濃香型白酒發酵過程中酒醅微生物群落結構解析及其與風味物質的相關性

宋建陽，梁莉瑩，岑定運，武思雨，郭書賢，許彬，王春艷*

（1.南陽理工學院河南省工業微生物資源與發酵技術重點實驗室，河南 南陽 473004；2.南陽理工學院土木工程學院，河南 南陽 473004）

白酒釀造過程實質上是微生物繁殖和代謝的過程。濃香型白酒其豐富、獨特的口感正是來自于釀酒微生物群的發酵作用，例如真菌菌群是產酒精、產香的主要功能菌，也具有很高的糖化酶及酯化酶活力[1-2]，這些微生物群在釀酒周期內不斷動態變化，與整個釀酒過程中所形成的生存環境相適應，經過相應的釀造工藝產生了白酒的獨特口味[3-4]。

目前，隨著宏基因組測序技術在傳統白酒發酵中的廣泛應用，微生物群落結構與白酒風味物質的相關性研究成為熱點問題[5-7]。吳成等[8]研究醬香型白酒4 輪次堆積發酵過程風味物質與微生物群落間的相互關系，發現酵母菌主要與醇類物質呈正相關顯著，絲狀真菌和細菌主要與酸類和酯類物質呈正相關顯著。劉凡等[9]研究發現，洋河濃香型白酒發酵過程與主要有機酸合成相關的7 個菌屬微生物；蒙德俊等[10]以醬香型白酒7 輪次發酵酒醅樣品為研究對象，分析發現了畢赤酵母屬和酵母菌屬與乳酸呈顯著相關。王鵬等[11]采用微生物群落與揮發性化合物輪廓關聯分析獲得功能相關的微生物群，又通過共現性網絡分析獲得共現微生物群，最終確定了白酒發酵過程中的核心微生物群。

本研究以濃香型白酒不同發酵周期的酒醅樣品為研究對象，對其微生物群落結構及其風味物質進行解析，并對兩者之間的相關性進行預測，嘗試了解濃香型白酒發酵過程中的主要功能微生物群，為白酒生產的定向調控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

酒醅樣品來自河南宋河酒業有限公司16 年窖池。分別采集發酵第0、3、6、9、15、21、27、33、48、60 天的窖池中心上、中、下3 層樣品，放入無菌采樣袋中，充分混勻后低溫運回實驗室，-80 ℃保存。

1.2 主要試劑

4-辛醇（色譜純）：美國Sigma 公司；NaCl（分析純）：天津市福晨化學試劑廠；E.Z.N.ATM Mag-Bind 土壤DNA 提取試劑盒：美國OMEGA 公司；Agencourt AMPure XP 核酸純化試劑盒：美國Beckman 公司；Qubit3.0 DNA 檢測試劑盒：美國Life 公司。

1.3 試驗儀器與設備

7890B-5975C 氣相色譜質譜聯用儀、Agilent7697A頂空進樣系統、HP-INNOWAX 色譜柱（60 m×250 μm×0.5 μm）：美國安捷倫科技有限公司；EC3 凝膠成像系統：美國UVP 公司；T100 Thermal Cycler PCR 儀：美國Bio-RAD 公司；Illumina Miseq PE250 高通量測序儀：美國Illumina 公司。

1.4 方法

1.4.1 酒醅中揮發性風味物質的測定

采用靜態頂空氣相色譜-質譜法（static headspace gas chromatography-mass spectrometry，SHSGC-MS）對酒醅中揮發性風味物質進行分析。取2.0 g 酒醅樣品加入8 mL 超純水中，4 ℃過夜，冰浴超聲30 min 后，于4 ℃、1 000 r/min 離心20 min，將8 mL 已離心的酒醅提取液加入到20 mL 頂空瓶中，再加入3.0 g NaCl 和質量濃度為125 mg/L 的內標物4-辛醇25 μL。采用頂空進樣器處理樣品[12]。

GC 條件：HP-INNOWAX 色譜柱；載氣為氦氣，流速1 mL/min；進樣口溫度250 ℃；升溫程序為50 ℃保持2 min，以3 ℃/min 升溫至80 ℃，保持2 min，以5 ℃/min 升溫至170 ℃，以10 ℃/min 升溫至240 ℃，保持10 min。

MS 條件：電子電離（electronic ionization，EI）；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度250 ℃；質量掃描范圍m/z 30～500[13]。

通過質譜解吸以及與NIST 05 a.L 標準譜庫比對，進行定性分析，采用峰面積歸一化法計算各組分的相對含量。

1.4.2 酒醅微生物群落結構分析

采用DNA 提取試劑盒對酒醅樣品進行微生物基因組DNA 提取，具體步驟參見試劑盒說明，采用1%瓊脂糖凝膠電泳對所提樣本DNA 進行完整性檢測。

以基因組DNA 為模板，采用B341F 和B785R 引物[14]對酒醅樣品中細菌16S rDNA 的V3～V4 區進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，采用ITS1FI2 和ITS2 引物[15]對酒醅樣品中真菌的內部轉錄間隔區（internal transcribed spacer，ITS）序列進行PCR 擴增。PCR 擴增體系：10×PCR buffer 5 μL，dNTPs 2 μL，DNA 模板10 ng，正反向引物各0.5 μmol/L，Taq DNA 聚合酶0.05 U，用雙蒸水補充至50 μL。

細菌PCR 擴增條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共5 個循環；然后95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共20 個循環；最后72 ℃延伸5 min[14]。

真菌PCR 擴增條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s，共計5 個循環；然后94 ℃變性20 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s，共計20 個循環；最后72 ℃延伸5 min[15]。

PCR 產物切膠純化后進行精準定量，依托生工生物工程（上海）股份有限公司進行Illumina MiSeq 高通量測序。

1.4.3 高通量數據處理

采用Cutadapt（v1.9.1）、Prinseq（v0.20.4）及Flash（1.2.3）軟件對高通量測序序列進行質控，包括序列拼接、去掉含有N 的序列、去除引物和接頭、去除質量值＜20 的堿基及長度＜200 bp 的序列及去除嵌合體。

經過質控的序列在97%相似性水平下進行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類分析。利用Silva 數據庫，采用Mothur（1.30.1）軟件在不同物種分類水平下統計每個樣本的群落組成，同時計算各個樣品的覆蓋率以及微生物α 多樣性指數，包括辛普森（Simpson）指數、香農（Shannon）指數、ACE 和Chao1指數。

1.4.4 酒醅揮發性風味物質與微生物相關性分析

本研究選取酒醅樣品微生物高通量測序結果中相對豐度排序在前20 的細菌屬和前20 的真菌屬信息與風味物質進行相關性分析。首先使用RStudio 中的psych 包計算微生物與代謝物之間的spearman 相關系數（r），以r＞0.5 且p＜0.05 為閾值找出可視化對象，然后選用Cytoscape 3.6.1 對微生物和代謝物之間的相互作用關系進行可視化，表征微生物對風味物質的貢獻[11]。

2 結果與分析

2.1 揮發性風味成分的測定結果

利用GC-MS 方法對濃香型白酒酒醅進行主要揮發性風味物質檢測，結果分析發現，酒醅中主要風味成分為酯、醇、酚、烷、酸、烯類等化合物，其中酯類136種、醇類39 種、酸類34 種、酚類12 種、烯烴類8 種、烷類20 種、醛類6 種、酮類9 種、醚類4 種。

白酒發酵過程酒醅樣品中主要酯含量變化見圖1。

圖1 白酒發酵過程酒醅樣品中主要酯含量變化Fig.1 Change of main ester content in fermented grains during Baijiu fermentation

如圖1 所示，本次采集的酒醅樣品中，檢測到豐度較高（平均濃度＞0.1 μg/g）的酯類物質有10 種，分別是己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、己酸己酯、己酸丁酯、庚酸乙酯、乙酸己酯、戊酸乙酯和辛酸乙酯。其中豐度最高的為己酸乙酯，在整個發酵周期內，己酸乙酯平均檢測值到22.45 μg/g，是濃香型白酒的主體香成分，對濃香型白酒風格的形成有重要作用[16-17]，其次為辛酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯以及己酸己酯。從發酵開始，隨著乙醇和多種有機酸的產生，酯類合成開始，發酵至第15 天，酯類總含量達到最高值，發酵末趨于穩定。

白酒發酵過程酒醅樣品中主要酸含量變化見圖2。

圖2 白酒發酵過程酒醅樣品中主要酸含量變化Fig.2 Change of main acid content in fermented grains during Baijiu fermentation

如圖2 所示，酒醅樣品中檢測到的有機酸主要以己酸、乙酸、丁酸、正戊酸和辛酸為主，其總和占總有機酸含量的92.4%，是酯類合成的主要前體物質。其中己酸豐度最高，在整個發酵周期內，每克酒醅樣品中平均檢測到3.72 μg 己酸。

2.2 酒醅微生物α 多樣性分析

采用Illumina Miseq 測序平臺得到白酒酒醅樣品細菌有效序列數42 937～58 935，97%相似水平下的OTU數目為981～2 390；真菌有效序列數為49 546～76 613，OTU 數目為457～759。酒醅樣品微生物α 多樣性結果見表1。

表1 酒醅樣品中細菌和真菌α 多樣性指數Table 1 The α diversity of bacteria and fungi in fermented grains

豐富度指數Chao1 和ACE 越大，表明群落物種豐富度越高；多樣性指數Shannon 越大或Simpson 越小，表明群落物種的多樣性越高。由表1 中細菌α 多樣性指數結果分析發現，在發酵初期（3～6 d），酒醅樣品中Simpson 指數出現最小值，Shannon 指數、ACE 和Chao1 指數均出現最大值，說明在發酵初期酒醅中微生物菌群的豐富度和多樣性最高，推測可能是由于在發酵初期底物充足，來自酒曲、窖池中的多種微生物活躍，呈現了較為豐富的多樣性。隨后多樣性指數及豐富度指數均呈現不同程度下降，隨著發酵的進行，分解原料產生的有機酸、乙醇等物質過多，使一部分微生物不能適應酸度過高的發酵環境，生長受到抑制，到達發酵后期，微生物的多樣性及豐富度均達到最低。真菌α 多樣性指數結果分析發現，酒醅樣品在發酵第3 天，物種豐富度最高，在發酵第33 天，物種多樣性呈現最大值。細菌的豐富度和多樣性高于真菌，本研究結果與其他報道基本一致[9，18]。

2.3 酒醅微生物群落結構分析

基于門水平酒醅中細菌群落結構分析見圖3。

圖3 基于門水平酒醅中細菌群落結構分析Fig.3 Analysis of bacterial community structure of fermented grains based on phylum level

如圖3 所示，基于細菌OTU 注釋分析，酒醅樣品中共得到16 個門，優勢菌門（任一樣品相對豐度≥1%）7 個，非優勢菌門和未注釋（unclassified）門的OTU 歸為其它。其中所有樣品中平均相對含量大于1%的有厚壁菌門（Firmicutes）、菌擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和放線菌門（Actinobacteria）。整個發酵過程中厚壁菌門是豐度最高的優勢門，其相對豐度為27.54%～93.65%。菌擬桿菌門、變形菌門和綠彎菌門在發酵前期豐度較高，隨著發酵的進行相對豐度呈波動式降低，至發酵第60 天相對豐度均低于1%。

基于門水平酒醅中真菌群落結構分析見圖4。

圖4 基于門水平酒醅中真菌群落結構分析Fig.4 Analysis of fungi community structure of fermented grains based on phylum level

如圖4 所示，基于真菌OTU 注釋分析，酒醅樣品共得到8 個真菌門，優勢菌門3 個，其中所有樣品中平均相對含量大于1%的有子囊菌門（Ascomycota）和毛霉門（Mucoromycota）。整個發酵過程中子囊菌門是豐度最高的優勢門，其相對豐度在入料樣品（0 d）中達到91.09%，最后緩慢降低，發酵結束穩定在48.41%。高含量的Ascomycota 對驅動酒醅活性微生物群落變化起重要作用[18]。

基于屬水平酒醅中細菌群落結構分析見圖5。

圖5 基于屬水平酒醅中細菌群落結構分析Fig.5 Analysis of bacterial community structure of fermented grains based on genus level

如圖5 所示，細菌屬水平上，酒醅樣品共檢測到169 種，優勢菌屬（任一樣品相對豐度≥1%）有29 種。其中所有樣品中平均相對含量大于1%的有乳桿菌屬（Lactobacillus）、蚤蠅屬（Levilinea）、普雷沃菌屬（Prevotella）、擬桿菌屬（Bacteroides）、牦牛瘤胃菌（Proteiniclasticum）和Macellibacteroides。未分類菌（unclassified）和未注釋到屬的未知菌在發酵過程中所占比例較高（16.82%～84.61%），表明白酒發酵過程中微生物種屬復雜。

基于屬水平酒醅中真菌群落結構分析見圖6。

圖6 基于屬水平酒醅中真菌群落結構分析Fig.6 Analysis of fungi community structure of fermented grains based on genus level

如圖6 所示，酒醅樣品檢測到真菌屬43 種，優勢菌屬有15 種。其中所有樣品中平均相對含量大于1%的有酵母菌目的未分類屬（unclassified Saccharomycetales）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）、曲霉屬（Aspergillus）、Naumovozyma、假絲酵母屬（Candida）、酵母屬（Saccharomyces）、青霉菌屬（Penicillium）和鐮刀霉（Fusarium），這與我國其它濃香型白酒產區相關研究中優勢屬種類一致性較高[9，19]。

2.4 微生物與風味物質的相關性分析

酒醅樣品微生物與主要風味物質的相關性分析如圖7 所示。

圖7 酒醅樣品主要微生物與風味物質相關性分析Fig.7 Correlation network between main microbial genera and volatile compounds

如圖7 所示，相關性分析中共有238 個有效連接點，其中真菌Thermomyces、Naumovozyma 和Saccharomyces 是連接度最大的3 個真菌屬（26，20，17），細菌Lactobacillus、醋酸桿菌（Acetobacte）和梭狀芽孢桿菌XlVa（Clostridium XlVa）是連接度最大的3 個細菌屬（18，10，10）。濃香型白酒四大酯類物質分別為己酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯和乙酸乙酯，相關性分析發現Naumovozyma、Aspergillus、Thermomyces、Saccharomyces和Candida 與己酸乙酯（V24）具有較強相關性；擬桿菌屬（Bacteroides）和Lactobacillus 與乙酸乙酯（V5）具有較強相關性；Aspergillus 與丁酸乙酯（V4）強相關；Naumovozyma、Thermomyces、Fusarium、根毛霉屬（Rhizomucor）、孢圓酵母（Torulaspora）、Acetobacter 和梭狀芽孢桿菌IV（Clostridium IV）與乳酸乙酯（V16）具有較強相關性。Naumovozyma、Thermomyces、Saccharomyces、Candida 和Lactobacillus 與醇類物質有關聯，Lactobacillus和Thermomyces 與酸類物質呈正相關。

綜上，Spearman 相關性結果顯示，在濃香型白酒發酵過程中，Thermomyces、Naumovozyma、Saccharomyces、Lactobacillus、Acetobacte、Clostridium、Candida和Aspergillus 對酯、醇等主要風味物質的產生具有顯著貢獻作用。Saccharomyces 和Lactobacillus 同樣是劉凡等[9]和王鵬等[11]的研究中與濃香型白酒主要風味物質相關的核心和關鍵酒醅微生物。

3 結論

采用氣相色譜-質譜聯用法和高通量測序技術檢測濃香型白酒連續發酵的酒醅樣品中揮發性風味物質變化和微生物群落結構組成。結果顯示，發酵過程中共檢測到揮發性風味成分268 種，其中酯類136 種、醇類39 種、酸類34 種、酚類12 種、烯烴類8 種、烷類20 種、醛類6 種、酮類9 種、醚類4 種。己酸乙酯是豐度最高的酯類物質，構成了濃香型白酒的主體香成分。高通量測序結果結果表明，發酵過程中酒醅樣品細菌的豐富度和多樣性高于真菌，厚壁菌門（Firmicutes）和子囊菌門（Ascomycota）分別是豐度最高的優勢細菌門和真菌門。平均相對豐度大于1%的優勢細菌屬有乳桿菌屬（Lactobacillus）、蚤蠅屬（Levilinea）和普雷沃菌屬（Prevotella）等；優勢真菌屬有酵母菌目的未分類屬（unclassified Saccharomycetales）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）和曲霉屬（Aspergillus）等。主要微生物與揮發性風味物質的相關性網絡連接圖顯示，Thermomyces、Naumovozyma、酵母屬（Saccharomyces）、Lactobacillus、醋酸桿菌（Acetobacte）、梭狀芽孢桿菌屬（Clostridium）、假絲酵母屬（Candida）和Aspergillus 是濃香型白酒揮發性風味物質產生的主要貢獻微生物。