1體積比例,渦旋混勻后超聲10 min,經0.22 μm 濾膜后,上機測試,在該檢材中檢出ADB-BUTINACA成分,樣品與標準品的保留時間相對偏差小于2%,樣品的定性離子和定量離子的相對離子豐度比在標準品相對離子豐度比率±10%范圍內。經定量計算后,三位嫌疑人毛發中ADB-BUTINACA的含量為0.03,0.42,3.01 ng/mg。ADB-BUTINACA 20 ppb標準品和三份毛發案件樣品色譜圖如圖1所示。

圖1 ADB-BUTINACA 20 ppb標準品和三份毛發案件樣品色譜圖