油莎豆對大鼠的致畸作用研究

李春鑫，于美琴，楊海龍，2，宋萬獻，張 戈，王會偉，

（1．河南省農業科學院經濟作物研究所，河南 鄭州 450002；2．鄭州市農林科學研究所，河南 鄭州 450005）

油莎豆是目前已知唯一在塊莖中大量積累油分的植物[1]，因其單產高、適應性廣、病蟲害少、營養價值豐富及綜合利用價值高等優點[2]，成為新世紀我國擴大糧油自主供給能力的理想作物。2019年科技部立項攻關油莎豆產業鏈關鍵技術，并進行集成示范，2022 年，農業農村部首次將油莎豆列入《“十四五”全國種植業發展規劃》。由此，油莎豆產業化正式進入新的快速發展階段。

油莎豆作為一種高綜合利用價值作物，可用于榨油、制作面粉、釀酒、制作豆漿和豆奶以及成分提取等[3-4]，是典型的食用農產品。目前，油莎豆及其制品在歐洲、非洲、北美、澳新等國家都非常流行，被稱為“來自上帝的休閑食品”[1]，到2020 年，油莎豆產業總值已超過20 億美元[5]。同時，隨著研究的深入，發現油莎豆可以有效清除人體內的自由基[6]，對預防人體多種癌癥、高血糖、高血脂、消化道疾病等方面均具有顯著作用[7-9]，具有廣闊的藥食同源潛力，在世界范圍內有望成為重要的健康食物來源。

我國油莎豆的種植已有近70 年的歷史[1]，但由于油莎豆原產地是非洲[2]，一直未正式進入我國的新食品原料目錄，嚴重制約了我國油莎豆的產業化發展。根據我國《新食品原料安全性審查管理辦法》規定，需要對外來物種的食品安全性進行評估，以檢測其具有的食品原料特性，是否符合新食品原料應有的營養要求，且無毒、無害，對人體健康不造成任何急性、亞急性、慢性或者其他潛在性危害。

據此，本文以黃淮產區主栽品種豫油莎2 號為原料開展不同濃度油莎豆對大鼠的致畸試驗，明確油莎豆的遺傳毒理特征表現，探討油莎豆食用致畸作用。本文研究結果將為油莎豆食用安全的科學評估提供數據支持，進一步提高對油莎豆食用性的了解，為解決油莎豆產品入市的法規障礙、緩解我國健康糧油自主供給能力提供助力。

1 材料與方法

1.1 受試物

油莎豆，15 kg，鮮豆（塊莖），由河南省農業科學院經濟作物研究所提供，受試樣品在4 ℃、干燥條件下貯藏，無需避光。取13 kg 樣品，粉碎后收集到12.7 kg粉末作為受試物。

1.2 動 物

選用SPF 級健康性成熟SD 大鼠，雌性（未交配過）100 只，雄性50 只，均為3 月齡，由邳州市東方養殖有限公司提供，生產許可證號SCXK（蘇）2017-0003，合格證編號202135129。

1.3 飼養條件

試驗動物在溫度為20～26 ℃、相對濕度為40%～70%的本中心屏障環境中飼養。實驗動物使用許可證號SYXK（蘇）2020-0006。輻照滅菌飼料由江蘇省協同醫藥生物工程有限責任公司提供，生產許可證：蘇飼證（2019）01008。

1.4 劑量分組及樣品配制

根據《GB 15193.14-2015 食品安全國家標準 致畸試驗》中的規定，以受試物最大配制濃度最大灌胃體積作為高劑量組，即8 g/kg組。設定2、4 g/kg分別為低、中劑量組。另設1個溶劑對照（0 g/kg）。受試樣品用純水配制，高、中、低劑量組配制濃度分別為800、400、200 mg/mL，受試物新鮮配制，每日在同一時間灌胃1 次，根據母體體質量調整灌胃體積。灌胃體積為10 mL/kg，各組灌胃體積一致。溶劑對照組以純水代替受試物。

1.5 主要試劑與儀器

1.5.1 儀器與器材體視顯微鏡、T-1000 型電子天平、JJ-100型電子天平、0-150 mm游標卡尺。

1.5.2 試劑茜素紅、氫氧化鉀、甘油、固定液（Bouins液），均購自國藥集團化學試劑有限公司。配制主要試劑，茜素紅染液：取茜素紅0.1 g，氫氧化鉀10 g，用蒸餾水稀釋至1 000 mL。透明液A：甘油200 mL，氫氧化鉀10 g，蒸餾水790 mL 混合。透明液B：甘油與蒸餾水等量混合。

1.6 試驗方法

將性成熟雌、雄大鼠按1∶1同籠，每日早晨檢查陰栓，確定是否受孕。發現陰栓當日作為受孕0 天。如果5 d 內未發現陰栓，更換雄鼠。檢出的孕鼠按體質量隨機分為4組，每組不少于16只。在受孕的第6～15 天，2、4、8 g/kg 組分別給予相應濃度的油莎豆，溶劑對照組以純水代替受試樣品，按10 mL/kg 灌胃，每天1 次。受孕第0、6、9、12、15、20 天稱量，并調整給受試物的量。

試驗期間每天觀察孕鼠的一般情況，于妊娠第20天采用CO2麻醉法處死孕鼠，剖腹取出子宮，稱子宮連胎質量，記錄并檢查黃體數、著床數、吸收胎、早死胎、晚死胎及活胎數。活胎鼠記錄胎仔體質量、體長并檢查胎鼠外觀有無畸形。

將每窩1/2的活胎于Bouins液中固定2周后，進行徒手切片作內臟檢查；將每窩1/2 活胎去皮、去內臟及脂肪后，放入茜素紅溶液染色，當天搖動2～3 次，待骨骼染成紅色時為止。將胎鼠放入透明液A 中1～2 d，換入透明液B中2～3 d。待胎鼠骨骼已染紅，而軟組織的紫紅色基本褪去，換置甘油中，觀察骨骼畸形。

1.7 觀察指標

母體體質量、體質量增量（處死時母體體質量-孕期第6天體質量）、子宮連胎質量、體質量凈增量（處死時母體體質量-子宮連胎質量-孕期第6天體質量）、著床數、黃體數、吸收胎數、活胎數、死胎數及百分率、胎仔的體質量及體長、有畸形的胎仔數（包括外觀、骨骼和內臟畸形），有畸形胎仔的窩數及百分率、單項畸胎率和總畸胎率。

1.8 統計學方法

使用SPSS 22.0 軟件進行數據處理與分析。率的比較使用卡方檢驗，孕鼠體質量增量用方差分析，胎鼠體長、體質量、窩平均活胎數、子宮連胎盤重用單因素方差分析，以α=0.05為檢驗水準。胎鼠的數據以窩為單位進行統計。

2 結 果

2.1 油莎豆對孕鼠一般情況和體質量的影響

試驗結束時，溶劑對照組實際孕鼠數為18 只，2 g/kg 組實際孕鼠數為19只，4 g/kg 組實際孕鼠數為16只，8 g/kg組實際孕鼠數為17只。各組其它未孕大鼠在第20天剖檢后未發現明顯異常，作淘汰處理。

各劑量組孕鼠在觀察期內精神狀態、一般活動未發現異常體征，第20天處死后大體解剖肉眼均未見明顯異常。

由表1 可見，油莎豆2、4、8 g/kg 組孕鼠初始體質量與溶劑對照組相比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。即孕鼠的初始體質量在各組間較為均衡。

表1 油莎豆對孕鼠體質量及其增量的影響（±s，g）

表1 油莎豆對孕鼠體質量及其增量的影響（±s，g）

組別對照組油莎豆2 g/kg 4 g/kg 8 g/kg孕鼠數/只18 19 16 17第0天270.6±18.1 267.0±20.7 266.4±30.0 270.6±39.2第6天313.3±26.8 311.2±24.5 314.1±30.7 314.2±36.3第9天328.6±28.6 326.3±23.3 326.7±31.2 326.8±36.9第12天352.8±26.8 348.1±24.7 344.9±31.9 348.8±35.1第15天376.7±32.5 369.3±28.1 370.9±32.3 368.6±37.8第20天431.6±43.5 427.9±34.0 431.1±47.7 428.4±41.7體質量增量118.2±24.5 116.8±19.9 116.9±25.1 114.2±16.6體質量凈增重44.5±12.1 41.6±16.2 40.6±16.0 35.7±8.3

經口給予孕鼠不同劑量的油莎豆，第6 天、第9天、第12 天、第15 天、第20 天孕鼠體質量、體質量增量及體質量凈增量進行方差齊性檢驗，各項指標均滿足方差齊的要求，用單因素方差分析進行統計處理。結果可見，油莎豆2、4、8 g/kg 組孕鼠第6 天、第9 天、第12 天、第15 天、第20 天的體質量、體質量增量及體質量凈增量與溶劑對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 油莎豆對大鼠胚胎發育的影響

大鼠胚胎發育指標的檢測結果見表2。油莎豆2 g/kg 組，吸收胎率、活胎率與溶劑對照組比較差異雖有統計學意義，但數值均在正常值范圍內，且無劑量-反應關系，不認為具有不良生物學意義。其他各劑量組各項指標與溶劑對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

表2 油莎豆對大鼠胚胎發育的影響

2.3 油莎豆對胎鼠外觀畸形的影響

對照組及油莎豆2、4、8 g/kg 組孕鼠數量分別為230、250、218和231只。分別對胎鼠外觀畸形所包含的腦膨出、露腦、腦裂、小頭小腦小眼、兔唇、下頜裂、腹裂、腹疝、臍疝、脊柱彎曲、脊柱裂、小肢、短肢、并趾、多趾、無趾、無尾、短尾、無肛門、骶尾裂的數量進行了統計。結果顯示對照組及油莎豆2、4、8 g/kg 組胎鼠均無外觀畸形。各劑量組各項外觀畸形指標和外觀畸胎率與溶劑對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

2.4 油莎豆對胎鼠骨骼發育和骨骼畸胎率的影響

統計各濃度組胎鼠枕骨發育不全、頭骨缺損、頸椎畸形、腰椎畸形、胸椎畸形、底椎畸形、尾椎畸形、骨盆畸形、四肢骨畸形、腕骨畸形、掌骨畸形、趾骨畸形、肋骨畸形（14 肋）的表現，發現其結果均為0。而在骨化遲緩所涉及的胸骨、胸椎體及腰椎體的表型結果則表現為與油莎豆投喂與否無關聯，其中，油莎豆2 g/kg 組胎鼠胸骨骨化遲緩與對照組比較差異雖有統計學意義，但數值在正常值范圍內，且無劑量-反應關系（表3），不認為具有不良生物學意義。其他各劑量組各項指標與對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

表3 油莎豆對胎鼠骨骼發育的影響

同時，油莎豆2、4、8 g/kg 組胎鼠單項骨骼畸胎率和總骨骼畸胎率與對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

2.5 油莎豆對胎鼠內臟發育的影響

通過對胎鼠的腦、眼球、脊髓、心、主動脈弓、食道、氣管、肺、膈肌、肝、腎、膀胱、生殖器、鼻道的檢測，發現油莎豆2、4、8 g/kg 組及對照組均未見明顯內臟畸形。

因此，油莎豆2、4、8 g/kg 組胎鼠內臟發育畸形與對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

2.6 油莎豆對孕鼠總畸胎率的影響

綜合以上檢測結果，油莎豆2、4、8 g/kg 組孕鼠總畸胎率與對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

3 討 論

油莎豆作為原產于北非-地中海沿岸的引進型經濟作物，既可生吃也可榨油，在非洲有數千年的食用歷史[10]，在我國的食用歷史也已超過30年，但因無正式相關評估試驗數據和相關報道，按照國家衛生健康委員會的建議，開展食用致畸性試驗評估。致畸試驗是食用安全風險評估的重要內容之一，本實驗采用的評估方法符合致畸試驗程序，但具體的考察指標相比其他受試物更加詳盡[11-12]，可以較客觀的反映油莎豆的真實致畸風險。

油莎豆在非洲國家有較長的食用歷史，長期食用油莎豆有助于預防心臟病和血栓形成，改善血液循環，降低患癌癥的風險[13-14]，同時其含有多種活性成分[15]，是一種天然抗氧化劑[16-18]。但對于包括中國在內的許多國家和地區，油莎豆并非傳統食物，在規模化市場推廣前，亟須開展包括致畸試驗在內的遺傳毒理試驗。

由試驗結果可以看出，對于SPF級SD大鼠于受孕的第6～15 天經口給予油莎豆2、4、8 g/kg 的濃度處理，孕鼠在體質量、胚胎發育、胎鼠外觀、胎鼠骨骼發育和骨骼畸胎率等幾個致畸指標方面無明顯差異，絕大部分檢測結果均為0 或差異無統計學意義（P＞0.05）。胎鼠內臟發育和畸胎率在2、4、8 g/kg 組及對照組均未見有內臟畸形。

綜上，在本實驗條件下，油莎豆對SD 大鼠無致畸風險，其母體毒性和胚胎發育毒性的NOAEL 均為8 g/（kg·d）。本實驗為油莎豆食用安全風險評估提供了重要參考，推進了油莎豆毒理學研究發展。