紫杉醇聚乳酸微球的制備及其抗胃癌活性評價

孫彬成，劉靜，李君

1 巴彥淖爾市醫院消化內科，內蒙古巴彥淖爾 015000；2 內蒙古醫科大學藥學院

紫杉醇（PTX）系一種二萜類化合物，來源于紅豆杉屬植物［1］，于20世紀發現并具有廣譜、高效作用的抗癌治療藥物。目前，紫杉醇在臨床主要被用于肺癌、乳腺癌、卵巢癌、大腸癌、胃癌等的一線治療［2］，但其水溶性差，臨床使用范圍受限。目前臨床應用的劑型主要為紫杉醇注射液Taxol?［3］，但其溶媒聚氧乙烯蓖麻油不良反應較強，可引發過敏、低血壓和神經脫髓鞘等不良生理病理反應［4］。微球（MPS）給藥系統的粒徑1~250 μm，具有吸收良好、生物利用度高，藥物緩釋等優點［5］，同時，微球給藥系統處方中僅含有少量穩定劑，不良反應發生率大大降低。因此，微球給藥系統現已廣泛用于生物制藥領域［6］。聚乳酸（PLA）是一種高分子聚合物，其分子構象存在三種異構體：左旋聚乳酸（PLLA）、右旋聚乳酸（PDLA）、外消旋聚乳酸（PDLLA），其中左旋聚乳酸PLLA生物相容性良好，可被最終降解為CO2和H2O，而其中間產物左旋乳酸（LLA）能被人體代謝吸收。目前，已被美國食品藥品監督管理局（FDA）批準為安全的藥用輔料［7-8］。2019年6月—2021年6月，本研究通過制備載紫杉醇聚乳酸微球（PTX-PLLA-MPS），建立含量測定方法，優化制備工藝，并對其體外釋放行為及抗胃癌活性進行初步評價。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌細胞SGC7901由內蒙古大學生命科學學院提供；裸鼠30只，體質量20~22 g，雌雄不限，購自北京斯貝福生物技術有限公司，SCXK（京）2019-0010，實驗動物飼養于內蒙古醫科大學新藥安評中心小動物飼養屏障設施。紫杉醇PTX（Lot number：20200927，純度：99.20%，成都曼思特生物科技有限公司）；0588低黏度型聚乙烯醇（Lot num‐ber：J1918087，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；PLLA（批號：20190511，成都曼思特生物科技有限公司）；胎牛血清（Lot number：04-001-1ACS，BI）；1640培養基（Lot number：210359，Hyclone）；培養皿、96孔板等（康寧）無水乙醇、甲醇等（翁江化學試劑有限公司）。高效液相色譜儀（Agilent-1260，Agilent Technologies Inc）；電子天平（AR224CN，奧豪斯儀器上海有限公司），超聲波清洗機（SB25-12DTD，寧波新芝生物科技股份有限公司）；電熱恒溫培養箱（DNP-9162型，上海精宏實驗設備有限公司）；電子天平（DT-500B，常熟市佳衡天平儀器有限公司）；純水機［Milli-Q，美國默克密理博實驗室設備（上海）有限公司］；光學顯微鏡（DM-2000，德國徠卡儀器有限公司）；動態光散射納米顆粒分析儀（SZ-100，堀場儀器上海有限公司）；酶標儀（Multiskan MK3，Thermo Fisher Inc）。

1.2 方法

1.2.1 PTX-PLLA-MPS的制備 根據相關文獻［9-10］報道，以PLLA為載體，采用溶劑揮發法制備PTXPLLA-MPS，具體步驟：取200 mg PLLA和100 mg PTX于5 mL二氯甲烷中，超聲振蕩5 min使之完全溶解作為油相，將油相緩慢逐滴快速滴入水相（50 mL 1%聚乙烯醇PVA溶液）中，油相加入后，溶液過高速均質機，隨后磁力攪拌有機溶劑揮發后，5 000 r/min離心10 min（離心半徑13.5 cm），收集沉淀微球，蒸餾水洗滌后冷凍干燥制得微球，工藝流程如圖1所示。

圖1 PTX-PLLA-MPS制備工藝流程示意圖

1.2.2 溶液配制 紫杉醇對照品的配制：秤取紫杉醇PTX對照品100 mg，置于50 mL棕色容量瓶中，加甲醇40 mL，超聲20 min，冷卻至室溫，加甲醇至刻度，搖勻，即得2 mg/mL對照品溶液。PTX-PLLA-MPS的配制：秤取PTX-PLLA-MPS 100 mg，置于50 mL棕色容量瓶中，加40 mL甲醇，超聲20 min，冷卻至室溫，加甲醇至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，搖勻，即得供試品溶液。秤取不含紫杉醇PTX的空白微球（MPS），按照供試品溶液配制方法制備陰性對照品溶液。

1.2.3 專屬性、線性、儀器精密度、穩定性和回收率檢測 采用高效液相色譜法。按照如下色譜條件進樣測定，色譜柱：kromasil 100-5-NH2 C18柱（250 mm×4.6 mm 5 μm），流動相甲醇：水（67∶33），進樣量：10 μL，流速：1 mL/min，檢測波長：227 nm，柱溫：（35 ± 0.5）℃。專屬性測定：取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液，按色譜條件進行測定，記錄色譜圖。線性關系測定：精密吸取上述2 mg/mL對照品溶液，配制成系列梯度：10、20、40、100、200、400及600 μg/mL的溶液，過0.45 μm微孔濾膜，按色譜條件進樣測定，以峰面積（Y）對濃度（X）做線性回歸曲線。精密度測定：分別配制100、200及400 μg/mL的低、中、高紫杉醇PTX標準品溶液，按色譜條件進樣測定。穩定性測定：取400 μg/mL紫杉醇PTX標準溶液，過0.45 μm微孔濾膜，按色譜條件進樣測定，在室溫環境條件下，分別于0、2、4、6、12及24 h取樣測定峰面積。回收率的測定：采用加樣回收試驗。取10 mg微球分別加入12、15和18 mg紫杉醇原料藥進行回收率的測定。

1.2.4 紫杉醇微球正交工藝優化 根據文獻［11-12］，實驗選取水相中PVA濃度（A）、油相水相體積比（B）、油相中PLLA濃度（C）及PLLA/PTX比（D）四個因素，每個因素設置3個水平，以載藥量和包封率綜合評分為評價指標，運用正交實驗設計方法優化制備工藝，綜合評分為載藥量和包封率的和。L9（34）正交實驗因素水平表、正交實驗設計如表1所示。

表1 正交因素水平表

1.2.5 微球形態、粒徑分布測定 以最優制備工藝條件制備PTX-PLLA-MPS，取適量微球于載玻片上，加去離子水使之分散，通過光鏡觀察微球形態為球形且無聚集，采用光學顯微鏡觀察其形態，采用粒徑儀測定微球粒徑及Zeta電位。

1.2.6 載藥量和包封率測定 秤取PTX-PLLAMPS 10 mg于10 mL容量瓶中，加入無水乙醇2 mL超聲15 min，加甲醇稀釋至刻度，按“1.2.3”項下方法測定紫杉醇含量，微球載藥量（%）=（微球中含藥量/微球質量）×100%，微球包封率（%）=（微球中含藥量/理論投藥量）×100%。

1.2.7 PTX-PLLA-MPS體外釋放情況觀察 參考文獻［13］方法，秤取20 mg PTX-PLLA-MPS 3批次，分別置于50 mL離心管中，分別加入50 mL蒸餾水釋放介質（含0.5%聚山梨酯-80），混勻后，在37 ℃恒溫振蕩器以100 r/min振蕩，分別于1、2、4、6、9、12、15、18及21天取1 mL釋放介質，同時補充1 mL空白釋放介質，過0.45 μm微孔濾膜后按“1.2.3”項下方法測定紫杉醇含量，計算累積釋放率，并繪制釋放曲線。

1.2.8 各組細胞活力檢測 采用SGC7901細胞增殖實驗。人胃癌SGC7901細胞生長至80%~90%密度時，PBS清洗，0.25%胰蛋白酶消化，調整細胞濃度至4×106/mL，將細胞接種于康寧96孔板。過夜培養后，隨機設置空白微球組、PTX組、PTX-PLLAMPS組，分別加入30 μg/mL空白微球、30 μg/mL PTX、30 μg/mL PTX-PLLA-MPS處理24、48、72 h。加入CCK-8溶液（體積比1∶10），在恒溫細胞培養箱中孵育2 h后，MK3酶標儀在490 nm波長下測量其吸光度。按照公式：細胞活力（%）=給藥孔的吸光度/空白對照的吸光度×100%計算各組細胞活力。

1.2.9 裸鼠荷瘤生長情況觀察 使用胰蛋白酶消化人胃癌細胞SGC7901，調整細胞濃度后，皮下注射到裸鼠前肢腋下，注射體積為0.2 mL/只，建立裸鼠荷瘤模型。選取成瘤裸鼠15只，按體質量隨機分為3組：模型組、PTX組和PTX-PLLA-MPS組，尾靜脈注射給藥，2 d一次，給藥劑量15 mg/kg。根據公式計算腫瘤體積（V），V = a × b2× 0.5（a腫瘤最大直徑，b為腫瘤最小直徑），繪制腫瘤生長曲線。

1.2.10 統計學方法 使用SPSS20.0統計軟件。計量資料符合正態分布以表示，雙尾t檢驗評估兩組間的差異，多組比較使用重復測量方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 專屬性結果 如圖2B和2C所示，紫杉醇PTX的保留時間（RT）約3.514 min；由圖2A可知，實驗過程所用其他輔料及試劑等對紫杉醇含量測定無干擾。

圖2 空白微球（A）、紫杉醇標準品（B）、供試品（C）的高效液相色譜圖

2.2 線性測定結果 以峰面積（Y）對濃度（X）做線性回歸曲線，可得Y=62.281X-168.91，R2=0.999 2，紫杉醇PTX濃度在10~400 μg/mL范圍內線性良好。

2.3 儀器精密度結果 低、中、高紫杉醇PTX標準品溶液對應的RSD分別為0.08%、0.19%、0.08%，表明儀器精密度良好。

2.4 穩定性結果 在室溫環境條件下，分別于0、2、4、6、12及24 h取樣測定峰面積，0~24 h紫杉醇峰PTX的峰面積RSD為0.27%，表明紫杉醇PTX溶液在室溫條件下24 h內穩定。

2.5 加樣回收結果 取10 mg微球分別加入12、15和18 mg紫杉醇原料藥進行回收率的測定，結果回收率分別為99.61 %、100.18 %、99.72 %，相應RSD分別為1.01%、1.42%和0.96%，表明該方法回收率良好，符合分析要求。

2.6 紫杉醇微球最佳制備工藝 A因素的極差R值最大，所以影響紫杉醇微球載藥量和包封率的因素主次順序：A>D>B>C，通過4因素3水平K值分析比較可知，PVA質量濃度A1>A3>A2，油水相體積比B1>B2>B3，PLLA質量濃度C2>C1>C3，PLLA/PTX比D3>D2>D1；根據方差分析表可知，A、B、C、D因素對微球載藥量和包封率均無顯著性影響，可以確定紫杉醇微球最優制備工藝為A1B1C2D3，即PVA濃度為1.0%，油水體積比為1∶10，PLLA質量濃度為6%，PLLA/PTX質量比為6∶1。

2.7 微球形態、粒徑分布、載藥量及包封率 以最優制備工藝條件制備PTX-PLLA-MPS，肉眼觀察為細膩粉末狀，微球粒徑為（1.23 ± 0.21）μm，Zeta電位（3.67 ± 1.42）mV；測得三批微球平均載藥量為（18.23 ± 1.40）%、包封率為（74.00 ± 1.49）%。

2.8 PTX-PLLA-MPS體外釋放測定結果 所得PTX-PLLA-MPS第1天體外釋放率為（9.43 ±3.12）%，未出現突釋現象，在第6天有明顯釋放過程，累積釋放率為（43.65 ± 1.65）%，隨后各測量點釋放趨于平穩，第21天累積釋放率為（76.20 ±3.46）%。

2.9 PTX-PLLA-MP抗胃癌活性初步評價［13］

2.9.1 各組SGC7901細胞活力比較 見表2。

表2 各組SGC7901細胞活力比較（）

表2 各組SGC7901細胞活力比較（）

注：與空白微球組比較，*P<0.01；與PTX組比較，#P<0.05。

72 h 92.50 ± 1.85 61.93 ± 1.54*52.22 ± 2.74*#組別細胞活力（%）空白微球組PTX組PTX-PLLA-MPS組24 h 97.50 ± 3.29 82.50 ± 1.49*77.02 ± 5.34*48 h 93.50 ± 3.09 72.13 ± 3.49*62.59 ± 4.29*#

2.9.2 各組荷瘤裸鼠腫瘤體積比較 見表3。

表3 各組腫瘤體積比較（）

表3 各組腫瘤體積比較（）

注：與模型組比較，*P<0.01；與PTX組比較，#P<0.05。

組別模型組PTX組PTX-PLLA-MPS組腫瘤體積（mm3）56 d 1 533.50 ± 30.49 642.50 ± 20.49*782.50 ± 26.50*#14 d 30.99 ± 1.25 28.95 ± 1.20 28.50 ± 1.50 28 d 334.04 ± 2.45 304.50 ± 3.49*335.50 ± 4.49#42 d 756.50 ± 14.19 537.49 ± 12.19*576.50 ± 9.19*#

3 討論

紫杉醇作為臨床一線抗癌藥物，由于其劑型原因極大限制了其臨床應用，同時其引起的過敏反應給患者帶來諸多不適，為避免其不良反應，目前研制了紫杉醇白蛋白、紫杉醇脂質體等劑型［14］，PLLA作為無毒且可生物降解材料，常用作緩釋微球載體。目前，制備微球常用方法有單/復乳溶劑揮發法、噴霧干燥法及超臨界流體法等；根據紫杉醇溶解性結合相關文獻報道［11］，本研究對紫杉醇聚乳酸微球進行了系統實驗，通過溶劑揮發法制備載紫杉醇聚乳酸微球，在預實驗過程中，由于PVA在低溫條件溶解較慢，故對其進行了加熱、超聲等操作，然而在將油相加入到PVA水溶液過程中，由于二氯甲烷沸點較低，引起沸騰，所以在PVA充分溶解的情況下選擇在冰浴條件下緩慢加入油相；同時，對油相加入速度進行了考察，結果發現快速將油相加入到水相致使油相聚集，不宜形成微球，所以油相加入過程應逐滴緩慢加入。

本研究采用高效液相色譜法測定微球中紫杉醇含量，結果紫杉醇質量濃度在10~600 μg/mL線性良好，精密度、加樣回收率RSD均在2%以內，表明該方法符合分析要求。

為了解所制備微球的釋放行為，本研究選擇蒸餾水為釋放介質考察體外釋放行為，結果表明微球在釋放介質中呈緩釋趨勢，在最初4天釋放較為緩慢，然而在第6天有明顯釋放，分析原因可能與藥物在微球骨架中分布有關，在隨后各測量點釋放緩慢增加，第21天累積釋放率為（76.20 ± 3.46）%。然而藥物在體內的釋放是一個極為復雜的過程，不僅有PLLA的水解、斷裂及藥物釋放，還包括多種酶系統的降解反應，所以體外釋放實驗帶有一定局限性，故不能完全代表藥物體內的釋放過程；同時，采用溶劑揮發法制備微球需可揮發有機溶劑的參與，致使微球內不可避免的殘留少量有機溶劑，所以后期進行細胞層面及動物層面的毒性研究研究仍具有重要意義。

在建立裸鼠荷瘤模型試驗中，預實驗注射的細胞數量為細胞濃度為5×106個/點，然而腫瘤生長過快，腫瘤塊出現壞死現象，且給藥次數受限。經過梯度篩選，最終確定成瘤需注射的細胞數量為2×106個/點。建立裸鼠荷瘤模型時，由于實驗動物之間存在個體差異，所以要進行篩選，將腫瘤生長明顯異常的實驗動物剔除，從而保證實驗結果的準確性。動物實驗過程中，尾靜脈注射應緩慢給藥，避免因注射過快而出現急性毒性反應。

綜上所述，在本實驗條件下，采用溶劑揮發法，通過正交優化實驗成功制備了PTX-PLLA-MPS，在PVA濃度為1.0% ，油水體積比為1∶10，PLLA質量濃度為6%，PLLA/PTX質量比為6∶1的工藝條件下所得微球形態圓整，粒徑分布均勻，體外具有明顯緩釋過程，同時，通過細胞增殖和裸鼠荷瘤實驗證明PTX-PLLA-MPS具有較好抗胃癌活性。