一株乳酸菌和酵母菌共培養方法的初探

劉少杰，張金朝，王宇，王曉茹?

（1.諾達生物科技（贊皇）有限公司，河北石家莊 051230；2.石家莊學院，河北石家莊 050000）

隨著飼用微生態制劑無毒害、綠色、成本低、無耐藥性等優點的突顯，現如今已成為養殖業的新星與研究熱點。混合微生物制劑是將乳酸菌、酵母菌等益生菌復配在一起而使得混合微生物制劑功效得以提高，混合微生物制劑越來越多的應用于畜牧養業殖中。

為讓乳酸菌和酵母菌共培養時達到最佳生長狀態，本試驗先用同一培養基對兩株菌同時優化，以便為后續兩株菌種的共培養提供條件基礎。再分別對乳酸菌和酵母菌在培養時間、轉速、初始pH 值、培養溫度等培養條件進行優化，找出最適生長條件，最后在共培養階段對接種量進行探索，以期為乳酸菌和酵母菌復配的混合微生物制劑的進一步研究與應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株

乳酸菌、酵母菌由石家莊學院河北省高校微生物制藥應用技術研發中心惠贈。

1.1.2 試劑

葡萄糖、硫酸錳、碳酸鈣、蛋白胨、硫酸鎂、牛肉膏、磷酸氫二鉀、檸檬酸三銨、酵母膏、酵母浸粉、糖蜜、乙酸鈉。

1.1.3 培養基配方

YPD 培養基：酵母膏10 克/升、葡萄糖20克/升、蛋白胨20 克/升。固體需加1%瓊脂粉。

MRS 培養基：牛肉膏8 克/升、葡萄糖20 克/升、蛋白胨10 克/升、酵母浸粉4 克/升、磷酸二氫鉀2 克/升、檸檬酸三銨2 克/升、乙酸鈉5 克/升、硫酸鎂0.2 克/升、硫酸錳0.05 克/升、吐溫80 1 毫升/升。固體需加1%瓊脂粉。

改良MRS 培養基：糖蜜28 克/升、酵母浸粉（工業用）14 克/升、磷酸二氫鉀2 克/升、檸檬酸三銨2 克/升、乙酸鈉5 克/升、硫酸鎂0.2 克/升、硫酸錳0.05 克/升、吐溫80 1 毫升/升。固體需加1%瓊脂粉。

培養基121℃高壓滅菌20 分鐘備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的復蘇與活化

在超凈工作臺中吸取10 微升凍存的乳酸菌，接種于1 毫升MRS 液體培養基中，37℃搖床培養24 小時。無菌接種環蘸取菌液，在MRS 平板上劃線，37℃培養48 小時，待長出單菌落后，挑單菌落接種于MRS 液體培養基中活化備用。

酵母菌以同樣方法用YPD 培養基復蘇活化。

1.2.2 培養基的優化

將活化好的乳酸菌和酵母菌分別按1%接種量接種到原培養基和改良MRS 培養基中，37℃72 小時后，紫外分光光度計測得在600 納米處的吸光值并鏡檢觀察，確定在改良MRS 液體培養基中乳酸菌和酵母菌能否生長良好。

1.2.3 初始pH 值的確定

分別取活化后的乳酸菌和酵母菌，按1%接種量接種于pH 值調到4、5、6、7、8 的滅菌改良MRS 培養基中，恒溫培養72 小時后測定吸光值。

1.2.4 培養溫度的確定

分別取活化后的乳酸菌和酵母菌按1%接種量接種于滅菌改良MRS 培養基中，設置不同溫度恒溫培養箱：28℃、30℃、37℃，其他培養條件相同，恒溫培養培養72 小時后測定吸光值。

1.2.5 轉速的確定

分別取活化后的乳酸菌和酵母菌，按1%接種量接種于滅菌改良MRS 培養基中，分別于轉速為0、50、100 和200 轉每分鐘條件下恒溫培養72 小時后測定吸光值。

1.2.6 培養時間的確定

分別取活化后的乳酸菌和酵母菌，按1%接種量接種于滅菌改良MRS 培養基中，培養24 小時、36 小時、48 小時、72 小時，隨后測定菌液吸光值，以得出最佳培養時間。

1.3 菌種接種方式的確定

1.3.1 乳酸菌和酵母菌分時接種

將活化后的乳酸菌和酵母菌液按1%接種量，在最適培養條件下進行接種。先接種酵母菌，培養48 小時后接種乳酸菌，于最適培養條件下再培養48 小時，測定吸光值。

將活化后的乳酸菌和酵母菌液按1%接種量，在最適培養條件下進行接種。先接種乳酸菌，培養48 小時后接種酵母菌，于最適培養條件下再培養48 小時，測定吸光值。

1.3.2 乳酸菌和酵母菌同時接種

將活化后的乳酸菌和酵母菌液按1%接種量，在最適培養條件下進行接種。同時接種酵母菌和乳酸菌，培養48 小時，測定吸光值。

2 試驗結果

2.1 鏡檢形態

由乳酸菌鏡檢圖，可見短桿形或近球形且呈鏈狀排列的形態；由酵母菌鏡檢圖，可見大多為球型均勻分布的形態；由乳酸菌和酵母菌共培養時的菌株形態，可看到乳酸菌和酵母菌均勻分布于視野中。

2.2 培養基的優化

各菌株在原培養基和改良MRS 培養基中的培養菌液吸光值差異不太明顯，因改良MRS 培養基適用于工業生產且更價廉，所以改良后的培養基吸光值稍低，仍可以用改良MRS 作為基礎培基來培養乳酸菌和酵母菌。

2.3 初始pH 值的確定

乳酸菌和酵母菌在pH＜6 時，菌液濃度一直呈上升趨勢，而當pH＞6 時，菌液濃度呈現下降趨勢，由此我們可以初步確定乳酸菌和酵母菌的最適pH 為6.0。

2.4 溫度的確定

乳酸菌吸光值隨溫度升高而變大，在28℃時吸光值最高；酵母菌吸光值隨溫度升高而降低，在37℃時吸光值最高。兩曲線交于36℃處，二者共培養時的最適溫度為36℃。

2.5 轉速的確定

乳酸菌吸光值在轉速0～100 轉時逐漸降低，轉速為0 吸光值最大，大于100 轉時又有上升趨勢；酵母菌吸光值在轉速為0～100 轉時很低，從轉速為100 轉時吸光值直線升高，在轉速為200 轉時吸光值最大。兩曲線相交于144 轉，因此二者共培養時的最適轉速為144 轉每分鐘。

2.6 培養時間的確定

乳酸菌培養時間在48 小時前，菌液濃度一直呈上升趨勢，而當48 小時后，菌液濃度呈現下降趨勢，因此判定乳酸菌最佳培養時間為48小時；酵母菌隨培養時間的延長而菌量變大，因此共培養時的最佳培養時間為48 小時。

2.7 接種順序的確定

先接種乳酸菌，再接種酵母菌這種接種方式吸光值最高，即培養的菌濃最高，為接種方式的最佳選擇。

3 結論

本試驗研究表明改良MRS 培養基更適合于乳酸菌和酵母菌的工業生產，其中用于培養乳酸菌的最適培養條件為初始pH 值6.0，溫度37℃，培養時間48 小時，轉速為0，用于培養酵母菌的最適培養條件為初始pH 值6.0，溫度28℃，培養時間為72 小時，轉速200 轉每分鐘。乳酸菌和酵母菌共同培養時最佳培養條件為初始pH 值6.0，溫度36℃，培養時間為48 小時，轉速為144 轉每分鐘；乳酸菌和酵母菌共培養時接種方式的最佳選擇為先接種乳酸菌，再接種酵母菌。