自身免疫性溶血性貧血患者類(lèi)抗-D抗體的鑒定及輸血治療（附1例報(bào)告）

王加勇，丁懿，陸紫敏

同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院輸血科，上海 200065

輸血在救治自身免疫性溶血性貧血（AIHA）患者過(guò)程中起關(guān)鍵作用，但AIHA患者血清中存在自身抗體，多數(shù)自身抗體缺乏特異性，會(huì)和所有供者的紅細(xì)胞發(fā)生凝集反應(yīng)，在交叉配血時(shí)掩蓋同種抗體，易造成誤診［1］。少部分自身抗體具有特異性，兼有同種抗體和自身抗體特性，可與表達(dá)相應(yīng)抗原的紅細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)，引起溶血反應(yīng)，這類(lèi)自身抗體稱為類(lèi)同種抗體，簡(jiǎn)稱類(lèi)抗體［2］。臨床輸血檢測(cè)中類(lèi)抗體較少見(jiàn)，血清學(xué)試驗(yàn)很難區(qū)分抗體性質(zhì)，常會(huì)造成臨床漏診，給輸血安全帶來(lái)較大風(fēng)險(xiǎn)［3］。血清學(xué)檢測(cè)聯(lián)合基因型分析可檢出未知的類(lèi)抗體，輸血治療時(shí)選擇類(lèi)抗體相應(yīng)抗原陰性的紅細(xì)胞，能最大限度地減少患者同種免疫的發(fā)生和溶血反應(yīng)，保障臨床輸血安全［4］。本研究使用血清學(xué)檢測(cè)和聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物（PCR-SSP）方法處理了1例類(lèi)抗-D抗體AIHA患者，擬通過(guò)回顧性分析患者的病例資料，總結(jié)其血清學(xué)檢測(cè)和基因分型處理方法，指導(dǎo)臨床安全用血。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院血液內(nèi)科2022年7月17日收治的AIHA患者為研究對(duì)象，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批編號(hào)：2019-YLJS-016），患者簽署知情同意書(shū)。患者女，46歲，漢族，因頭暈、乏力1周伴茶色尿，門(mén)診以“溶血性貧血”收治入院。患者在外院確診自身免疫性溶血性貧血2年半，重度貧血貌，皮膚鞏膜黃染，氣促明顯，心率119次/分，顯著增快。實(shí)驗(yàn)室檢查：Hb 32 g/L，紅細(xì)胞（RBC）計(jì)數(shù)0.89×1012/L，網(wǎng)織紅細(xì)胞（Ret）絕對(duì)值621×109/L，總膽紅素（TBIL）126.3 μmol/L，間接膽紅素（IBIL）102.7 μmol/L，血小板計(jì)數(shù)（PLT）72×109/L，患者紅細(xì)胞有破壞現(xiàn)象，重度貧血，臨床申請(qǐng)輸注去白紅細(xì)胞懸浮紅細(xì)胞4 U。

1.2 血型免疫血清學(xué)檢測(cè)

1.2.1 ABO、RhD血型鑒定 ABO/RhD血型鑒定采用微柱凝膠卡法，RhD基因分型、DAT采用試管法，實(shí)驗(yàn)操作均按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程執(zhí)行［5］。

1.2.2 不規(guī)則抗體篩查和鑒定 不規(guī)則抗體篩查和抗體鑒定譜細(xì)胞檢測(cè)采用微柱凝膠卡法。采用吸收放散試驗(yàn)鑒定不規(guī)則抗體，選擇B型RhD陰性的獻(xiàn)血員紅細(xì)胞，用生理鹽水洗滌3次，取1 mL壓積紅細(xì)胞，加入等量患者血清，充分混合后37 ℃孵育2 h，分離上清液測(cè)定血清抗體效價(jià)；吸收后的紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌3次，加入等量乙醚放散，分離放散液進(jìn)行抗體鑒定。

1.2.3 交叉配血試驗(yàn) 交叉配血聯(lián)合采用鹽水試管法、聚凝胺法和抗球蛋白柱凝集法。

1.3 ABO、RhD血型基因分型判斷 采用PCR-SSP法。采集患者新鮮EDTA抗凝靜脈全血2 mL，用核酸提取或純化試劑從全血中提取DNA 100 μL，采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA含量為20.58 ng/μL，A260/A280為1.78。采用PCR-SSP法檢測(cè)ABO血型基因和RhD基因，ABO血型基因分型PCR反應(yīng)體系總體積120.9 μL，其中0.9 μL Taq酶（5 U/μL），10 μL DNA，110 μL dNTP-Buffer工作液，分別向人類(lèi)紅細(xì)胞ABO血型基因分型試劑盒的引物孔（1～11孔）中各加入10 μL上述混合液，調(diào)整好反應(yīng)程序，置Life ECO型PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：96 ℃預(yù)變性2 min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段，96 ℃ 20 s、68 ℃ 60 s循環(huán)5次；96 ℃ 20 s、65 ℃ 45 s、72 ℃ 30 s循環(huán)10次；96 ℃ 20 s、62 ℃ 45 s、72 ℃ 30 s循環(huán)15次；72 ℃3 min；最后在4 ℃條件下保存。RhD基因分型PCR反應(yīng)體系總體積90.8 μL，其中0.8 μL Taq酶（5 U /μL），10 μL DNA，80 μL dNTP-Buffer工作液，分別向人類(lèi)紅細(xì)胞RhD基因分型試劑盒的引物孔（1～8孔）中各加入10 μL上述混合液，調(diào)整好反應(yīng)程序，置Life ECO型PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：在96 ℃預(yù)變性2 min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段，96 ℃ 20 s、68 ℃ 60 s循環(huán)5次；96 ℃ 20 s、65 ℃ 50 s、72 ℃ 45 s循環(huán)10次；96 ℃ 20 s、62 ℃ 50 s、72 ℃ 45 s循環(huán)18次；72 ℃ 5 min；最后在4 ℃條件下保存。將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至2.5%瓊脂糖凝膠孔中，JY300C核酸電泳儀電泳15 min，在JYO2S核酸成像分析儀下觀察條帶結(jié)構(gòu)，依據(jù)結(jié)果分型表判斷血型檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 ABO、RhD血型鑒定與不規(guī)則抗體篩查 患者ABO血型鑒定結(jié)果見(jiàn)表1，正定型結(jié)果為AB，反定型結(jié)果為O型，試管法反定型在顯微鏡下可見(jiàn)Bc、Oc和自身紅細(xì)胞均凝集，加生理鹽水后凝集未散開(kāi)，正反定型結(jié)果不一致；患者RhD血型是DCCee。患者血漿與抗體篩查細(xì)胞Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ均凝集，不規(guī)則抗體篩查結(jié)果見(jiàn)表2。患者紅細(xì)胞做DAT結(jié)果為抗IgG+C3陽(yáng)性（3+），抗IgG陽(yáng)性（2+），抗C3陽(yáng)性（+）。

表1 患者ABO血型鑒定正反定型結(jié)果

2.2 ABO、RhD血型基因分型 ABO基因分型結(jié)果顯示患者基因型為BO1，表型為B型。RhD基因分型結(jié)果顯示患者基因分型為RhD陽(yáng)性。

2.3 抗體鑒定 患者血清及放散液與抗體鑒定譜細(xì)胞反應(yīng)格局見(jiàn)表3。對(duì)照譜細(xì)胞試劑盒（批號(hào)20220105）抗原格局表，抗體鑒定符合抗-D格局，紅細(xì)胞血型抗體鑒定細(xì)胞反應(yīng)格局表見(jiàn)表4。患者血清與11號(hào)譜細(xì)胞反應(yīng)效價(jià)為1∶4。

表3 患者血清及放散液與抗體鑒定譜細(xì)胞反應(yīng)格局

表4 紅細(xì)胞血型抗體鑒定細(xì)胞反應(yīng)格局表

2.4 吸收放散試驗(yàn) 吸收后上清液測(cè)定血清抗-D抗體效價(jià)為陰性，吸收后放散液進(jìn)行抗體鑒定，與抗體鑒定譜細(xì)胞反應(yīng)格局符合抗-D抗體特異性，與11號(hào)譜細(xì)胞反應(yīng)效價(jià)為1∶4，患者血清類(lèi)抗-D抗體被RhD抗原陰性紅細(xì)胞吸收。

2.5 交叉配血 患者標(biāo)本與4單位B型RhD抗原陰性的紅細(xì)胞做交叉配血試驗(yàn)，主側(cè)在鹽水介質(zhì)（室溫、37 ℃）中均有弱聚集，無(wú)溶血；主側(cè)在在聚凝胺和抗球蛋白卡中均有弱聚集，無(wú)溶血。患者當(dāng)天輸注上述4 U去白紅細(xì)胞懸浮紅細(xì)胞后，Hb由輸血前32 g/L上升到56 g/L，RBC由輸血前0.89×1012/L上升到1.72×1012/L，證明輸血有效。

2.6 治療結(jié)局 本例患者采用糖皮質(zhì)激素作為一線治療，采用甲潑尼龍20 mg/（kg·d）沖擊治療聯(lián)合免疫球蛋白（IVIG）1 g/（kg·d）靜脈滴注，連用5 d后，口服潑尼松2 mg/（kg·d）至7月27日，患者Hb上升至62 g/L，一般狀況良好，準(zhǔn)予出院。出院后患者繼續(xù)口服潑尼松，1個(gè)月后逐漸減低激素劑量，總療程為3個(gè)月。患者血清與抗體鑒定譜細(xì)胞反應(yīng)格局隨訪結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 隨訪患者血清與抗體鑒定譜細(xì)胞反應(yīng)格局

3 討論

類(lèi)抗體具有紅細(xì)胞同種特異性抗體性質(zhì)，同時(shí)又具備自身抗體特點(diǎn)，能被該特異性抗原陰性的紅細(xì)胞吸收，與血型表型相矛盾，在血型系統(tǒng)中，最常見(jiàn)的是Rh血型系統(tǒng)特異性的自身抗體［6］。正常情況下，由于免疫系統(tǒng)具有免疫自穩(wěn)、免疫監(jiān)視和免疫防御功能，患者體內(nèi)不會(huì)自發(fā)產(chǎn)生類(lèi)抗體，AIHA患者產(chǎn)生類(lèi)抗體的發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前一般認(rèn)為是一種自身抗體-自我免疫現(xiàn)象［7］。AIHA患者的輸血是臨床治療中的一大難題，開(kāi)展血型基因分型檢測(cè)，與血清學(xué)鑒定技術(shù)相結(jié)合，鑒定出AIHA患者體內(nèi)存在的類(lèi)抗體，可以保證臨床輸血的安全性和有效性。

本研究患者血型鑒定正反定型不一致，反定型試管法Bc、Oc和自身紅細(xì)胞在不同溫度條件下凝集強(qiáng)度一致，排除是冷凝集素干擾［8］，加1滴生理鹽水混勻，在顯微鏡鏡下觀察凝集未散開(kāi)，排除是血漿蛋白異常引起的假凝集［9］。患者DAT表現(xiàn)為陽(yáng)性，抗IgG+C3凝集強(qiáng)度為3+，患者血漿與抗體篩查細(xì)胞Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ均凝集，凝集強(qiáng)度為2+，較DAT弱，考慮患者有游離自身抗體，不能排除同種抗體存在［10］，患者正定型中紅細(xì)胞與抗?A發(fā)生弱凝集，反定型中與正常人的A1紅細(xì)胞發(fā)生凝集，與A亞型的血清學(xué)典型特征類(lèi)似［11］，為排除自身抗體干擾和A亞型，本研究采用PCR-SSP法檢測(cè)血型基因。

本研究患者ABO基因分型為BO1，表型為B型，排除ABO亞型。患者血清與抗體鑒定譜細(xì)胞反應(yīng)，自身抗體的凝集強(qiáng)度有反應(yīng)格局，患者紅細(xì)胞用乙醚放散，用抗體鑒定譜細(xì)胞對(duì)放散液進(jìn)行血型特異性鑒定，放散液與所有譜細(xì)胞均凝集，且與RhD表型抗原的譜細(xì)胞凝集強(qiáng)度更強(qiáng)，反應(yīng)格局符合抗-D抗體特異性，但由于患者RhD基因分型為RhD陽(yáng)性，表達(dá)正常的D抗原，因此，患者體內(nèi)產(chǎn)生的抗-D抗體為同種特異性自身抗體。吸收放散試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了患者血清類(lèi)抗-D抗體可被RhD抗原陰性紅細(xì)胞吸收，符合類(lèi)特異性自身抗體特征。本研究篩選了RhD抗原陰性的4U去白紅細(xì)胞懸浮紅細(xì)胞，給患者輸注后，Hb由輸血前32 g/L上升至56 g/L，RBC由輸血前0.89×1012/L上升至1.72×1012/L，輸血有效。臨床案例報(bào)道類(lèi)抗體在治療期間效價(jià)下降，在體內(nèi)存留時(shí)間通常為5~10 d，本例患者在入院第10天鑒定抗體特異性，血清與抗體鑒定譜細(xì)胞反應(yīng)已無(wú)明顯特異性，說(shuō)明類(lèi)抗體自身的效價(jià)減退，臨床治療有效［12］。

本研究采用PCR-SSP法對(duì)患者血型基因精準(zhǔn)分析，綜合血清學(xué)試驗(yàn)對(duì)抗體進(jìn)行特異性鑒定，吸收放散試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了患者體內(nèi)存在類(lèi)抗-D抗體這一結(jié)論。要引起重視的是，AIHA患者進(jìn)行抗體檢測(cè)時(shí)，不能簡(jiǎn)單地使用“陰性排除法”，認(rèn)為患者紅細(xì)胞上存在某抗原，其血漿中就應(yīng)排除針對(duì)該抗原的抗體，不再做進(jìn)一步檢測(cè)，這通常會(huì)導(dǎo)致有臨床意義的類(lèi)抗體漏檢。因此，對(duì)于抗體鑒定困難的AIHA患者，進(jìn)行抗體檢測(cè)時(shí)，可采用PCR-SSP法基因分型輔助鑒定抗體特異性，從而為患者提供精準(zhǔn)的輸血治療，為臨床輸血安全提供保障。

目前，對(duì)于類(lèi)抗體AIHA患者的輸血原則國(guó)內(nèi)無(wú)明確輸血指南。本研究患者輸血前Hb 32 g/L，出現(xiàn)明顯溶血表現(xiàn)，通過(guò)臨床評(píng)估，選擇RhD陰性的去白細(xì)胞懸浮紅細(xì)胞進(jìn)行輸血治療，輸血后Hb升高明顯，無(wú)輸血不良反應(yīng)。對(duì)于AIHA患者類(lèi)抗體的治療，也無(wú)統(tǒng)一國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，多以治療原發(fā)病為主，糖皮質(zhì)激素是首選。本例患者接受甲潑尼龍20 mg/（kg·d）沖擊治療，聯(lián)合免疫球蛋白（IVIG）1 g/（kg·d）靜脈滴注，連用5 d后，口服潑尼松2 mg/（kg·d），患者溶血得到有效控制，出院后持續(xù)激素治療，3個(gè)月后隨訪，患者自身抗體陰性，治療有效。

綜上所述，血清學(xué)檢測(cè)聯(lián)合基因分型可鑒定具有同種抗體特異性的自身抗體，類(lèi)抗體AIHA患者治療首選糖皮質(zhì)激素，危急情況下需要輸血治療時(shí)，應(yīng)選擇類(lèi)抗體相應(yīng)抗原陰性的紅細(xì)胞，輸血效果較好。