骨髓間充質干細胞移植對蛛網膜下腔出血大鼠早期腦損傷的治療作用及機制

丁盈月，劉俊杰，2，谷晨昕，王一超，張秋華，劉少鵬，王亮，李建民，2

1 華北理工大學臨床醫學院，河北唐山 063000；2 華北理工大學附屬醫院神經外科；3 華北理工大學公共衛生學院；4 唐山南湖醫院重癥醫學科

蛛網膜下腔出血（SAH）是指各種原因的顱內出血，血液流入蛛網膜下腔，進而引起劇烈頭疼等癥狀的臨床急癥。SAH可分為自發性和創傷性兩類［1］。早期腦損傷（EBI）是指SAH后72 h內出現的腦部損傷，其主要表現為氧化應激、血腦屏障破壞、神經元死亡以及腦水腫等［2］。鐵死亡為非凋亡形式的調節性細胞死亡，谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）活性減弱、鐵蓄積、脂質過氧化、谷胱甘肽（GSH）耗竭是其主要特征［3-4］。NADPH氧化酶2（NOX2）/活性氧（ROS）信號通路在鐵死亡中占重要地位。NOX2是ROS生成的重要來源，ROS水平升高，炎癥小體被激活，進而導致神經炎癥和神經損傷。脂質類ROS積累在鐵死亡中起重要作用［5］。SAH中NOX2/ROS信號通路的激活，是其發生神經炎癥、氧化應激、神經凋亡以及鐵死亡等的一個重要機制。骨髓間充質干細胞（BMSC）具有干細胞特性，在神經損傷中有修復作用，緩解SAH后EBI的神經行為障礙和炎癥反應［6］；來自BMSC的外泌體（Exo）可通過miRNA129-5p-HMGB1途徑緩解SAH后EBI［7］；BMSC可保護SAH的血腦屏障［8］。2022年6月—2023年1月，本研究探討BMSC移植是否通過調節NOX2/ROS通路來調控鐵死亡，進而對SAH大鼠EBI發揮治療作用。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 健康雄性SD大鼠48只，8周齡，體質量280~320 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。許可證號：SYXK（京）2017-0002。普通飼料飼養，環境溫度22~25 ℃，環境濕度45%~60%，每天光照12 h、黑暗12 h，自由攝食和飲水。在華北理工大學動物實驗中心適應性喂養7 d。本研究獲得華北理工大學動物保護與福利委員會的批準。SDS-PAGE（北京博奧森生物技術有限公司），BCA蛋白測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），ECL顯色試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司），普魯士藍染色試劑盒、組織鐵檢測試劑盒、丙二醛（MDA）檢測試劑盒、谷胱甘肽含量檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），ROS檢測DCFH-DA探針（上海碧云天生物技術有限公司），鼠抗β-actin單克隆抗體（美國SANTA CRUZ公司），兔抗NOX2抗體（美國Proteintech公司）。BX53型顯微鏡（日本Olympus公司），LeicaRM2245型切片機（德國Leica公司）。ZMN-7803冷凍臺（常州華利電子公司），5417R冷凍離心機（德國Eppendorf公司），凝膠成像分析系統（美國Bio-Rad公司）多功能酶標儀（BioTek Synergy 2，Gene Company Limited）。

1.2 動物分組及模型制備 將大鼠隨機分為假手術組、蛛網膜下腔出血（SAH）組、BMSC組、VitE組，每組10只，當組內大鼠意外死亡時及時補足。參考SUZUKI等［9］造模方法，采用血管內穿刺法，構建SAH模型。經腹腔注射戊巴比妥（50 mg/kg）麻醉，頸部切口，結扎頸外動脈遠端后切斷，于頸外動脈處做“V”形切口，將銳化3-0單絲尼龍線導入，有阻力感時繼續進線，當頸內動脈分叉處被刺穿時感受到落空感，認為穿刺成功，導致SAH。假手術組大鼠僅進行血管穿刺，但不刺破血管。SAH造模成功后可見蛛網膜下腔、腦基底、Willis環周圍有出血及血凝塊，HE染色可見蛛網膜下腔有大量紅細胞沉積。

1.3 BMSC分離、培養和鑒定 參考劉文超［10］方法，分離、培養和鑒定BMSC。

1.4 BMSC移植 參考劉文超［10］方法，從第三、四代的原代BMSC中取樣，除去培養基，用PBS沖洗3次，離心，去上清液，通過細胞計數板測量細胞濃度。造模后24 h，將第4代BMSC 3×106個重懸于0.6 mL PBS中，經股靜脈注入BMSC組；假手術組、SAH組、VitE組經股靜脈注入等量PBS。VitE組給予維生素E（100 mg/kg）灌胃，其他組給予等量橄欖油灌胃。

1.5 神經功能評估 造模后48 h，參照改良Garcia評分評估大鼠的神經功能，內容包括體態均勻性、自主運動性能、前肢伸直活動、抓持和攀登鐵籠性能、兩側胡須碰觸反應速度以及肢體觸覺反應。3~18分，分值越高說明神經功能受損程度越輕［11］。

1.6 腦組織含水量測定 造模后48 h，測定大鼠腦水腫程度。用10%水合氯醛經腹腔注射麻醉，切開大腦，測量腦組織濕重；將腦組織置于75 ℃環境下連續烘烤24 h，冷卻，測量腦組織干重。腦組織含水量=（濕重－干重）/濕重×100%。

1.7 腦組織病理變化觀察 造模后48 h，據HE染色試劑盒操作步驟，配制4% POM溶劑、梯度乙醇溶劑、二甲苯和乙醇混合液、1%鹽酸乙醇分離液；通過固化4% POM、脫水用梯度乙醇溶劑、透化用二甲苯、浸蠟包埋腦組織制作切片；脫蠟、透明、復水，用蘇木精和伊紅對切片染色。最后，脫水、密封和透明。在正置光學顯微鏡（400倍）下觀察腦組織病理變化。運用Image-Pro Plus 6.0圖像軟件統計高倍視野下病理損傷的細胞作為壞死神經細胞數，每只大鼠隨機選取5個視野拍照，取均值。壞死標準：細胞排列紊亂、大小與形態不一，部分細胞萎縮、核固縮。

1.8 鐵死亡相關指標檢測

1.8.1 腦組織鐵沉積情況檢測 用普魯士藍染色（鐵染色）法。造模后48 h，用石蠟包埋法，用切片機對腦組織進行切割，常規脫蠟，放入Perls stain中浸泡30 min；染色后，用蒸餾水沖洗染色劑；繼續浸入裝有新鮮核固紅染色液的容器中。使用Image-Pro Plus 6.0圖像軟件計算鐵沉積的數量，即鐵沉積像素的面積與觀察區域的面積之比。

1.8.2 腦組織鐵含量測定 用吸光光度法。造模后48 h，取約100 mg大鼠腦組織，加入生理鹽水和組織的比例為1∶9。冰上手動勻漿，4 ℃下12 000 r/min離心10 min（離心半徑6 cm）。將混合物均勻混合，沸水浴，在自來水中加入200 μL氯仿，攪拌平衡，室溫下10 000 r/min離心10 min（離心半徑6 cm），提取上清液800 μL，用酶標儀測量波長520 nm處的光密度，按說明書計算鐵含量。

1.8.3 腦組織MDA、GSH檢測 用吸光光度法。造模后48 h，按1.8.2所述將腦組織樣品打成勻漿。加入樣品并混勻，蓋子緊閉；沸水浴60 min，冷卻，離心10 min，分別滴上清液至干凈的比色皿，按試劑盒操作用酶標儀測量不同波長（450、532、600 nm）的吸光度值，計算MDA含量。稱取約100 mg腦組織，按試劑盒操作說明，冰上勻漿；4 ℃下8 000 r/min離心10 min（離心半徑6 cm），收集上清液，計算GSH含量。

1.9 NOX2/ROS信號通路指標檢測

1.9.1 腦組織NOX2蛋白檢測 采用Western blot‐ting法。造模后48 h，將腦組織制成勻漿，加入蛋白分解液，離心后吸收上清液，提取總蛋白，測定蛋白濃度。樣品SDS-PAGE，電泳結束后轉膜，封閉，加入兔抗NOX2多克隆抗體稀釋（1∶1 000），4 ℃洗膜3次，用辣根過氧化物酶標記的二抗稀釋（1∶2 000），室溫下孵育，TBST洗膜。Supersignal發光試劑盒檢測蛋白條帶灰度值，Quantity One軟件分析實驗結果。β-actin為內參照，目的蛋白相對表達量=目標蛋白灰度值/β-actin灰度值。

1.9.2 腦組織ROS檢測 用ROS探針法。造模后48 h，取大腦組織勻漿后制備的細胞懸液，取上清液用作ROS的分析，按照說明書裝載DCFH-DA探針，采用細胞ROS探針進行檢測。

1.10 統計學方法 采用SPSS23.0統計軟件。符合正態分布且方差齊的計量資料用表示，多組間比較用方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組神經功能比較 假手術組、SAH組、BMSC組、VitE組改良Garcia評分分別為（16.1 ± 1.8）、（8.1 ± 0.9）、（13.7 ± 1.2）、（12.8 ± 1.2）分。與假手術組比較，SAH組改良Garcia評分低（P<0.05）；與SAH組比較，BMSC組、VitE組改良Garcia評分高（P均<0.05）；BMSC組、VitE組改良Garcia評分比較差異無統計學意義（P>0.05）。

2.2 各組腦組織含水量比較 假手術組、SAH組、BMSC組、VitE組腦組織含水量分別為0.776 ±0.011、0.816 ± 0.007、0.792 ± 0.007、0.812 ±0.006。與假手術組比較，SAH組腦組織含水量高（P<0.05）；與SAH組、VitE組比較，BMSC組腦組織含水量低（P均<0.05）。

2.3 各組腦組織病理變化比較 細胞損傷情況：假手術組神經細胞形態規則，均勻；SAH組神經細胞排列紊亂，細胞核破碎；與SAH組比較，BMSC組神經細胞損傷情況明顯改善；VitE組神經細胞損傷修復情況比BMSC組弱。細胞壞死：假手術組、SAH組、BMSC組、VitE組腦組織神經細胞壞死數分別為（1.62 ± 0.22）、（45.26 ± 3.79）、（29.47 ± 1.53）、（39.38 ± 1.71）個。與假手術組比較，SAH組神經細胞壞死數量多（P<0.05）；與SAH組、VitE組比較，BMSC組神經細胞壞死數量少（P均<0.05）。

2.4 各組腦組織細胞鐵死亡相關指標比較 與假手術組比較，SAH組腦組織中鐵沉積量、鐵含量、MDA含量高（P均<0.05），GSH含量低（P<0.05）；與SAH組、VitE組比較，BMSC組腦組織中鐵沉積量、鐵含量、MDA含量低（P均<0.05），GSH含量高（P均<0.05）。見表1。

表1 各組腦組織中鐵沉積量、鐵含量、MDA含量、GSH含量比較（）

表1 各組腦組織中鐵沉積量、鐵含量、MDA含量、GSH含量比較（）

注：與假手術組比較，*P<0.05；與SAH組比較，#P<0.05；與BMSC組比較，&P<0.05。

組別假手術組SAH組BMSC組VitE組GSH含量（mg/g）45.95 ± 0.45 22.99 ± 3.59*32.66 ± 1.44#21.86 ± 1.62&n 10 10 10 10鐵沉積量（%）0.012 ± 0.009 0.319 ± 0.028*0.164 ± 0.019#0.209 ± 0.019&鐵含量（μg/g）38.010 ± 0.266 107.050 ± 0.539*64.720 ± 0.498#79.470 ± 0.347&MDA含量（nmol/mg）5.85 ± 0.191 9.35 ± 0.238*7.32 ± 0.140#8.12 ± 0.154&

2.5 各組腦組織中NOX2蛋白、ROS水平比較 與假手術組比較，SAH組腦組織中NOX2蛋白表達、ROS水平高（P均<0.05）；與SAH組、VitE組比較，BMSC組腦組織中NOX2蛋白表達、ROS水平低（P均<0.05）。見表2。

表2 各組腦組織中NOX2蛋白、ROS水平比較（）

表2 各組腦組織中NOX2蛋白、ROS水平比較（）

注：與假手術組比較，*P<0.05；與SAH組比較，#P<0.05；與BM‐SC組比較，&P<0.05。

ROS 1.002 ± 0.024 1.65 ± 0.057*1.311 ± 0.045#1.421 ± 0.048&組別假手術組SAH組BMSC組VitE組n 10 10 10 10 NOX2 0.286 ± 0.019 0.892 ± 0.029*0.512 ± 0.009#0.767 ± 0.017&

3 討論

SAH是一種威脅生命的腦血管疾?。?2］。EBI是一種腦損傷，通常在SAH后72 h內出現，表現為腦血流量減少及顱內壓升高，導致局部腦缺血［13］。EBI被認為是遲發性腦血管痙攣和微循環障礙的先兆［14］。血腦屏障受損、血氧反應、腦水腫、神經系統炎癥和退行性變等均與EBI有關，對EBI進行及早干預可增強治療效果，改善預后［15-16］。因此，明確該階段病理分子機制，減輕SAH后EBI的神經功能障礙尤為重要。

BMSC是一組具有生物學特性、多向分化潛能和自我復制的成體干細胞［17］。在動物實驗中，靜脈內移植BMSC可改善SAH動物的神經功能，相關機制可能與減少神經元凋亡、減輕炎癥和改善腦組織微觀結構有關［7］。本研究發現，在SAH后72 h，大鼠神經功能損害，BMSC移植可減輕其神經功能障礙，進而起到神經修復作用。然而，BMSC的具體靶點及其所涉及的機制有待進一步研究。SAH后24 h，大鼠出現明顯的神經功能損害，腦水腫程度明顯升高說明急性腦損傷程度明顯加重，與假手術組比較，差異有統計學意義。觀察腦組織病理切片，形態學顯示神經元細胞排列雜亂，形態不規則，胞核收縮、破裂、溶解，壞死嚴重，與假手術組比較，差異有統計學意義。

本研究中，SAH后72 h，SAH組腦組織中鐵含量顯著升高。這是因為細胞膜上的不飽和脂肪酸被過量的鐵和脂氧合酶激活，從而促進其生成和分解。后者發生脂質過氧化，生成大量ROS分子（羥自由基等），進而破壞生物大分子結構，最終導致細胞死亡。鐵死亡為程序性細胞死亡，與其他死亡形式的發生機制大相徑庭。鐵死亡廣泛參與病理過程，如心肌變性、神經退行性變等［18］。近期研究表明，SAH后EBI中神經細胞鐵代謝紊亂［19］、線粒體衰竭［20］、活性氧蓄積［21］等重要環節與鐵死亡聯系密切。研究發現，當細胞內抗氧化劑GSH消耗和GPX4表達下降時，就會發生鐵死亡。GPX4在清除ROS方面起重要作用，但由于鐵的過量沉積，ROS會出現異常聚集［22］。過多的ROS會造成氧化損傷和加速衰老等。對鐵死亡過程實施干預可以減緩病情發展，并且相應地改善臨床癥狀。本研究檢測了鐵死亡相關指標，發現SAH后72 h大鼠腦組織中鐵沉積量、MDA含量增加及GSH含量明顯下降。上述結果表明，SAH后72 h，大鼠腦組織細胞發生了鐵死亡，即提示SAH后EBI病理過程中有鐵死亡的發生。研究表明，SAH大鼠大腦皮質在24 h后出現鐵死亡［23］?；贐MSC移植對大鼠SAH后EBI期間神經功能障礙的減輕和修復作用以及SAH后EBI與鐵死亡的密切關系，我們猜測BMSC移植可能對SAH后EBI中發生的鐵死亡有改善作用。本研究結果表明，BMSC移植可顯著改善大鼠SAH后EBI期間腦組織中的鐵沉積，減少神經元受損、腦組織中的鐵含量、MDA含量，增加腦組織中GSH含量、減輕大鼠SAH后EBI期間鐵死亡的發生。

NOX2/ROS信號通路是鐵死亡的關鍵調控通路，目前認為EBI的重要機制之一即為ROS誘導的神經元凋亡［24］。本研究中，SAH組NOX2蛋白表達與ROS水平較假手術組顯著升高，而BMSC組大鼠NOX2蛋白表達與ROS水平較SAH組顯著降低；結合鐵沉積情況，鐵含量、MDA含量和GSH含量的結果，進一步提示EBI過程中發生了細胞鐵死亡。且提示BMSC移植能在SAH后抑制NOX2/ROS信號通路激活。造模后使用已知陽性藥物VitE，對比發現BMSC移植的神經保護作用強于VitE。

綜上所述，BMSC移植可能通過調控NOX2/ROS信號通路抑制鐵死亡的發生，從而發揮其對SAH大鼠EBI的治療作用。但BMSC移植能否通過其他機制發揮作用，有待進一步探索。