鎘脅迫下廣藿香幼苗的生理響應

李瑩瑩, 何夢玲, 姚尹伊, 黃煥超, 嚴寒靜, 張宏意

(廣東藥科大學中藥學院, 廣州 510006)

藿香[Pogostemoncablin(Blanco) Benth.] 為唇形科刺蕊草屬的多年生草本,以干燥地上部分入藥,主要含百秋李醇、廣藿香酮等成分,具芳香化濁、開胃止嘔、發表解暑等功效[1]。廣藿香廣泛用作中成藥原料,是藿香正氣水、抗病毒口服液等三十余種中成藥的主要成分。此外,廣藿香也是化妝品、定香劑和殺蟲劑等多種其他輕化工產品的重要原料[2]。目前藥用植物栽培中重金屬污染問題較為普遍,其中鎘污染問題尤為嚴重。鎘是土壤中分布最為廣泛且毒性較強的重金屬之一[3],當土壤中的鎘被植物吸收并超過一定閾值時,可引起植物產生應激的生理生化反應,植物細胞膜系統被氧化破壞,植物生長受制,甚至可導致植物死亡。如種子萌發、植物生長、以及植物光合效率受到抑制、改變植物對土壤離子的吸收速率等。此外,在重金屬鎘脅迫下,植物次生代謝產物的合成以及相關基因的表達也會發生相應的改變[4-6]。

依據商務部于2001年頒發的《藥用植物及制劑進出口綠色行業標準》(WM/T2—2004)中有關藥用植物的重金屬限量標準,張俊清[7]檢測了海南廣藿香中重金屬含量,發現海南萬寧、東方及瓊海三產區的廣藿香樣品中Cu、Pb、Cd存在不同程度的含量超標。黃偉展等[8]測定了10個產區廣藿香藥材及其生境土壤中的重金屬含量,結果發現鎘是廣藿香土壤生境中主要的重金屬污染物之一。目前土壤重金屬污染日益嚴峻,會對植物的正常生長發育帶來影響。如延緩種子萌發,抑制植物根、莖的伸長等[9]。同時,重金屬脅迫還會改變植物體內糖和蛋白質的代謝,增加活性氧(reactive oxygen species,ROS)的含量,對植物造成極大的損害[10-11]。此外,若藥用植物種植在重金屬超標的土壤中,可能會使重金屬富集在植株體內,并通過食物鏈最終損害人類和動物健康[12-13]。

在現有研究的基礎上,現通過在土壤中添加6種不同濃度鎘溶液的方法脅迫廣藿香,并于處理后1、10、20、30 d 共4個時間點檢測其9個生理指標的含量,對鎘脅迫下廣藿香的生理響應特征進行研究。以此為基礎深入研究廣藿香吸收以及轉運Cd的關鍵基因提供研究基礎,并為篩選培育鎘吸收少、富集少的品種提供理論依據,同時為研究耐Cd廣藿香及其他中藥材品種的培育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與處理

供試材料為廣藿香幼苗,經廣東藥科大學何夢玲副教授鑒定為唇形科植物廣藿香Pogostemoncablin(Blanco) Benth.,實驗地點位于廣東藥科大學大學城校區中藥學院。選取生長兩個月且狀態近似的廣藿香幼苗,種植于混合土壤(黃泥土、營養土)中,在土壤中混入0、25、50、100、150、200 mg/kg的CdCl2水溶液,陰干后作為栽培土壤使用,每組10個重復。

1.2 方法

1.2.1 株高、鮮重的測定

處理第1、10、20、30天后,用電子秤稱量每個樣品的鮮重;用卷尺測定每個處理組的株高,規定土上部分的高度即為株高。

1.2.2 抗氧化酶活性的測定

處理第1、10、20、30天后,用隨機混取法采集形態學上端第二、三對葉片作為研究材料,在液氮速凍后,置-80 ℃冰箱保存備用。

根據超氧化歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性測定采用氮藍四唑法[14]和過氧化物酶(peroxidase,POD)活性測定采用愈創木酚法[14],取保存的葉片組織于預冷的研缽,按照樣品:磷酸緩沖液(pH 7.5)1∶4的比例進行研磨,制成勻漿后,轉入離心管中,4 ℃、12 000 r/min下離心20 min,上清液即為酶粗提液。

1.2.3 可溶性蛋白、丙二醛及過氧化氫含量的測定

可溶性蛋白(total protein,TP)含量測定采用考馬斯亮藍法[14];丙二醛含量(malondialdehyde,MDA)測定采用硫代巴比妥酸法[14];過氧化氫(H2O2)含量測定采用分光光度法[14]。

1.2.4 葉綠素含量的測定

處理第1、10、20、30天后,采集廣藿香植株第二對葉片,按照樣品的質量m與95%乙醇體積V的比例為m∶V= 1∶50,避光處理24 h后,在649 nm和665 nm的波長下測定溶液的吸光度值A649和A665[13]。葉綠素C含量計算公式為

C=(17.16A649+6.63A665)V/(100m)

(1)

式(1)中:C為葉綠素濃度,nmol/mg prot;V為溶液體積,L;m為樣品質量,g。

1.3 廣藿香指標性成分含量的測定

處理第1、10、20、30天后,采收每個處理組的樣品,室溫陰干后,采用氣相色譜-質譜聯用儀(安捷倫,美國,7890 B-7000 D)聯用的方法對廣藿香樣品中百秋李醇、廣藿香酮含量進行測定,測定參照羅可可[15]的方法。

1.4 統計分析

采用SPSS 23.0 2019 (IBM Inc.,美國)對實驗結果進行統計分析,使用OriginPro 2019 b對數據進行作圖。

2 實驗結果與討論

2.1 Cd脅迫對廣藿香植株農藝性狀的影響

鎘脅迫下廣藿香株高的變化如圖1所示。所有組別的植株株高均有增長,但處理組與對照組相比較,增長率降低。其中對照組株高增長量達9.51%,處理組(25、50、150 mg/kg組別)株高增長率分別為8.98%、6.93%、7.76%,處理組(100、200 mg/kg組別)株高增長率為4.15%、2.31%。與對照組株高具有顯著性差異。Cd對植物有較高的毒性。廣藿香植株的株高都有增長,但處理組增長量遠小于對照組,說明鎘脅迫會抑制植株的生長發育,且隨著鎘脅迫濃度的增大,抑制效果更明顯。研究發現重金屬離子能通過阻止初生分生組織中的細胞分裂來影響植物形態的變化[16]。

同一處理時間不同小寫字母表示差異達顯著水平(P<0.05);樣品數n=3

鎘脅迫下廣藿香鮮重的變化如圖2所示。對照組鮮重始終呈上升趨勢,50、100 mg/kg的Cd脅迫的處理組植株鮮重雖然在處理初期有升高趨勢,但所有處理組鮮重最后均呈下降趨勢。鎘脅迫1 d后,各組的鮮重沒有顯著性差異,脅迫30 d后,對照組、25、50 mg/kg處理組與100、150、200 mg/kg處理組植株鮮重具有顯著性差異。Sahoo等[17]的研究結果表明,受到重金屬脅迫后,植物會減少對水分和養分的吸收,從而影響蒸騰作用、光合作用、呼吸作用等生理過程,最終抑制植物生長。對照組鮮重隨脅迫時間的延長逐漸升高,所有處理組的植株隨著鎘脅迫時間的延長,其鮮重均呈下降趨勢,其中高濃度處理組(150、200 mg/kg)30 d后鮮重降低至初始鮮重的40.14%、50.60%;而低濃度處理組(50、100 mg/kg)在處理初期,廣藿香植株的鮮重有一定程度的增長,說明低濃度的重金屬脅迫有一定程度的生長促進作用;這與何雪等[18]在鎘對馬鈴薯植株生長影響的研究結果一致。Farzadar等[19]發現,洋甘菊將重金屬Cd吸收至地上部分后,可能會導致地上器官中生長因子的減少,這可能也是廣藿香在脅迫后期鮮重降低的原因。

同一處理時間不同小寫字母表示差異達顯著水平(P<0.05);樣品數n=3

2.2 Cd脅迫對廣藿香抗氧化酶活性的影響

鎘脅迫下廣藿香葉片抗氧化酶活性變化如圖3和圖4所示。其中SOD酶活性變化見圖3,POD酶活性變化見圖4。可以看出,對照組SOD酶活性整體呈上升趨勢,除高濃度200 mg/kg Cd脅迫下SOD酶活力為下降趨勢外,其他處理組SOD酶活力均先升高后降低。對照組POD酶活力略有下降,但整體呈平穩趨勢,低濃度25 mg/kg鎘脅迫的處理組POD酶活力在試驗期間整體呈升高趨勢,其他處理組均呈現先升高后降低的趨勢。鎘脅迫過程中,不同濃度處理組的廣藿香抗氧化酶活性均有上升的時間段,低濃度處理組促進作用沒有高濃度處理組反應迅速,同時高濃度處理組的鎘脅迫的抑制作用也會更明顯。

同一處理濃度不同小寫字母表示差異達顯著水平(P<0.05);樣品數n=4

同一處理濃度不同小寫字母表示差異達顯著水平(P<0.05);樣品數n=4

2.3 Cd脅迫對廣藿香可溶性蛋白、丙二醛以及過氧化氫含量的影響

鎘脅迫下廣藿香植株的可溶性蛋白含量變化見圖5,MDA含量變化見圖6,H2O2含量變化如圖7所示。對照組可溶性蛋白含量前20 d呈上升趨勢,20～30 d時下降。25 mg/kg Cd處理組可溶性蛋白含量整體呈上升趨勢,50、100、200 mg/kg Cd脅迫下可溶性蛋白含量呈下降趨勢,但整個實驗過程中各個組別各個時間點樣品并沒有產生顯著性差異。所有組別的葉片MDA含量隨著脅迫時間的延長總體呈上升趨勢,處理10 d后,150、200 mg/kg處理組MDA含量與對照組有顯著性差異,處理30 d后,150、200 mg/kg處理組MDA含量與對照組有顯著性差異。H2O2含量變化趨勢整體與MDA含量變化趨勢相近。對照組H2O2含量隨時間的延長有較小程度的增長,其他各組H2O2含量均呈明顯的上升趨勢。對照組葉片在第一天時H2O2含量較高,在初期,鎘濃度越高H2O2含量越少,隨著脅迫時間的延長,200 mg/kg處理組在第30天時H2O2含量最高,增幅最大。

同一處理濃度不同小寫字母表示差異達顯著水平(P<0.05);樣品數n=4

同一處理濃度不同小寫字母表示差異達顯著水平(P<0.05);樣品數n=4

同一處理濃度不同小寫字母表示差異達顯著水平(P<0.05);樣品數n=4

2.4 Cd脅迫對廣藿香植株葉綠素含量的影響

鎘脅迫下廣藿香植株的葉綠素含量變化情況見圖8。25 mg/kg重金屬Cd脅迫下廣藿香葉綠素含量在第10天時降低,后又升高;50、200 mg/kg重金屬Cd脅迫下廣藿香葉綠素含量在第10天時升高,后又降低。100、150 mg/kg重金屬Cd脅迫下廣藿香葉綠素含量隨著脅迫時間的延長持續降低。鎘脅迫處理30 d后,對照組葉綠素含量與100、150、200 mg/kg處理組廣藿香植株的葉綠素含量產生了顯著性差異。

同一處理濃度不同小寫字母表示差異達顯著水平(P<0.05);樣品數n=4

重金屬脅迫會影響葉綠素含量。有研究認為重金屬進入植物組織后,會直接干擾葉綠素的生物合成,重金屬離子會使葉綠素酶的活性升高,從而造成葉綠素分解速度加快[32]。葉綠素生長代謝基礎是光合作用,其含量直接影響植物正常的新陳代謝效率[33-34]。植物葉綠素含量降低,光合作用的效率也會受到抑制[35-36]。隨著脅迫時間的延長和脅迫濃度的增加,廣藿香葉綠素含量的增長受到明顯的抑制作用,這與Cd2+脅迫對桑樹光合作用的影響結果基本保持一致[37]。

2.5 Cd脅迫對廣藿香植株指標性成分含量的影響

由表1可知,不同濃度鎘脅迫后,百秋李醇含量呈上升趨勢,廣藿香酮含量呈下降趨勢。處理第1天時,對照組與25、100、150、200 mg/kg處理組百秋李醇含量均有顯著性差異,處理第30天后,對照組與25、100 mg/kg處理組百秋李醇含量仍具有顯著性差異,但是與150、200 mg/kg的處理組不再具有顯著性差異。處理30 d后,對照組廣藿香酮含量減少了40.46%,其他處理組廣藿香酮含量分別減少了18.01%、39.93%、29.72%、57.58%、44.69%,有鎘脅迫濃度越高廣藿香酮減少量越大的趨勢。25 mg/kg處理組廣藿香酮含量與對照組具有顯著性差異。

表1 不同鎘濃度處理時間下廣藿香植株指標性成分含量的變化(n=3)

重金屬Cd脅迫下可能會造成廣藿香植株體內次生代謝產物合成以及相關基因的表達都會發生相應的改變[38]。廣藿香植株受到重金屬脅迫后,百秋李醇含量雖然有所增加,但與對照組相比增長量明顯減少,推測是Cd不同程度地抑制了合成途徑中次生代謝產物的合成。所有處理組別廣藿香酮含量都減少,因為百秋李醇和廣藿香酮合成中有共同的基因參與[39],因此廣藿香酮含量的減少既有在生長過程中,由于百秋李醇的增加而減少,也有受到Cd脅迫影響下的減少。目前關于重金屬脅迫下藥用植物有效成分含量的變化研究較少,重金屬脅迫下廣藿香有效成分含量變化的原因尚有待進一步研究。

3 結論

運用具有藥用價值的廣藿香作為原材料,探討了其在鎘脅迫下形態和生理指標的變化,更加深入研究了其藥用有效成分的含量變化,為中成藥研究奠定了理論基礎。

(1)鎘對廣藿香株高具有顯著(P<0.05)抑制作用;在Cd脅迫25、50、100 mg/kg處理組,對廣藿香鮮重具有先促進再抑制的作用,在Cd脅迫150、200 mg/kg處理組下對廣藿香鮮重具有顯著(P<0.05)抑制作用。

(2)鎘對廣藿香脅迫初期會激發廣藿香本身的抗逆能力,SOD酶活力在鎘25、50 、150 mg/kg作用下和POD酶活力在鎘25、100、150、200 mg/kg作用下,在1～10 d,均有不同程度的上升,在10～30 d,均有不同程度下降的趨勢,隨著脅迫濃度的增加和脅迫時間的延長,抗氧化酶系統受到抑制,無法完全解決重金屬脅迫帶來的傷害,植株自身的生長會受到抑制,抗氧化酶活性會降低。

(3)25 mg/kg Cd處理組對廣藿香中可溶性蛋白含量整體呈上升趨勢,其他處理組Cd脅迫下可溶性蛋白含量呈下降趨勢;MDA含量隨著脅迫時間的延長總體呈上升趨勢,處理30 d后,150、200 mg/kg處理組MDA含量與對照組有顯著性差異;隨著鎘脅迫時間的延長,200 mg/kg處理組在第30天時H2O2含量最高,增幅最大。

(4)鎘對廣藿香葉綠素含量具有顯著(P<0.05)減少作用,鎘脅迫處理30 d后,對照組葉綠素含量與100、150、200 mg/kg處理組廣藿香植株的葉綠素含量減少量最大。

(5)鎘對廣藿香的次生代謝產物也會受到影響,百秋李醇含量呈上升趨勢,但與對照組相比增量明顯減少。廣藿香酮含量呈下降趨勢。處理30 d后,對照組廣藿香酮含量減少了40.46%,其他處理組廣藿香酮含量分別減少了18.01%、39.93%、29.72%、57.58%、44.69%,有鎘脅迫濃度越高廣藿香酮減少量越大的趨勢。

綜上所述,鎘脅迫會對廣藿香生理狀態造成影響,且在低濃度、短時間鎘脅迫下,廣藿香生理狀態被激活,高濃度、長時間的鎘脅迫下,廣藿香生理狀態受到抑制。