刺五加-靈芝雙向固體發(fā)酵工藝優(yōu)化及抗氧化活性評價

孫琳, 井長欣, 鄒睿, 辛宇, 張曉旭, 邱智東, 王偉楠

(長春中醫(yī)藥大學藥學院, 長春 130117)

刺五加[Acanthopanaxsenticosus(Rupr. Maxim.) Harms]是五加科五加屬的藥食同源植物,在中國東北與河北等地分布較為廣泛,具有補中益精、健脾安神等功效,因其保健功效與人參相近,故民間習稱其為“五加參”[1-4]。截止到目前,已有大量研究報道了刺五加提取物及其富含的單體化學成分對神經(jīng)、代謝、心腦血管及免疫系統(tǒng)具有生物活性,不同程度地闡明了其抗心肌損傷、抗氧化、抗腫瘤、抗衰老和調(diào)節(jié)血糖、血壓等作用機制,證明了其存在極高的經(jīng)濟社會利用價值和極大的待開發(fā)潛力[5-9]。然而,刺五加藥用部位質(zhì)地較為堅硬、組織致密,不利于活性成分的提取、溶出與生物利用;另外,刺五加提取物在高劑量應用時會產(chǎn)生不同程度的不良反應,而低劑量應用則生物活性并不顯著[10]。所以,如何通過綠色的方法破壞刺五加藥材非藥用組織結(jié)構(gòu)的壁壘、深度利用其活性成分,以提高藥效并降低副作用,成為了當前刺五加藥材開發(fā)的主要桎梏。

生物發(fā)酵是一種利用微生物自身代謝能力改造環(huán)境物質(zhì)基礎的技術(shù),在中藥材綠色加工和生物防治中的應用非常廣泛[11]。通過微生物的代謝行為,可以對中藥材進行有效的品質(zhì)改良和成分提取,其主要的實施形式包括菌絲體發(fā)酵、細胞-微生物共培養(yǎng)和固體發(fā)酵[12]。雙向固體發(fā)酵技術(shù)是以藥用真菌為菌種發(fā)酵藥材,發(fā)酵過程中利用藥材中的非藥用組織和成分為微生物的生長提供營養(yǎng)物質(zhì),并通過微生物自身的代謝行為轉(zhuǎn)化藥材原化學成分,形成新的功效物質(zhì)基礎[13-14],該方法可以有效地降解一些難以破碎的藥材組織,高效釋放其中的活性成分,通過生物轉(zhuǎn)化降低藥材毒性,并增加一些功效成分的生物利用度,以起到“增效減毒”的作用[15-16]。目前已有包括人參、雷公藤、馬錢子、大黃、黃芪和西洋參等幾十種中藥材構(gòu)建了雙向固體發(fā)酵體系,為解決一些傳統(tǒng)中藥開發(fā)應用的弊病提供了有力的解決方案[17-21]。在構(gòu)建雙向發(fā)酵組合時,首要考慮的是藥材與藥用真菌之間的生物活性兼容性。鑒于刺五加和靈芝性味相近、均富含豐富的抗氧化物質(zhì),因此,二者的有機結(jié)合具有極大的抗氧化活性提升潛力[22-23]。然而,在雙向發(fā)酵的實際操作過程中,由于藥材質(zhì)地、主要化學成分的抑菌性、細胞毒性及所含碳/氮源等其他因素的影響,并不是任意的中藥-真菌組合都能展現(xiàn)出優(yōu)良的發(fā)酵效果,因此需要進行系統(tǒng)的因素考察與參數(shù)優(yōu)化,以在最短的發(fā)酵周期內(nèi)獲得最大的生物量[24]。為了實現(xiàn)刺五加-靈芝雙向固體發(fā)酵體系的構(gòu)建,現(xiàn)首先采用單因素實驗對發(fā)酵工藝中的基本參數(shù)和生長因子品種進行考察,通過統(tǒng)計學設計和響應曲面分析,優(yōu)化并驗證發(fā)酵過程中的生長因子添加量,以確定最優(yōu)發(fā)酵工藝,并對發(fā)酵前后的刺五加藥材進行抗氧化活性的比對和評價,以期為刺五加發(fā)酵產(chǎn)物的工業(yè)化制備及產(chǎn)品開發(fā)利用提供良好的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

靈芝菌(Ganodermalingzhi)(菌種編號:CICC 14002)購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;刺五加(Acanthopanaxsenticosus)購自吉林大藥房。

瓊脂粉、葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨、維生素B1購自北京Solarbio Science &Technology公司;CaCO3、CaCl2、MgSO4、MgCl2、MnSO4、MnCl2、CuSO4、KH2PO4、NaCl、HClO4、香草醛購自西隴化工股份有限公司;齊墩果酸對照品購自上海源葉生物科技有限公司;CH3OH、CH3COOH、C4H8O2、CHCl3購自北京化工廠;DPPH(二苯代苦味肼基)自由基清除能力測試試劑盒、SOD(超氧化物歧化酶)檢測試劑盒、總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒購自北京Solarbio Science &Technology公司。

立式壓力蒸汽滅菌器購自愛來寶(濟南)醫(yī)療科技有限公司;HY60恒溫搖床購自武漢匯誠生物科技有限公司;EL204電子天平、MS105DU電子天平購自瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司;DFY-200C粉碎機購自上海皓莊儀器有限公司;HH-M8水浴鍋購自上海Herry Tech有限公司;微生物培養(yǎng)箱、超凈工作臺購自美國Thermo公司;SpectraMax i3x酶標儀購自Molecular Devices公司;L5S紫外分光光度儀購自上海科曉科學儀器有限公司;高速冷凍離心機購自廣州吉迪儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基制備

固體培養(yǎng)基:馬鈴薯去皮切塊,加蒸餾水加熱,趁熱過濾,濾液中加入瓊脂和葡萄糖,完全溶解后補充水分(馬鈴薯20%,葡萄糖2%,瓊脂2.4%, pH自然),趁熱迅速將溶液分裝于試管中,121 ℃滅菌20 min。

液體培養(yǎng)基:精密稱定葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、酵母浸粉2 g、KH2PO41 g、MgSO40.5 g、CaCO30.1 g、MnSO40.1 g、維生素B110 mg,溶于1 000 mL蒸餾水中,充分溶解后于121 ℃滅菌20 min。

1.2.2 靈芝菌活化

使用接菌環(huán)刮取適量復蘇后的靈芝菌菌絲體,劃線接種于新的固體培養(yǎng)基中,設定培養(yǎng)條件為溫度28 ℃,濕度40%,培養(yǎng)7～8 d,至白色菌絲鋪滿整個斜面,備用。

1.2.3 靈芝菌種子液培養(yǎng)

使用接菌環(huán)刮取適量靈芝菌斜面孢子至液體培養(yǎng)基中,稀釋至1×107spores/mL,于28 ℃、130 r/min條件下培養(yǎng)5～6 d,即為一級種子液;將一級種子液按5%接種量接入新鮮液體培養(yǎng)基中,于28 ℃,130 r/min條件下培養(yǎng)6～7 d,當瓶子內(nèi)布滿均勻分布的星芒樣菌絲球時,即為二級種子液,備用。

1.2.4 刺五加-靈芝雙向固體發(fā)酵培養(yǎng)

稱取10 g刺五加藥材,剪碎并在錐形瓶中與一定體積的蒸餾水混合均勻,121 ℃,30 min高壓滅菌一次,振搖松散后,備用。利用減壓抽濾的方法在無菌濾膜上收集靈芝菌二級種子液中的菌絲體,然后按照一定比例與刺五加基質(zhì)進行混合。在28 ℃,相對濕度40%條件下避光放置培養(yǎng),當瓶子內(nèi)部出現(xiàn)明顯菌蕾結(jié)構(gòu)、布滿菌絲時,結(jié)束發(fā)酵。

1.2.5 刺五加-靈芝雙向固體發(fā)酵工藝優(yōu)化

1)單因素實驗設計

以1.2.4節(jié)下培養(yǎng)條件,對刺五加不同粉碎粒度(10、24、50、65、80目);藥材粉末加水量(體積/質(zhì)量,mL/g,20%,30%,40%,50%,60%);不同比例靈芝菌接種量(靈芝菌絲體濕重∶刺五加固體培養(yǎng)基干重,質(zhì)量/質(zhì)量,g/g,0.5∶1,1∶1,1.5∶1,2∶1,2.5∶1),生長因子種類(10 mmol/kg MnCl2、CuSO4、MgCl2、CaCl2、NaCl)及生長因子水平(10、20 、40 、80、160 mmol/kg)進行單因素考察。

2)響應曲面實驗設計

在單因素實驗的基礎上,以MnCl2(A)、NaCl(B)、CaCl2(C)添加量為自變量,以菌蕾干重和菌蕾總?cè)坪繛榭疾熘笜?將實驗因素和水平分別設置3個,優(yōu)化生長因子在刺五加藥材基質(zhì)中的相對加入量,Box-Behnken實驗參數(shù)設置如表1所示。

表1 中心組合實驗參數(shù)設置表

1.2.6 靈芝菌蕾干重及總?cè)坪繙y定

1)菌蕾干重測定方法

刺五加-靈芝雙向固體發(fā)酵至30 d后,分離菌蕾與刺五加藥材,清洗菌蕾表面,降低有效部位混雜的可能性,將清洗后的菌蕾放入50 ℃真空干燥箱內(nèi)干至恒重后稱重,收集至干燥器內(nèi)保存。

2)菌蕾總?cè)坪繙y定方法[25]

供試品及對照品溶液的制備:精密稱定干燥后的靈芝菌蕾0.1 g,剪碎后在20倍體積的CHCl3中浸泡30 min,超聲提取2次,每次1 h,過濾后合并濾液并蒸干,加入CH3OH溶解定容至1 mg/mL即為供試品溶液。精密稱定5 mg齊墩果酸對照品,于25 mL容量瓶中加入CH3OH溶解定容至0.2 mg/mL即為對照品溶液。

標準曲線的繪制:分別精密量取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL對照品溶液于試管中水浴蒸干并放涼,精密加入0.8 mL HClO4、0.2 mL現(xiàn)制的5%香草醛-冰醋酸溶液,搖勻后于70 ℃水浴條件下加熱15 min,隨即冰浴5 min,精密加入4 mL C4H8O2,搖勻。在546 nm波長下,以無對照品加入的顯色劑為空白,測定吸光度,繪制標準曲線,其中橫坐標為對照品濃度,縱坐標為吸光度,得回歸方程:Y=0.056 5X+0.013 9,R2=0.999 7。

三萜含量測定:于試管中精密量取0.2 mL供試品溶液,按照“標準曲線的繪制”操作步驟,從“水浴蒸干”開始,同流程測定吸光度,將其代入回歸方程中求出總?cè)坪俊?/p>

1.2.7 刺五加-靈芝雙向固體發(fā)酵產(chǎn)物的體外抗氧化活性評價

1)刺五加發(fā)酵產(chǎn)物和靈芝藥材活性部位制備

參照《中國藥典》2020年版中“刺五加浸膏”項下方法進行制備[26],流程簡述如下:分別稱取相同重量的刺五加-靈芝發(fā)酵產(chǎn)物、刺五加藥材、靈芝藥材以及刺五加-靈芝等比混合物(質(zhì)量比為1∶1)的干燥粉末,加入10倍量75%乙醇溶液,回流12 h后過濾,濃縮濾液至無醇味的浸膏,在-100 ℃、99 Pa條件下凍干至恒重,備用。

2)DPPH自由基清除能力測定

參考何源等[27]描述的測定方法,分別精密稱定刺五加發(fā)酵產(chǎn)物提取物、刺五加提取物、靈芝提取物和刺五加-靈芝混合提取物各10 mg,采用無水乙醇溶解后定容至10 mL,得1 mg/mL的母液。將4種母液分別稀釋成120、160、200、240、300、400 μg/mL的供試品溶液,以評價其對DPPH自由基的清除能力,每個樣品3個復孔。將供試品溶液與試劑盒中反應試劑混合均勻后,避光室溫放置30 min,保持溫度恒定,酶標儀檢測波長設置為517 nm,測定此條件下不同組別的吸光度值,計算清除率C,公式為

(1)

式(1)中:A0為蒸餾水對照的吸光度值;A1為供試品的吸光度值;A2為供試品溶劑的空白對照吸光度值。

3)SOD活力測定

按照試劑盒中步驟進行測定。分別精密量取刺五加發(fā)酵產(chǎn)物提取物、刺五加提取物、靈芝提取物和刺五加-靈芝混合提取物20 mg,采用無水乙醇溶解后定容至10 mL,得2 mg/mL的母液。將4種母液分別稀釋成0.6、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0 mg/mL的供試品溶液。測定供試品對SOD的活力大小,每個樣品重復測定3次,SOD活力計算公式為

(2)

式(2)中:OD為測定管OD值;OD0為對照管OD值。

4)T-AOC的測定

參考試劑盒提供的方法進行測定。分別精密量取刺五加發(fā)酵產(chǎn)物提取物、刺五加提取物、靈芝提取物和刺五加-靈芝混合提取物10 mg,采用無水乙醇溶解后分別配制成1 mg/mL的母液。將4種母液稀釋成120、160、200、240、300、400 μg/mL的供試品溶液。測定以上供試品的總抗氧化能力,每個樣品3個復孔。為每個樣品做一個自身對照孔(即10 μL樣本和180 μL蒸餾水混合后,靜置6 min,405 nm處讀吸光度值)排除待測樣品的顏色干擾,將樣本測定吸光度值(每個樣品測定孔的吸光度值減去每個樣本對應的自身對照孔的吸光度值)帶入標準曲線計算。稱取27.8 mg FeSO4·7H2O標準品,溶解定容到1 mL,濃度為100 mmol/L,將此溶液分別稀釋至0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、2.1、3和4.2 mmol/L。擬合上述不同濃度標準品的吸光度值與其相應的濃度梯度后繪制標準曲線,將樣品測定管的吸光度值代入曲線方程,即可得到結(jié)果。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

響應曲面實驗由Design-Expert 12.0.3.0軟件設計;其他相關數(shù)據(jù)與圖表,均經(jīng)過GraphPad Prism及Origin Pro軟件處理得到。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果與分析

2.1.1 刺五加粉碎粒度對發(fā)酵周期的影響

如圖1所示,刺五加不粉碎或粉碎粒度過小都會導致發(fā)酵周期大幅增長。粒度過小會導致空氣流通性差,阻礙菌液滲入、菌絲生長,延長發(fā)酵周期,因此粒度控制為10目最為適宜。

圖1 底物粉碎粒度對發(fā)酵周期的影響

2.1.2 培養(yǎng)基加水量對發(fā)酵周期的影響

如圖2所示,培養(yǎng)基加水量的高低會顯著影響靈芝菌的生長狀態(tài)。加水量低時,不足以為菌的生長提供充足的水分;而加水量過高則會降低發(fā)酵基質(zhì)中氧氣的含量和空氣的流通,導致發(fā)酵不充分及發(fā)酵周期過長。因此刺五加藥材基質(zhì)的加水量以40%最為適宜。

圖2 基質(zhì)加水量對發(fā)酵周期的影響

2.1.3 不同比例靈芝菌接種量對發(fā)酵周期的影響

如圖3所示,接種量過少會增加發(fā)酵時間,而接種量過大則會引入更多水分含量,培養(yǎng)基的干濕平衡容易被破壞從而影響空氣流通,干擾靈芝菌菌絲的生長,同時也會增大發(fā)酵成本。故接種量控制在靈芝菌絲體濕重∶刺五加固體培養(yǎng)基干重為2∶1時較為適宜,發(fā)酵完全所用時間較短。

圖3 不同比例靈芝菌接種量對發(fā)酵周期的影響

2.1.4 不同生長因子加入對發(fā)酵周期的影響

如圖4所示,當生長因子為CuSO4或MgCl2時,其二者對發(fā)酵周期的影響均較小,而當生長因子為MnCl2、NaCl、CaCl2時,可較大程度地縮短發(fā)酵時間,故選用MnCl2、NaCl、CaCl2作為發(fā)酵時添加的生長因子。

圖4 不同生長因子對發(fā)酵周期的影響

Mn2+、Na+和Ca2+能夠正向促進靈芝菌生長代謝,進一步通過單因素實驗考察了不同摩爾濃度MnCl2、NaCl和CaCl2對靈芝菌固體發(fā)酵刺五加過程中生長周期的影響[28-31]。結(jié)果如圖5所示,MnCl2和NaCl在10～40 mmol/kg區(qū)間內(nèi)能夠逐步降低靈芝菌的發(fā)酵周期,當二者濃度達到80 mmol/kg以上時,發(fā)酵速度顯著降低,因此選擇0～100 mmol/kg的區(qū)間進行響應曲面分析與優(yōu)化;CaCl2的趨勢與以上兩種生長因子存在一定差異,在10～80 mmol/kg區(qū)間內(nèi)能夠逐步降低靈芝菌的發(fā)酵周期,而濃度達到160 mmol/kg以上后,發(fā)酵周期顯著增加,因此選擇30～150 mmol/kg的區(qū)間進行響應曲面分析與優(yōu)化。

圖5 不同生長因子濃度對發(fā)酵周期的影響

2.2 響應面優(yōu)化刺五加-靈芝雙向固體發(fā)酵工藝

2.2.1 Box-Behnken實驗結(jié)果

單位發(fā)酵時間內(nèi),菌蕾干重的累積與微生物代謝藥材基質(zhì)的速度呈現(xiàn)正相關,可以用來表征發(fā)酵效率[32-33]。三萜作為靈芝主要功效物質(zhì),其含量會影響刺五加發(fā)酵產(chǎn)物的生物活性[34]。刺五加雙向發(fā)酵的目的是為了開發(fā)具有潛在保健功效的健康產(chǎn)品原料,所以在工藝優(yōu)化過程中分別考察了不同生長因子組合對這兩項指標的影響。因此基于單因素考察結(jié)果,采用Box-Behnken中心組合實驗設計(如表2所示),優(yōu)化刺五加-靈芝雙向固體發(fā)酵工藝。

表2 中心組合實驗設計結(jié)果

2.2.2 響應面方差分析

通過Design-Expert12.0.3.0軟件對Box-Behnken實驗結(jié)果進行多元回歸分析,得到下述兩個回歸方程。

Y1=0.85+0.055A+0.15B+0.12C+0.056AB+0.024AC-0.036BC-0.11A2-0.14B2-

(3)

Y2=22.08+0.61A+0.56B+2.14C+0.93AB-0.34AC+0.68BC-1.77A2-2.87B2-

(4)

式中:A、B、C分別為MnCl2、NaCl、CaCl2的添加量;Y1、Y2分別為靈芝菌蕾干重、菌蕾總?cè)坪俊?/p>

表3 菌蕾干重模型單因素方差分析結(jié)果

表4 菌蕾總?cè)坪磕Ｐ蛦我蛩胤讲罘治鼋Y(jié)果

2.2.3 因素間交互作用分析及最佳工藝驗證

利用Origin Pro軟件處理得到3D響應面圖和等高線圖。當?shù)雀呔€為圓形時自變量對響應變量的影響無顯著性,橢圓形或馬鞍形的等高線代表自變量對響應變量有顯著影響,交互作用的曲面坡度越大,其響應程度越高[39]。如圖6所示,Mn2+與Na+的交互作用對菌蕾干重的影響最為顯著,在0～80 mmol/kg范圍內(nèi),隨著Na+濃度的提高,菌蕾干重顯著增加;其次為Na+與Ca2+的交互作用,而Mn2+與Ca2+的交互作用對菌蕾干重的影響不大。

圖6 不同生長因子對靈芝菌蕾生物量的交互影響

菌蕾總?cè)坪糠治鋈鐖D7所示,各因素交互作用對總?cè)坪康挠绊戁厔菖c菌蕾干重一致,同樣為Mn2+與Na+>Na+與Ca2+>Mn2+與Ca2+。雖然在優(yōu)化發(fā)酵工藝的過程中發(fā)現(xiàn),菌蕾干重與總?cè)坪孔罡唿c所對應的生長因子組合并沒有完全重合,但是綜合考慮發(fā)酵周期、菌質(zhì)總得率以及各因素交互作用的相同趨勢,最終以菌蕾干重作為主要指標對刺五加-靈芝雙向發(fā)酵工藝進行優(yōu)化和驗證。

圖7 不同生長因子對菌蕾總?cè)坪康慕换ビ绊?/p>

以菌蕾總干重為主要響應值,通過軟件得到刺五加-靈芝雙向發(fā)酵體系中生長因子組成最優(yōu)比例為:MnCl2(83.78 mmol/kg),NaCl(55.82 mmol/kg),CaCl2(148.964 mmol/kg),預測菌蕾總干重為0.934 g。將理論預測的最優(yōu)發(fā)酵條件調(diào)整為MnCl2為84 mmol/kg、NaCl為56 mmol/kg、CaCl2為149 mmol/kg后通過3次實驗進行驗證,結(jié)果顯示發(fā)酵后靈芝菌蕾的平均干重為0.920 4 g,標準偏差為0.12%,實測值和預測值之間具有較高擬合度,證明優(yōu)化發(fā)酵條件具有實際應用價值。

2.3 刺五加-靈芝雙向固體發(fā)酵產(chǎn)物的體外抗氧化活性評價

活性氧自由基是許多體內(nèi)代謝過程的副產(chǎn)物,可以通過誘導氧化應激反應造成正常細胞的顯著損傷,誘使加快衰老或產(chǎn)生其他相關疾病。大量文獻證明,刺五加提取物具有有效的清除活性氧自由基能力,可明顯提升抗氧化酶的活力,并可通過降低脂質(zhì)過氧化程度從而減少由氧化應激引起的機體損傷[5,40-41]。目前,關于刺五加藥材抗氧化作用的物質(zhì)基礎研究不夠透徹,因此,無法跟蹤在發(fā)酵過程中這些成分的變化情況,僅能比較發(fā)酵前后刺五加提取物的活性差異。為了客觀評價刺五加-靈芝雙向發(fā)酵之后的活性變化,采用同樣的供試品制備方法分別從刺五加發(fā)酵產(chǎn)物、刺五加藥材、靈芝藥材和刺五加-靈芝混合物中獲得提取物進行活力測定。通過圖8可以看出,刺五加發(fā)酵產(chǎn)物、刺五加藥材提取物、靈芝提取物以及刺五加-靈芝混合提取物均具有不同程度的抗氧化作用,該作用具有一定的劑量依賴性,隨著樣品濃度升高而增加(120～400 μg/mL)。其中,刺五加發(fā)酵產(chǎn)物對DPPH自由基清除率、SOD活性以及T-AOC的作用最強,其次為靈芝提取物、刺五加-靈芝混合提取物以及刺五加提取物,說明刺五加和靈芝二者雙向發(fā)酵之后實現(xiàn)了協(xié)同增效的目的,推測其結(jié)果與發(fā)酵過程中產(chǎn)生新的物質(zhì)基礎有關[12]。

圖8 刺五加發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化活性評價結(jié)果

3 結(jié)論

通過研究發(fā)現(xiàn)了影響刺五加-靈芝雙向固體發(fā)酵的主要影響因素及生長因子,進一步經(jīng)過響應曲面優(yōu)化之后,得到了最適的生長因子組合,極大的縮短了發(fā)酵周期,提高了刺五加發(fā)酵產(chǎn)物的生產(chǎn)效能,為發(fā)酵工藝的中試級別放大提供了有力的支撐。刺五加中主要的活性部位為刺五加苷類,包括酚苷和皂苷,據(jù)報道,這兩類物質(zhì)是刺五加發(fā)揮抗氧化活性的主要物質(zhì)基礎[42]。刺五加藥用部位經(jīng)過靈芝固體發(fā)酵之后,其抗氧化活性產(chǎn)生了顯著的提高,推測原因主要有兩點:一是刺五加苷的種類和組成發(fā)生了變化,形成了生物活性更強的分子效應團;二是刺五加發(fā)酵產(chǎn)物有機結(jié)合了靈芝自身的代謝產(chǎn)物,二者產(chǎn)生了協(xié)同增效作用。因此,后續(xù)的研究將主要集中于挖掘影響刺五加發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化活性的物質(zhì)基礎,并從中篩選出能夠表征刺五加-靈芝發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)量的化學標志物,為保障雙向發(fā)酵工藝的穩(wěn)定性奠定基礎。