上調LncRNA FEZF1-AS1通過miR-363-3p/Sphk2信號軸促進宮頸癌細胞的機制

劉俊麗 張竣 賀清波 張秀珍 孫萍 胡曉君

宮頸癌是常見的女性惡性腫瘤[1]。早期篩查使患者發病率和死亡率減少[1]。然而,宮頸癌轉移直接對受影響的患者生存產生負面影響,但其潛在的分子機制仍不清楚,因此探討宮頸癌發病機制具有重要意義。長鏈非編碼RNA (LncRNAs)是一組內源性非編碼轉錄本,長度>200個核苷酸,LncRNA參與了不同的細胞過程[2]。已經證明LncRNA的異常表達與人類疾病相關[3]。研究發現LncRNA FEZF1-AS1在腫瘤增殖及轉移等過程中發揮重要作用,如LncRNA FEZF1-AS1通過miR-34a促進非小細胞肺癌的侵襲[4]。還有文獻報道LncRNA-FEZF1-AS1通過調節PKM2通路促進結直腸癌腫瘤的增殖[5]。提示FEZF1-AS1的異常表達可能是預測癌癥轉移和預后的分子標記。本研究探討LncRNA FEZF1-AS1對Hela細胞增殖、侵襲及上皮間質轉化(EMT)的影響,闡明宮頸癌的致病機制。

1 材料與方法

1.1 材料 選取我院45例宮頸癌組織和35例癌旁正常組織標本,保存在液氮中。宮頸癌Hela細胞和人宮頸上皮細胞H8細胞來自中國科學院上海細胞庫。DMEM培養基、胰蛋白酶為美國Gibco公司產品。MTT檢測試劑盒、GAPDH抗體來自上海碧云天生物科技有限公司。FEZF1-AS1 siRNA、pcDNA-FEZF1-AS1、Sphk2 siRNA等質粒來自北京擎科生物公司,miR-363-3p抑制劑(miR-363-3p inhibitor)、miR-363-3p模擬物(miR-363-3p mimics)來自Genepharma公司。E-cadherin、N-cadherin抗體購自英國Abcam。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養:Hela和H8細胞在含10%FBS的新鮮DMEM培養基中培養,添加100 U/L的青霉素和鏈霉素,放在37℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱中。

1.2.2 細胞轉染:Hela細胞鋪于12孔板,觀察密度約70%時,添加無血清DMEM培養基,取Turbofect轉染試劑、重組質粒進行轉染,細胞培養板放在37℃、5% CO2培養箱中,48 h后收集細胞進行后續實驗。

1.2.3 細胞活力測定:Hela細胞接種至96孔板12 h后用Turbofect進行轉染,48 h后棄培養基,加入100 μl PBS洗滌,加入20 μl濃度為5 mg/ml的 MTT, 4 h后將150 μl DMSO加入每孔細胞,搖動10 min,讀取570 nm處的吸光度。

1.2.4 雙熒光素酶報告基因活性檢測:預測LncRNA FEZF1-AS1及其miR-363-3p的靶基因,擴增全長后,構建LncRNA FEZF1-AS1 wt載體和Sphk2 wt載體,點突變試劑盒將野生型質粒進行點突變,命名為LncRNA FEZF1-AS1 mut和Sphk2 mut。按照Turbofect轉染說明書將LncRNA FEZF1-AS1 wt、LncRNA FEZF1-AS1 mut分別與miR-363-3p mimics、mimics NC,Sphk2 wt、Sphk2 mut分別與miR-199a-5p mimics、mimics NC共轉染至Hela細胞,用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.2.5 細胞侵襲實驗:Transwell上室中加入200 μl稀釋的 Matrigel 基質,靜置12 h。Hela細胞接種于12孔板,并進行轉染,將1×105個(200 μl)重懸的細胞懸液加入上室,下室加入400 μl DMEM培養基,24 h后加入PBS清洗,4%多聚甲醛固定,PBS洗滌,新鮮的0.1%結晶紫染色浸染15 min,觀察細胞侵襲情況。

1.2.6 實時定量PCR:Trizol試劑加入收取的細胞RNA中,Trizol法提取總RNA,測定濃度及純度。逆轉錄試劑盒逆轉錄細胞總RNA為cDNA,進行RT-qPCR,SYBR Green法分析基因表達量。見表1。

表1 引物序列

1.2.7 Western blot:細胞蛋白樣中加入RIPA裂解液裂解30 min,BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度,10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白,再濕轉到PVDF膜上;與5% 脫脂奶粉封閉2 h后分別與特異性一抗孵育過夜,TBST洗3次,加入二抗后孵育1.5 h,蛋白曝光后通過Image J 灰度分析。

2 結果

2.1 下調LncRNA FEZF1-AS1抑制Hela細胞增殖、侵襲及EMT RT-qPCR結果顯示,宮頸癌組織中LncRNA FEZF1-AS1表達(1.89±0.32)高于癌旁正常組織(1.05±0.54);Hela細胞中LncRNA FEZF1-AS1表達(1.89±0.32)高于H8細胞(1.05±0.54)(P<0.01)。LncRNA FEZF1-AS1 siRNA細胞內FEZF1-AS1表達明顯低于siRNA NC組(P<0.01)。FEZF1-AS1 siRNA組細胞活力、侵襲數目、N-cadherin表達低于siRNA NC組(P<0.05),E-cadherin表達高于siRNA NC組(P<0.01)。見圖1,表2。

圖1 下調LncRNA FEZF1-AS1抑制Hela細胞侵襲及EMT;A Transwell檢測Hela細胞侵襲情況(結晶紫染色×200);B Western blot檢測Hela細胞EMT

表2 FEZF1-AS1表達、Hela細胞活力、侵襲數目與EMT相關蛋白表達

2.2 LncRNA FEZF1-AS1與miR-363-3p之間的關系 軟件預測的FEZF1-AS1和miR-363-3p之間的結合位點。與FEZF1-AS1 wt+mimics NC組相比,FEZF1-AS1 wt+miR-363-3p mimics組熒光素酶活性降低(P<0.01);與FEZF1-AS1 mut+mimics NC組相比,FEZF1-AS1 mut+miR-363-3p mimics組熒光素酶活性無明顯化(P>0.05)。見表3,圖2。

圖2 LncRNA FEZF1-AS1與miR-363-3p之間的結合位點預測

表3 雙熒光素酶活性

2.3 下調miR-363-3p促進Hela細胞增殖、侵襲及EMT RT-qPCR結果顯示,宮頸癌組織miR-363-3p表達(0.57±0.26)低于癌旁正常組織(1.13±0.52)(P<0.05);Hela細胞中miR-363-3p表達(0.43±0.38)低于H8細胞(1.09±0.42)(P<0.01)。miR-363-3p inhibitor組細胞內miR-363-3p表達明顯低于inhibitor NC組,差異有統計學意義(P<0.01)。miR-363-3p inhibitor組細胞活力、侵襲數目、N-cadherin表達高于inhibitor NC組(P<0.05),E-cadherin表達低于inhibitor NC組(P<0.01)。見圖3,表4。

圖3 下調miR-363-3p促進Hela細胞侵襲及EMT;A Transwell檢測Hela細胞侵襲情況(結晶紫染色×200);B Western blot檢測Hela細胞EMT

表4 miR-363-3p表達、Hela細胞活力、侵襲數目與EMT相關蛋白表達

2.4 miR-363-3p與Sphk2之間的關系 TargetScan預測的miR-363-3p與Sphk2的結合位點。與 Sphk2 wt+mimics NC組相比,Sphk2 wt+miR-363-3p mimics組熒光素酶活性降低(P<0.01);與Sphk2 mut+mimics NC組相比,Sphk2 mut+miR-363-3p mimics組熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)。見表5,圖4。

圖4 miR-363-3p與Sphk2之間的結合位點預測

表5 雙熒光素酶活性

2.5 上調LncRNA FEZF1-AS1通過miR-363-3p促進Hela細胞增殖、侵襲及EMT 與pcDNA-3.1(+)+mimics NC組相比,pcDNA-FEZF1-AS1+mimics NC組細胞活力、侵襲數目、N-cadherin表達升高(P<0.05),E-cadherin表達下降(P<0.01);pcDNA-3.1(+)+miR-363-3p mimics組細胞活力侵襲數目、N-cadherin表達降低(P<0.01),E-cadherin表達升高(P<0.01)。與pcDNA-3.1(+)+miR-363-3p mimics組相比,pcDNA-FEZF1-AS1+miR-363-3p mimics組細胞活力侵襲數目、N-cadherin表達升高(P<0.01),E-cadherin表達下降(P<0.01)。見表6,圖5。

圖5 上調LncRNA FEZF1-AS1通過miR-363-3p促進Hela細胞增殖、侵襲及EMT;A Transwell檢測Hela細胞侵襲情況(結晶紫染色×200);B Western blot檢測Hela細胞EMT;a pcDNA-3.1(+)+mimics NC組;b pcDNA-FEZF1-AS1+mimics NC組;c pcDNA-3.1(+)+miR-363-3p mimics組;d pcDNA-FEZF1-AS1+miR-363-3p mimics組

表6 Hela細胞活力、侵襲數目與EMT相關蛋白表達

2.6 下調Sphk2對Hela細胞的增殖、侵襲及EMT的影響 RT-qPCR結果顯示,宮頸癌組織中Sphk2表達(1.97±0.33)高于癌旁正常組織(1.04±0.62)(P<0.01);Hela細胞中Sphk2表達(2.03±0.35)高于H8細胞(1.07±0.46)(P<0.01)。Sphk2 siRNA組細胞內Sphk2表達明顯低于siRNA NC組(P<0.01)。Sphk2 siRNA組細胞活力、侵襲數目、N-cadherin表達低于siRNA NC組(P<0.01),E-cadherin表達高于siRNA NC組(P<0.01)。見圖6,表7。

圖6 下調Sphk2抑制Hela細胞侵襲及EMT;A Transwell檢測Hela細胞侵襲情況(結晶紫染色×200);B Western blot檢測Hela細胞EMT

表7 Sphk2表達、Hela細胞活力、侵襲數目與EMT相關蛋白表達

2.7 LncRNA FEZF1-AS1通過miR-363-3p上調Sphk2表達 FEZF1-AS1 siRNA+inhibitor NC組的Sphk2基因及蛋白表達低于siRNA NC+inhibitor NC組,siRNA NC+miR-363-3p inhibitor 組的Sphk2基因及蛋白表達高于siRNA NC+inhibitor NC組,差異有統計學意義(P<0.01)。FEZF1-AS1 siRNA+miR-363-3p inhibitor組Sphk2 基因及蛋白表達低于siRNA NC+miR-363-3p inhibitor組,差異有統計學意義(P<0.01)。見表8,圖7。

圖7 Western blot檢測Sphk2蛋白表達;a siRNA NC+inhibitor NC組;b:FEZF1-AS1 siRNA+inhibitor NC組;c siRNA NC+miR-363-3p inhibitor 組;d FEZF1-AS1 siRNA+miR-363-3p inhibitor組

表8 Sphk2基因與蛋白表達

3 討論

研究表明一些LncRNA的失調已經在各種類型的癌癥中出現,包括宮頸癌[6]。研究發現LncRNA在宮頸癌的發展過程中發揮作用,如LncRNA TUG1促進宮頸癌細胞生長和EMT[7]。上調LncRNA PANDAR可預測宮頸癌預后不良[8]。目前有文獻報道LncRNA FEZF1-AS1參與了如非小細胞肺癌、膀胱癌、胃癌等癌癥的增殖及其轉移過程[9,10]。在宮頸癌Hela細胞中,我們選擇并關注LncRNAFEZF1-AS1,我們首次評估FEZF1-AS1在宮頸癌組織和Hela細胞中的表達。本研究發現FEZF1-AS1在宮頸癌組織中表達增多,此外,RT-qPCR結果顯示Hela細胞中FEZF1-AS1表達也明顯高于H8細胞。提示FEZF1-AS1可作為預測宮頸癌發生及預后不良的指標。

為了強調FEZF1-AS1在宮頸癌Hela細胞中的上調作用,我們通過功能喪失和功能上調實驗進一步探討了FEZF1-AS1在宮頸癌進展中的關鍵作用。結果顯示,siRNA降低FEZF1-AS1表達顯著抑制Hela細胞增殖、侵襲和EMT。而FEZF1-AS1過表達可促進宮頸癌細胞增殖、侵襲和EMT。綜上所述,FEZF1-AS1可能是一種致癌基因,在宮頸癌發展中起促進作用。LncRNA FEZF1-AS1參與了多種腫瘤的發展。因此,在癌癥中有效阻斷這些LncRNA可能是一種新的預防和治療策略。

LncRNA在人類癌癥中的重要性可能與它們通過各種機制影響細胞功能的能力有關。LncRNA的作用機制部分取決于其基因組位置,可能通過miRNA參與癌癥發展過程。我們通過生物信息學軟件預測發現LncRNA FEZF1-AS1與miR-363-3p具有靶向作用。因此,我們推測LncRNA FEZF1-AS1可能調控miR-363-3p參與宮頸癌的進展。miR-363-3p在癌癥中的作用已被廣泛報道[11-13],進一步實驗發現,敲低miR-363-3p促進Hela細胞增殖、侵襲和EMT。本結果與miR-363-3p在其他癌癥中發揮的作用一致,能夠作為抑癌基因調控癌癥發展。另外,發現上調LncRNA FEZF1-AS1通過miR-363-3p促進Hela細胞增殖、侵襲及EMT,也進一步證明了我們的猜想。后續實驗發現miR-363-3p靶向Sphk2,此外,我們驗證了干擾Sphk2表達也能抑制Hela細胞增殖、侵襲和EMT,LncRNA FEZF1-AS1通過miR-363-3p上調Sphk2表達。提示LncRNA FEZF1-AS1/miR-363-3p/Sphk2軸在Hela細胞增殖、侵襲和EMT過程中發揮重要作用。

綜上所述,本研究提供了FEZF1-AS1表達與宮頸癌發展之間的聯系。我們證實上調FEZF1-AS1通過miR-363-3p/Sphk2軸促進Hela細胞增殖、侵襲及EMT,表明FEZF1-AS1可能是一個候選的預后生物標志物和新治療宮頸癌的靶點。