外泌體對骨質疏松癥調控機制及中藥干預作用

牛建明，馮疆鑫，杜志峰

（1.承德醫學院研究生院，河北 承德 067000；2.華北理工大學研究生院，河北 唐山 063210；3.承德醫學院附屬醫院中醫骨傷科，河北 承德 067000）

骨質疏松癥（osteoporosis，OP）是一種常見的代謝性骨骼疾病，以骨量減少、骨脆性增加及骨微結構破壞為主要特征[1]。一項針對我國大陸成人的研究發現，在40 歲以上人群中，男性OP 患病率為5.0%，女性為20.6%；男性椎骨骨折患病率為10.5%，女性為9.7%[2]。隨著人口老齡化問題持續發展，預計我國OP 患者將繼續增加，針對OP 的診斷和治療顯得非常緊迫。近年來，外泌體（exosomes，Exos）受到廣泛關注。最新研究表明[3]，Exos 在包括OP 在內的多種生物過程和疾病發展中起重要作用。Exos 是由細胞分泌的小囊泡，可以作為納米級載體，通過轉運關鍵的蛋白質和遺傳物質（如miRNA，mRNA 和DNA 等）參與骨骼微環境的調節和OP 細胞間通訊，對OP 的診治有重要意義[4]。與傳統抗OP藥物相比，中藥（Chinese herbal medicines，CHM）在防治OP 方面療效顯著且安全性較高，能有效改善患者癥狀，預防并發癥。探討其機制可能與調控OP相關Exos 有關。本文通過闡述Exos 對OP 的調控機制以及CHM 在治療OP 中與Exos 之間的聯系，希望為OP 的治療提供新的思路和方法。

1 Exos 構成及功能

Exos 是一種直徑在30～150 nm 的小囊泡，是細胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）的亞型，區別于微囊泡（ectosomes）和凋亡小體（apoptotic body）[5]。幾乎所有類型的細胞都可以產生并釋放Exos。Exos 廣泛存在于唾液、血漿、尿液、腹水、母乳和羊水等體液中[6]。Exos 最早被認為是細胞代謝產生的“垃圾”，但最近研究發現，其在人體生理和病理發展過程中充當細胞間通訊和物質交換的媒介，可廣泛參與細胞增值與凋亡調控、血管生成、免疫應答、細胞分化、代謝調控等過程[7]。Exos 具有納米球膜型脂質雙分子層結構，內部包裹脂質、蛋白質、DNA、mRNA 和miRNA 等物質[8]。不同Exos 所包含的內容物不同，其內容物可以反映源細胞的狀態，因此可以通過檢測其內容物含量作為診斷疾病的生物標志物[9]。同時，研究表明[10]，Exos 還具有低免疫原性、穩定性強、安全性高、可穿越屏障等獨特優勢，可作為遞送藥物的天然載體。正因為Exos 有上述特征和優勢，越來越多的研究將目光聚集在Exos 對OP 的診治和藥物遞送的潛力中。

2 Exos 對OP 的調控機制

OP 的關鍵發病機制為骨穩態遭到破壞。骨穩態即成骨細胞（osteoblast，OB）介導的骨形成和破骨細胞（osteoclast，OC）介導的骨吸收不斷作用于骨骼以維持身體骨量的平衡[11]。在此過程中，間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）、OB、OC 及其他細胞因子等相互影響、相互調節，共同維持骨穩態[12]。Exos 作為細胞間信息的傳遞者，能促進OP 發病過程中多種相關細胞內生物活性分子的轉移，這在OP的診斷和治療中起關鍵作用[13]。

2.1 Exos 與MSCs MSCs 具有自我更新及多向分化的潛能，可分化為OB、脂肪細胞、軟骨細胞和成纖維細胞等多種細胞類型，在維持骨穩態方面有著重要作用[14]。作為細胞間通訊的信使，Exos 是參與旁分泌的重要介質，用于調節或介導細胞過程。有研究表明[15]，OB 來源Exos（osteoblasts-derived exosomes，OB-Exos）可以通過增強MSCs 中的成骨基因表達來增加成骨分化，建立骨形成的正反饋。骨髓間充質干細胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cell，BMSCs）主要分化為OB 和軟骨細胞。Li Z 等[16]研究表明，M2 巨噬細胞衍生的Exos（M2D-Exos）可以通過miR-690/IRS-1/TAZ 軸促進BMSCs 成骨分化并減少脂肪生成。同樣，Xiong Y 等[17]通過研究M2D-ExosmiRNA 對BMSCs 分化的影響，發現miR-5106 在M2D-Exos 中高度富集，并且可以轉移到BMSCs 中，通過靶向SIK2 和SIK3 基因以誘導體外和體內OB 分化。

由以上研究可知，Exos 可通過不同機制參與調控MSCs 的分化過程并影響其分化結果，進而影響骨穩態的變化，這可能是治療OP 的潛在方法。

2.2 Exos 與OB 骨骼中大約4%～6%的常駐細胞是OB，這對骨骼的生長和維持至關重要。此外，OB 主要負責骨基質的合成、分泌和礦化，在骨穩態的調節中發揮重要作用[18]。Exos 可以通過調節OB 的增殖和活性來影響骨穩態。不同細胞衍生的Exos 可能對OB 產生不同的影響。Qiu M 等[19]通過研究證實BMSCs來源的Exos（BMSCs-Exos）miR-150-3p 可以通過調節成骨因子Runx2、Osterix、ALP 和骨鈣素（osteocalcin）等的表達，進而刺激OB 的增殖和分化。Chen J等[20]發現，在膠原誘導的類風濕性關節炎（RA）小鼠模型中，類風濕性關節炎成纖維細胞樣滑膜細胞衍生的Exos（RA-FLSs-Exos）可以被OB 吞噬，并通過上調miR-486-5p 和靶向Tob1 來激活成骨相關的信號通路以促進成骨分化。除了促進作用，Exos 對OB 活性也存在抑制作用。Li D 等[21]發現OC 來源的Exos（osteoclast-derived exosomes，OC-Exos）miR-214-3p 被轉移到OB 中，以抑制OB 活性并減少骨形成，抑制OC-Exos 中miR-214-3p 的水平可能是治療涉及骨形成減少的骨骼疾病的策略。

2.3 Exos 與OC OC 是來源于單核細胞-巨噬細胞系造血祖細胞的多核細胞，是唯一參與生物體中骨組織破壞和再吸收的細胞類型[22]。OC 可以通過吞噬作用吸收Exos，并受Exos 攜帶的各種內容物的影響。Guo L 等[23]證明乳腺癌細胞來源Exos miR-20a-5p通過靶向SRCIN1 促進OC 的增殖和分化。RANKL是OC 分化所必需的生長因子。最近的體內實驗表明，OB 釋放的含RANKL 的Exos 可以靶向OC 并刺激OC 形成[24]。Xiao F 等[25]通過研究證明，來自周期性機械拉伸（cyclic mechanical stretch，CMS）處理的BMSCs 來源外泌體（CMS-Exos）通過抑制RANKL誘導的nuclear factor kappa-B（NF-κB）信號通路來抑制OC 分化，并在體內HU 小鼠模型中改善了由去應力負荷引起的OP 癥狀。Song H 等[26]發現血管內皮細胞衍生Exos（EC-Exos）可以被骨髓衍生的巨噬細胞（bone marrow-derived macrophages，BMM）內化并改變BMM 的形態。外泌體miRNA 的測序結果顯示miR-155 在EC-Exos 處理的BMM 中高度表達。阻斷BMM miR-155 水平能夠解除EC-Exos 對OC 的抑制，證實Exos miR-155 可能具有抗OP 的治療潛力。

綜上所述，不同細胞來源Exos 可以通過不同機制和信號通路調控MSCs、OB、OC 等細胞的增殖、分化和成熟，從而促進或抑制骨形成和骨吸收，在骨穩態中發揮了重要作用，通過Exos 治療OP 擁有廣闊前景。此外，Exos 內容物可以反映出源細胞及其微環境的狀態[27]，因此可以將Exos 用作OP 診斷和預后的生物標志物。如Zhang Y 等[28]通過研究證明，與對照組相比，OP 組中血漿Exos tRF-25-R9ODMJ6B26（tRF-25），tRF -38 -QB1MK8YUBS68BFD2（tRF-38），tRF-18-BS68BFD2（tRF-18）的表達較高，提示血漿Exos 中tRF-25，tRF-38 和tRF-18 可能作為診斷OP 新的血清學生物標志物。還有研究發現[29]，過度表達miR-424-5p 的Exos 可以通過WIF1/Wnt/β-catenin軸減弱成骨分化，這表明miR-424-5p 可能作為治療OP 的新生物標志物。雖然目前將Exos 用作OP生物標志物的研究技術不完善且研究數量相對缺乏，但Exos 的特征決定了它們適合作為疾病診治的生物標志物，將Exos 作為OP 診斷及預后的生物標志物具有很高的研究價值。

3 CHM 干預Exos 治療OP

CHM 治療在我國防治疾病、保障人民健康中發揮著重要作用。現代研究表明[30]，多組分、多途徑、多靶點的作用模式是CHM 防病治病的特色優勢，尤其在治療OP 等復雜性疾病方面有獨特療效。在CHM 治療的發展過程中，使用單一CHM 是原始治療形式，CHM 配方通過在單一CHM 中加入一種或多種CHM 逐漸發展完善。隨著藥理學的進步，針對CHM 生物活性成分的研究越來越受到重視，無論哪種CHM 治療方式都有其獨特優勢。近年來，CHM 干預Exos 治療OP 的研究不斷出現，從微觀的角度證明CHM 對OP 的治療與Exos 有明確聯系。此外，Exos 作為藥物載體，具有低免疫原性，高穩定性、高靶向性等優勢，能有效彌補CHM 溶解度低、藥物活性穩定性差等缺點。通過Exos 將CHM 有效成分精確輸送至靶細胞，發揮更高效的作用，對于OP 的治療具有重大意義。

3.1 淫羊藿苷 淫羊藿苷（Icaritin，ICA）是淫羊藿的主要活性成分，具有補腎壯陽、促進骨代謝等功效。楊傲飛[31]通過研究發現，ICA 可以通過調控miR-122-5p 對BMSCs 的成骨分化、遷移發生起促進作用，同時還發現，OB-Exos 的作用靶點為miR-122-5p，OB-Exos 聯合ICA 對BMSCs 的成骨分化、遷移發生具有更明顯的促進作用。此外，ICA 還可以將Exos作為載體對骨穩態進行調控。Dong M 等[32]研究發現，與單獨使用ICA 相比，使用胎牛血清（FBS）Exos攜帶ICA（FBS Exo-Ica）在促進OB 的增殖和骨再生方面具有更高效的作用，對改善OP 有指導意義。

3.2 牛膝醇提物 牛膝醇提物是牛膝有效成分的濃縮物，具有促進軟骨修復的功能。Exos 可以調節BMSCs 的成骨分化能力。馬篤軍等[33]用牛膝醇提物含藥血清培養BMSCs-Exos 對OA 模型兔進行干預，發現其對OA 模型兔關節局部骨組織超微結構的影響表現在對骨小梁的形態進行了重建，并且顯著提高了骨量。此外通過干預NLRP3/Caspase-1/Toll4/NF-κB 這一炎癥通路，改善了OA 模型兔的炎癥狀態，從而降低了軟骨細胞凋亡及減緩軟骨退變。

3.3 異補骨脂素 補骨脂具有抗OP 的作用，其中有效成分異補骨脂素（Isopsoralen，IP）可加快骨細胞增殖，促進骨形成。王劍等[34]通過研究中藥干預后的骨代謝相關細胞外泌體變化以及對成骨分化的影響，發現IP 干預后BMSCs-Exos 調控MC3T3-E1 成骨分化現象顯著，尤其可加快成骨分化相關基因ALP、OPG、BMP2 的表達，對OP 的治療具有推動作用。

3.4 龜鹿二仙膠 龜鹿二仙膠為補腎名方，具有滋陰填精，益氣壯陽之功效，可有效緩解OP 患者的癥狀。Exos 可以包裹并傳遞信號分子，是OB-OC 間交互的主要中介因素。司譽豪[35]發現，龜鹿二仙膠可通過OB-Exos 在動物體的細胞水平上發揮抗OP 作用，其機制可能與上調TGF-β/Smads 信號通路中Smad3 與TGF-β 以及抑制RANK/RANKL/OPG 中NFATc1 等轉錄和破骨特異因子有關，繼而雙向平衡OB-OC 之間的耦聯，改善骨代謝、微觀結構及生物力學性能。

3.5 溫腎通絡止痛方 溫腎通絡止痛方可改善骨、脂代謝，延緩OP 進程。王禮寧[36]研究發現，脂肪細胞（Adipocyte）來源Exos 可通過其攜帶的效應miRNA-122-5p 調控SPRY2 介導的MAPK 信號通路，進而影響骨髓內BMSCs 的成骨與成脂分化，最終調節骨脂平衡。而溫腎通絡止痛方可促進脂肪細胞分泌Exos，并通過上述過程發揮抗OP 效應。

4 總結與展望

Exos 作為細胞間通訊的重要信息載體，在OP發病過程中發揮著重要作用。Exos 因其內容物與源細胞息息相關，其既可以作為OP 診斷和預后的生物標志物，也可以對OP 過程進行調控。但不同Exos對骨穩態的調控具有雙向作用，其具體促進還是抑制OP 發展仍需要行進一步探索。CHM 在我國已經應用數千年，在中醫基礎理論的指導下，CHM 可通過多途徑、多靶點對骨穩態相關靶細胞進行調控，在治療OP 方面具有獨特優勢。無論是CHM 干預Exos的調控作用還是將Exos 作為CHM 載體，二者聯合將在OP 的治療領域大有可為。不過目前CHM 干預Exos 防治OP 的研究仍處于初始階段，需要更深入的了解Exos 在OP 過程中的作用機制及其對CHM有效成分的加載機制，以便發揮更大作用。不過可以預見的是，以CHM 為突破點，通過Exos 診治OP作為新的醫學方式，具有重要的應用價值，未來可能成為OP 的現實臨床療法。