ACTR調控IGF-1R對肝癌細胞生長的影響

劉文鵬 曹經琳 趙鑫 竇劍 馬路園 趙彩彥

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是肝臟最常見的惡性腫瘤,流行病學調查研究顯示,其發病率位于所有腫瘤中的第五位,腫瘤致死性疾病中的第三位,并且具有一定的性別差異,于男性中排名第三位,女性中排名第八位[1,2]。HCC發病隱匿、生長速度快、惡性程度高,常伴有血管侵犯、肝內及肝外轉移、治療后復發等,臨床預后較差,其5年生存率僅為3%～25%,嚴重危害人類的健康[3,4]。甲狀腺激素受體和視黃醛激活因子(activator of thyroid and retinoid receptor,ACTR, also known as SRC-3/AIB1/NCoA3), 其編碼的蛋白是一種類固醇激素受體的轉錄輔激活因子,為細胞核激素受體共激活劑P160家族的成員之一,被定義為原癌基因,通過與核激素受體和其他轉錄因子作用而發揮生物學功能[5,6]。有研究證實,ACTR在大約68%的肝癌中呈高表達,并可以在體內外促進肝細胞癌的進展[7-9]。胰島素樣生長因子及其受體(insulin-like growth factors, IGFs)是能量代謝和生長的關鍵調控因子,現在越來越多的學者也發現,IGFs及其調節的信號轉導網絡在腫瘤的發生發展過程中也發揮了關鍵的作用,可以調控細胞增殖、分化、凋亡、血管生成等過程,成為腫瘤研究的熱點。IGFs受體系統由多種受體組成,其中IGF-1R介導了其大多數的生物學作用[10,11]。現階段的研究仍未完全闡明HCC的發病機制,因此,探究肝癌發生發展的分子機制,發現調控肝癌發生發展過程中的新分子、新機制將為肝癌的診斷和治療提供重要的理論依據和分子靶標,具有重要的科研及臨床意義。本研究采用免疫共沉淀、細胞免疫熒光共定位、Western blot及qRT-PCR、細胞生長測定等方法探究ACTR與IGF-1R二者之間的相互作用,及對肝癌細胞生長的影響和意義。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細胞系HepG2,HEK293T,美國ATCC;兔抗ACTR多克隆抗體、兔抗β-actin多克隆抗體,Santa Cruz Biotechnology;兔抗IGF-1R多克隆抗體、兔抗Myc、Flag多克隆抗體、DAPI,美國Cell Signaling Technology公司; Myc-IGF-1R、Flag-ACTR質粒,SinoBiological公司;質粒提取試劑盒,Promega公司;RNA提取分離試劑盒、miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、熒光定量PCR預混試劑盒,北京天根生化科技有限公司;Cell Counting Kit-8試劑盒,Dojindo公司;Lipofectamine 2000、Lipofectamine RNAiMAX 賽默飛公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與轉染:細胞系常規培養于含10%胎牛血清的DMEM培養液中,37℃,5%二氧化碳。取對數生長期的細胞,按照實驗分組,根據說明書要求配置轉染溶液,應用Lipofectamine 2000 用于質粒轉染,Lipofectamine RNAiMAX 用于siRNAs轉染細胞。

1.2.2 免疫共沉淀:外源性免疫共沉淀,收集轉染后細胞,裂解緩沖液處理30 min(含有50 mmol/L Tris pH 值8.0, 500 mmol/L NaCl, 0.5% Nonidet P-40, 1 mmol/L DTT,蛋白酶抑制劑),超聲碎裂細胞后,加入抗Flag瓊脂糖珠子,置于4℃過夜充分結合,裂解緩沖液洗滌,SDS洗脫,行Western blot檢測。內源性免疫共沉淀,直接收集細胞,用IGF-1R行交聯結合,余步驟同外源性免疫共沉淀。

1.2.3 免疫熒光行ACTR、IGF-1R細胞內共定位:取培養好的細胞,PBS洗滌后4%多聚甲醛固定30 min,PBS洗滌,0.5%Triton-100+1%NGS于冰上裂解并固定10 min,1%NGS+PBS封閉,加一抗并置于4℃孵育2 h,1%NGS洗滌3遍,后續步驟避光操作,加二抗孵育1 h,PBS洗滌3遍,DAPI染色,PBS洗滌3遍,封片,于顯微鏡下觀察。

1.2.4 qRT-PCR檢測細胞中IGF-1R mRNA表達:實驗分為3組:陰性對照組、ACTR敲低組、ACTR敲低并回轉組。利用RNA提取分離試劑盒,根據說明書,提取細胞中總RNA,進行逆轉錄后,再行PCR擴增。反應程序:預變性95℃,15 min。三步法反應94℃,15 s;55℃,30 s;72℃,30 s;進行40個循環,于每個循環的第三步72℃,30 s收集熒光信號。熔解曲線,60℃,5 s收集信號,至95℃,每一步增加0.5℃。結束。引物序列:IGF-1R:正向5’-GAGGAGATGGAGCCTGGCTTC-3’,反向5’-GTGTCTGTCGGGCAGTGGCAG-3’。β-actin:正向5’-ATCACCATTGGCAATGAGCG-3’,反向5’-TTGAAGGTAGTTTCGTGGAT-3’。

1.2.5 CCK8法測定細胞生長:實驗分為4組:陰性對照組,轉染ACTR組,敲低IGF-1R組,敲低IGF-1R+轉染ACTR組。轉染前1 d接種細胞,當細胞融合度達到70%轉染; 48 h后胰蛋白酶消化,加入適量DMEM培養基吹打混勻,配制成單細胞懸液;取10 μl單細胞懸液,應用細胞計數器計數濃度;將細胞稀釋至合適濃度,分別接種于96孔板,每孔3 000個細胞,設置復孔,周圍孔內加入PBS緩沖液作為保護孔;置于37℃,5%的CO2培養箱中常規培養;按照說明書,配制實驗溶液,將CCK-8試劑與DMEM培養基按照1∶9比例配制,吸棄96孔板中培養基,每孔加入100 μl配置好的CCK-8,1 h后于波長450 nm測定樣品OD值;于每日同一時間測定OD值。

1.2.6 Western blot技術檢測蛋白表達量:收集細胞,RIPA裂解細胞,利用煮沸方法制備蛋白樣品,SDS-PAGE電泳,轉膜,牛奶封閉膜上蛋白的非特異性抗原后,加入一抗,4℃孵育過夜,TBST洗膜,再用二抗37℃孵育1 h,TBST洗膜,加化學發光試劑避光顯影。

2 結果

2.1 外源性免疫共沉淀 質粒轉染細胞后,細胞內表達的ACTR與IGF-1R存在相互作用。見圖1、2。

圖1 外源性免疫共沉淀檢測ACTR和IGF-1R之間相互作用

2.2 內源性免疫共沉淀 肝癌HepG2細胞系內ACTR與IGF-1R之間存在相互作用。見圖2。

圖2 內源性免疫共沉淀檢測ACTR和IGF-1R之間相互作用

2.3 細胞免疫熒光檢測 肝癌HepG2細胞系內,ACTR與IGF-1R在細胞內存在共定位。見圖3。

圖3 免疫熒光檢測ACTR和IGF-1R細胞內共定位

2.4 ACTR抑制IGF-1R mRNA表達 qRT-PCR技術檢測IGF-1R mRNA表達水平,敲低ACTR后,IGF-1R mRNA表達水平為(0.54±0.09),較對照組(1.00±0.04)明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05);回轉ACTR后IGF-1R mRNA表達水平可恢復為(1.26±0.10),與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 ACTR對IGF-1R mRNA表達水平的影響

2.5 ACTR抑制IGF-1R蛋白表達 Western blot技術檢測細胞中IGF-1R、ACTR目標蛋白的表達,與對照組相比,敲低ACTR后IGF-1R表達降低,差異有統計學意義(P<0.05),而回轉ACTR后IGF-1R表達可恢復。見圖4。

圖4 ACTR對IGF-1R 蛋白表達水平的影響

2.6 ACTR通過IGF-1R調控肝癌細胞的生長作用 CCK8法測定細胞生長并繪制曲線。與IGF-1R Wild type+Empty Vector組相比,轉染并過表達ACTR組能夠促進肝癌細胞的生長,差異有統計學意義(P<0.05);與IGF-1R Wild type+Empty Vector組相比,敲低IGF-1R可抑制肝癌細胞的生長,差異有統計學意義(P<0.05);與敲低IGF-1R組相比,敲低IGF-1R+轉染ACTR組促生長作用減弱,差異無統計學意義(P>0.05),即敲低IGF-1R后ACTR的促細胞生長作用減弱。見圖5,表2。

表2 ACTR調控IGF-1R對肝癌細胞生長的影響

圖5 ACTR調控IGF-1R對肝癌細胞生長的影響(*P<0.05)

3 討論

肝細胞癌是全世界范圍內病死率居高不下的惡性腫瘤之一,也是我國較常見且高發的惡性腫瘤,嚴重危害著人們的健康,因此如何早期診斷HCC,進行有效的預防和治療具有重大意義[12]。外科手術徹底切除腫瘤病灶是治療肝癌的最有效的手段,但大多數肝癌患者均伴有不同程度的肝纖維化、肝硬化等,發病隱匿,發現時已經處于晚期,僅有15%～30%的患者可以獲得臨床根治性手術切除,但是,即便手術順利切除,其復發率也很高,約為75%[13]。肝臟移植是治療終末期肝病及肝癌的一種有效手段,但受制于有限的肝源,只有極少數的患者可以得到及時救治,具有一定的限制性[14]。放化療、介入治療、分子靶向治療也為肝癌的治療提供了新的思路和方法,但由于肝癌發病隱匿,惡性程度高,復發及轉移率高等因素,嚴重影響了治療的療效及預后生存[15,16]。肝癌的發生是一個復雜的過程,如癌基因的激活、抑癌基因的失活、基因表達的調控、信號轉導通路的改變、細胞代謝方式的轉變等,從而使得癌細胞具備了異常增殖的特性,所以探索肝癌發生發展的分子機制,尋找新的分子靶點,篩選早期診斷及靶向的分子標記物,針對性的各種基因治療及生物治療方法,逐步成為肝癌研究的熱點[17,18]。

ACTR是一種比較明確的癌基因,在許多腫瘤中呈現過表達的狀態,比如乳腺癌、肝癌、胃癌、前列腺癌等,ACTR參與了腫瘤的發生及發展過程,不同的研究者對其詳細的機制進行了深入的研究[19,20]。Liu等[21]研究證實,肝癌中HBx蛋白可以促使ACTR更加穩定,并且二者可以協同作用促進肝癌細胞的增殖和侵襲。下調ACTR的表達可以通過PI3K/Akt信號通路阻斷細胞周期,進而抑制肝癌細胞的增殖。ACTR和細胞內糖代謝密切相關,例如有氧糖酵解途徑的關鍵酶PFKFB4可以使ACTR 857位絲氨酸磷酸化,從而激活其轉錄活性促進乳腺癌的進展。ACTR與腫瘤耐藥相關,研究發現,ACTR可以促進Warburg效應,從而導致索拉菲尼耐藥[22-24]。ACTR作用機制如此復雜,有無其他新的信號通路呢,我們通過研究證實,ACTR可以與IGF-1R發生相互作用,調控IGF-1R的表達。

IGF-1R是定位于細胞膜表面的異四聚體結構跨膜蛋白,由細胞外的2個α亞基和跨膜的2個β亞基所構成,具有酪氨酸激酶活性,當配體與IGF-1R結合時,引起β亞基激酶結構域的活化,導致受體及其底物的絲氨酸磷酸化,激發細胞內的復雜信號網絡轉導[25]。IGF-1R廣泛的存在于生物體內各類細胞中,在多種腫瘤細胞表達上調,例如肝癌、腎細胞癌、卵巢癌等,其可以通過caspase依賴的線粒體通路促進肝癌細胞的凋亡,可通過PI3K/AKT、MAPK/ERK等信號通路調控腫瘤的發生和進展[26,27]。可見抑制IGF-1R的功能可能成為治療腫瘤的一個潛在靶點,現在已有致力于靶向IGF-1R的藥物研究,并且已經在進行早期臨床實驗。本研究發現,下調ACTR可以抑制IGF-1R的表達。ACTR本身可以促進肝癌細胞的增殖,當敲低IGF-1R后,ACTR的促生長作用減弱,說明ACTR是通過IGF-1R發揮作用的。但是其下游通過何種機制調控肝癌的發生發展,仍有待于進一步的研究。

綜上所述,ACTR與IGF-1R之間存在相互的作用,IGF-1R介導了ACTR促進肝癌細胞生長的過程,ACTR/IGF-1R軸在肝癌細胞的生長中發揮了必要的作用,有可能成為治療肝癌的靶點之一,為肝癌的防治提供新的思路。