聯合UPLC-QTOF-MS與HS-SPME-GC-MS 測定贛南臍橙果肉化學成分

劉渝辰，余迎利,，甘思逸，劉宇鑫，金汝生，蔡新送，葉詠虹，毛雪金,，王遠興,,

（1.南昌大學 食品科學與資源挖掘全國重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學食品學院，江西 南昌 330047）

臍橙是世界農業與經濟領域最重要的水果作物 之一[1]，它含有許多必需的維生素、氨基酸、類黃酮、酚酸和植物化學物質[2]。臍橙具有抗氧化、抗癌、抗炎、鎮痛、抗過敏、預防和治療心血管疾病、免疫、抗菌等多種功能[3]。具有生物活性的黃酮類化合物有利于身體組織的生長、發育和修復[4]。它們具有不同的生物學特性（抗菌、抗炎、抗氧化、增強免疫、調節脂質代謝和保護腸道健康）[5]。據報道，臍橙具有多種生物活性，包括抗氧化[6-7]、抗糖尿病的潛力[8]。

贛南臍橙是一種營養豐富的水果，產自中國中部的江西省贛州市。贛南特有的富硒紅壤土層深厚，土壤呈酸性富含微量稀土元素，有利于糖的積累和香氣的形成[9-10]。贛南氣候屬亞熱帶濕潤季風氣候，具有日照充足、降水充足、晝夜溫差大等優點。氣候有利于臍橙的生長[11]。贛南臍橙是贛南地區的受保護地理標志產品，它還含有以橙皮苷和柚皮素為主的黃酮類化合物和氨基酸、類胡蘿卜素[12]。贛南臍橙和柚子、檸檬等水果類似，含有多種抗氧化分子例如多酚、抗壞血酸，這些抗氧化分子可以抑制自由基對人體的有害影響，柑橘中黃酮類化合物蘆丁、橙皮苷、柚皮素、柚皮苷和類檸檬苦素是身體組織生長、發育和修復所必需的[13-14]。它是一種重要的柑橘類水果，食用具有促進健康和保護腸道健康的優點。臍橙中含有橙皮苷、蘆丁、柚皮苷等黃酮類化合物，在中藥中具有清熱去火的效果，橙皮苷能擴展支氣管，具有清熱化痰、疏郁理氣、抗炎和抗過敏的功效，蘆丁對高糖高脂飲食導致的小鼠腎臟損害具有保護作用[15-20]。

到目前為止，贛南臍橙化學成分的研究并不充分，采用多種類型分析方法全面檢測其化學成分，對于贛南臍橙的質量分析和控制十分有利，故本研究聯合超高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯質譜（ultrahigh performance liquid chromatography-quadrupole timeof-flight mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS）技術與頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）聯用技術填補贛南臍橙中的揮發性和非揮發性化學成分的空缺，有助于未來贛南臍橙成分的進一步提取和利用研究。因此，采用UPLC-QTOF-MS、HS-SPME-GC-MS具有十分顯著的優勢，二者具有高分辨率、高靈敏度、全掃描等優點。它已被廣泛應用于各種食品中化學成分的表征和鑒定[21]，該技術已成功用于多個領域的非揮發性化合物的定性和定量分析，如大鼠血漿、紅酒、青錢柳和綠茶的測定[22-25]，該技術在食品檢測領域具有廣闊的發展前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2021年12月采摘成熟贛南紐荷爾臍橙，所有樣品均采自江西省贛州市4 個主要產區的4 個果園，海拔高度均為200～250 m區間，果樹樹齡均為12 a。以贛南地區瑞金鵬飛果業（E 115°51′36″，N 25°49′48″）、信豐縣寶利果業（E 114°56′24″，N 25°20′24″）、安遠仟唐農業（E 115°22′12″，N 25°9′）、南康區俊萍果業（E 114°47′24″，N 25°30′36″），以4 個贛南臍橙協會認證果園的商品成熟臍橙為原料，每個果園選取20～30 個正宗原橙樣品進行分析。

甲醇（色譜級）德國Merck公司；蒸餾水 美國Watson公司；甲酸（LC-MS級）美國ROE Scientific INC公司；正構烷烴標品混合物（C7～C40）德國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

1290 UPLC-6538 QTOF-MS（配有MassHunter Qualitative Analysis和MassHunter Mass Profiler數據處理軟件）、7890A氣相色譜儀-7000三重串聯四極桿質譜聯用儀 美國Agilent公司；57330-U SPME萃取手柄、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭 美國Sigma公司；AL104電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；TDL-5-A離心機 北京東方精華苑科技有限公司；KQ5200E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；HH-2數顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 GC-MS檢測

在贛南4 個縣典型臍橙產區，采集成熟臍橙為研究對象，在果園中隨機抽取。用榨汁機提取臍橙可食用果肉樣品，稱取3 g果肉樣品于20 mL頂空萃取瓶中，將頂空萃取瓶置于50 ℃水浴鍋中平衡30 min，再將萃取頭插入頂空萃取瓶中萃取吸附25 min。然后用GC-MS萃取5 min。采用GC-MS對臍橙的揮發性成分進行測定。

GC條件：HP-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 mm）；載氣為氦氣，流量為1 mL/min；分流比為5∶1，進樣量1 μL；升溫程序：初始溫度35 ℃，保持5 min，以6 ℃/min升溫到60 ℃，保持20 min；以3 ℃/min升溫到140 ℃，維持1 min；以5 ℃/min升至250 ℃，維持3 min，總分析時間62.83 min。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；傳輸線溫度275 ℃；離子源溫度230 ℃；母離子m/z285；激活電壓1.5 V；質量掃描范圍m/z50～450。

1.3.2 UPLC-MS檢測

采收的果實立即運至實驗室凍干后，將這些樣品磨成細粉過篩，放入-20 ℃的冰柜中保存，直至使用。使用時稱取1 g凍干粉，將凍干粉與15 mL萃取劑（80%甲醇）充分混合，30 ℃超聲提取30 min，再使用 4500 r/min離心10 min，收集上清液，重復3 次，最后將上清液使用80%甲醇溶液定容到50 mL容量瓶中，用0.22 μm PTFE的濾膜過濾，裝入進樣瓶，用于上機分析。相同產地臍橙設8 個生物重復。

UPLC條件：Zorbax Eclipse Plus C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫25 ℃；流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B為甲醇含0.1%甲酸。梯度洗脫程序：0～12 min，97%～70% A，3%～30% B；12～27 min，70%～22% A，30%～78% B；27～32 min，22%～5% A，78%～95% B；32～37 min，22%～97% A，78%～3% B；流動相流速0.3 mL/min；進樣量5.0 μL。

MS條件：正、負離子模式；電噴霧離子源；質量掃描范圍m/z100～1500；碰撞氣：氮氣；毛細管電壓3500 V；碰撞電壓125 V；碰撞能10～50 eV；干燥氣流速11.0 L/min；干燥氣（N2）溫度325 ℃；霧化氣壓力40 psi；八極桿射頻電壓750 V；離子掃描范圍m/z100～1500；二級碰撞能10～50 eV；參比離子：負離子，m/z112.9856、1033.9881；正離子m/z121.0509、922.0098。

1.3.3 保留指數計算

各組分的保留指數（retention index，RI）計算以正構烷烴標定混合物為基礎，利用Kovats方程計算：

式中：tx為待測組分的保留時間/min；n和n＋1分別表示正構烷烴的碳原子數；其中tn＜tx＜tn＋1。

1.4 數據統計及圖表繪制

采用安捷倫MassHunter B.07.00采集軟件進行所有的操作、采集和數據分析。通過在METLIN（http://metlin.scripps.edu/）、Chemspider（https://www.chemspider.com/）、Food Database（http://foodb.ca/）、MassBank（http://www.massbank.jp/）等數據庫進行物質檢索，鑒定非揮發性化合物。Venn圖和總離子流圖使用https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html在線網站以及Origin2021繪圖軟件制作。揮發性有機化合物鑒定采用NIST 17 MS Library進行，使用NIST 17數據庫通過比較質譜信息與已發表文獻RI識別未知化合物。

2 結果與分析

2.1 GC-MS測定結果

2.1.1 主要揮發性成分

萜類化合物是柑橘類植物精油的主要香味成分。GC-MS分析發現，臍橙中含量最高的萜類化合物為α-蒎烯、β-月桂烯、D-檸檬烯和芳樟醇。α-蒎烯是合成香料的重要成分[26]，β-月桂烯呈無色或淡黃色液體，具有淡淡的香脂香氣，存在于紅茶、磚茶、沱茶等發酵后茶中，發酵后含量增加[27]。D-檸檬烯作為檸檬精油的成分之一，具有預防皮膚癌、預防胃癌增生和促進癌細胞凋亡的作用[28]，芳樟醇是一種天然的單萜化合物，存在于香菜等植物中，具有抗腫瘤和抗心臟毒性作用[29]。

醇類的含量在香味成分中起著重要作用。在檢測到的97 種揮發性化合物中，醇類含量較高，具有綠葉、青草和水果味，多汁的細微差別，醇類揮發性化合物是在水果生長發育過程中通過一系列酶促反應形成的。3-己烯-1-醇是一種在許多新鮮水果和蔬菜中發現的綠色草化合物，被廣泛用作加工食品的添加劑風味劑[30]，1-癸醇是一種透明無色液體，具有甜花香味，與香茅醇和鳶尾根油的混合物類似，常用于制造精油[31]。總體而言，醛類比萜類具有更好的抗菌活性。已有研究表明，適量的己醛可以延長柑橘果實的貯藏時間[32]，壬醛可以抑制柑橘中酸腐菌的生長速度[33]。2-十一烯醛有一種類似柑橘皮的蠟狀、略帶肥皂味的香氣，廣泛存在于新鮮水果和蔬菜中。3-隱品酮在稀釋時具有強烈的香料以及草本植物香氣。3-辛酮有蘑菇、奶酪和發霉的水果的細微差別，而1-辛烯-3-酮具有強烈的奶油、泥土、蘑菇與魚和植物香氣。這些化合物是臍橙果肉風味重要的組成成分，許多揮發性化合物在臍橙皮和橙汁研究中鮮見報道，本研究使贛南臍橙揮發性成分數據庫更詳實。

2.1.2 揮發性組分差異

如圖1、2和表1所示，安遠組特有的揮發性組分有6 個：香茅醇（44）、對-1-烯-9-醛（57）、反-香芹醇（59）、紫蘇醇（68）、橙花醇乙酸酯（72）、β-古巴烯（78）；南康組特有的揮發性組分有7 個：安息香醛（12）、己酸乙酯（21）、反式-2-己烯酸（27）、3-羥基己酸甲酯（29）、辛酸甲酯（41）、2,6-二甲基-3,7-辛二烯-2,6-二醇（49）、別香橙烯（84）；瑞金組特有的揮發性組分有5 個：3-辛酮（17）、反式-2-壬烯-1-醇（45）、2,4-壬二烯醛（56）、γ-桉葉烯（85）、廣藿香奧醇（95）；信豐組特有的揮發性組分有6 個：1-辛烯-3-酮（15）、丁酸丁酯（20）、4-異丙烯基甲苯（35）、隱品酮（48）、香茅醇（61）、β-瑟林烯（80）；安遠、南康、瑞金、信豐4 組的共同揮發性組分有36 個。

圖1 采用HS-SPME-GC-MS方法檢測臍橙果肉總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatograms of volatile components of navel oranges identified by HS-SPME-GC-MS

圖2 采用HS-SPME-GC-MS方法得到臍橙揮發性成分Venn圖Fig.2 Venn diagram of volatile components of navel oranges identified by HS-SPME-GC-MS

2.2 LC-MS檢測結果

2.2.1 有機酸類

有機酸在柑橘類水果中廣泛分布，國外研究表明食用含有機酸的柑橘水果有益人體健康[34]。有機酸在植物生長的所有階段都發揮著重要作用，影響著植物的中樞代謝，如線粒體呼吸代謝[35]和細胞氧化還原代謝[36]。在贛南臍橙果肉中鑒定出20 種有機酸，在負離子模式下檢測到質譜準分子離子峰為m/z117.0189 [M-H]-，以及二級質譜中碎片離子為m/z99.0093 [M-H-H2O]-、73.0303 [M-H-CO2]-、55.0187 [M-H-HCOOHH2O]-，結合數據庫及文獻[37]數據比對，最終鑒定該化合物為琥珀酸（25）[37]。負離子模式下，在m/z133.0159處出現準分子離子峰，保留時間為1.133 min，而m/z115.0053是由于失水而形成的。m/z133.0159的碎片離子去除一分子CO2得到m/z89.0245的碎片離子。m/z71.0140的碎片離子由準分子離子形成去除一分子[HCOOH]-殘基碎片，隨后脫一分子水，再從分子的剩余部分遷移2 個氫而產生，這些化合物碎裂模式的產生都包含水分子的中性損失。m/z133.0159的碎片離子去除C2H2O3得到m/z59.0140的碎片離子，通過比較文獻[38]中化合物的質譜碎片斷裂模式，該化合物被鑒定為D-(＋)-蘋果酸（14）。同時，通過查閱代謝物數據庫、質譜數據網站和相關文獻[38]，鑒定出檸檬酸（21）和脫落酸（91）等具有相似裂解模式的有機酸，裂解途徑如圖3 所示。負離子模式下，在保留時間為1.813 min 時，化合物21在m/z147.0314處出現準分子離子峰，推測分子式為C5H8O5。次級碎片離子主要分布在m/z129.0202、103.0398、87.0097和77.9222，其中m/z103.0398的碎片離子是由[C5H8O5]-丟失一分子[CO2]-形成的。m/z129.0202是由母離子去除H2O分子形成的碎片離子，而m/z87.0097是由母離子失去[HCOOH]-形成的，初步鑒定為檸檬酸（21）。VC（17）的母離子為m/z175.0210 [M-H]-，失去C2H5O2生成m/z115.0048，或持續失去C3H4O3生成m/z87.0100。化合物110在m/z為187.0968時顯示[M-H]-離子。化合物110的質譜在m/z125.0963 [M-H-H2OCO2]-、97.0659 [M-H-H2O-CO-CO2]-處出現了特征碎片離子，初步鑒定化合物110為壬二酸（110）[38]。

圖3 脫落酸（A）、檸檬酸（B）、D-()-蘋果酸（C）的 MS/MS裂解途徑Fig.3 Possible MS/MS fragmentation patterns of abscisic acid (A),citric acid (B) and D-(+)-malic acid (C)

化合物91在m/z263.128 [M-H]-時表現為準分子離子峰主片段，對應分子式為C15H20O4，在m/z219.137 [M-H-CO2]-時為主碎片離子，結合文獻[39]及數據庫鑒定化合物91為脫落酸。脫落酸是一種具有生長調節作用的植物激素，可促進葉片休眠、老化和脫落[39]。化合物58負離子模式下m/z341.0859 [M-H]?碎片離子在m/z179.0339出現，對應基團為咖啡酰基，結合文獻[40]以及在m/z135.0454處出現CO2丟失的特征離子，鑒定為咖啡酸己糖苷（58）[40]。

在正離子模式下，檢測二級質譜中在保留時間0.873 min存在m/z175.1191 [M＋H]＋、158.0920 [M＋H-NH3]＋、130.0972 [M＋H-NH3-CO]＋、116.0707 [M＋H-CH5N3]＋、70.0653 [M＋H-CH5N3-CH2O2]＋、60.0557 [M＋H-NH3-CO-C2H4N3]＋等裂解碎片，結合文獻[37]并且根據化合物的確切分子質量和裂解方式，推斷化合物為L-精氨酸（1），分子式為C6H14N4O2。同理結合文獻[40]，0.979 min觀察到m/z為98.0624 [M＋H-H2O]＋和70.0654 [M＋H-HCOOH]＋的特征碎片離子，最終推斷為L-脯氨酸（6）[41]。

2.2.2 黃酮及糖苷類

黃酮類化合物存在于多種柑橘類水果、漿果等水果中，在調節植物生長發育中發揮重要作用，賦予植物細胞豐富的色彩[42]。最新報道表明，黃酮類化合物也可以作為一種有效的抗癌劑應用于保健食品行業中[43]。黃酮的主要斷裂模式包括損失一系列中性小分子，如H2O、CH3、CO2、CO和Retro-Diels-Alder裂解產生碎片片段離子[43]。在保留時間為15.474 min時，在m/z561.1509、451.1246、199.1059、331.0799、289.0700、129.0565、85.0286處檢測到豐度較高的產物離子，鑒定為圣草次苷（93）。以4′,5,6,7-四甲氧基黃酮（123）為例，該化合物在測試樣品中的保留時間為25.172 min，根據一級質譜離子峰為m/z343.1175 [M＋H]＋，推測出分子式為C19H18O6。碎片離子分別為m/z327.0878 [M＋H-CH4]＋、313.0725 [M＋H-C2H6]＋、309.0771 [M＋ H-CH4-H2O]＋、299.0919 [M＋H-CH4-H2O]＋、285.0759 [M＋H-C2H6-CO]＋、253.0843 [M＋H-2·CH3-C9H8O]＋、181.0144 [M＋H-2·CH3-C9H8O]＋、153.0189 [M＋H-2·CH3-C9H8O-CO]＋和135.0442 [M＋H-·OCH3-C10H9O3]＋。結合質譜裂解規律以及相關文獻[44]佐證和在線網站數據庫，最終鑒定該化合物為4′,5,6,7-四甲氧基黃酮（123），裂解規律如 圖4所示[44]。

圖4 橙皮苷和4′,5,6,7-四甲氧基黃酮的MS/MS裂解途徑Fig.4 Possible MS/MS fragmentation patterns of hesperidin and 4′,5,6,7-tetramethoxyflavone

化合物101在m/z273.0762處顯示[M＋H]＋離子，計算出C15H12O5的元素組成。化合物101的碎片離子為m/z273.0762 [M＋H]＋、m/z231.0540 [M＋H-42]＋、189.0544 [M＋H-84]＋、179.0332 [M＋H-94]＋、153.0195 [M＋H-C8H8O]＋、147.0464 [M＋H-C6H6O3]＋、119.0468 [M＋H-C7H6O4]＋。將實驗數據與文獻[45]參考數據進行比較，化合物101被鑒定為柚皮素[45]，柚皮素主要以葡萄糖苷的形式存在，廣泛存在于枳、柚子、橘子、橙子等蕓香科植物的果皮和果肉中。化合物115在m/z625.1738處顯示分子離子[M＋H]＋，分子式為C28H32O16。化合物115在m/z479.1158 [M＋H-146]＋、317.0642 [M＋H-308]＋、129.0512 [M＋H-496]＋處有碎片離子，鑒定為異鼠李素-3-O-蕓香糖苷（115）[46]。化合物69顯示m/z為449.1076 [M-H]-的前體離子，結合碎片m/z431.0869 [M-H-H2O]-、287.0503 [MH-glucose]-和269.0422[M-H-H2O-glucose]-的片段以及文獻[47]，鑒定為黃諾馬苷（69）。化合物75m/z433.1127，分子式為C21H22O10，產生的m/z為273.0767 [M-H-146]-和153.0184 [M-H-146-120]-的產物離子為洋李苷的典型碎裂模式[48]。化合物96初步鑒定為蘆丁，m/z301.0352的主要片段是由槲皮素3-O-蕓香糖苷中蕓香糖苷基團的損失產生[49]。

2.2.3 酚酸類

酚酸廣泛分布在水果和蔬菜中，受到越來越多的關注，由于其具有生物活性的植物化學物質[50]，酚酸被用作人類的膳食補充劑和中藥[51]。綠原酸（23）、對香豆酸（45）和香草酸（41）為代表性化合物。在負離子模式下，一級質譜提供的準分子離子峰為m/z353.0852 [M-H]-。將該化合物裂解后，在m/z191 處產生了一個位置特異性片段，結合文獻[45]參考數據庫比對，對應的是失去咖啡酸自由基，即綠原酸（23）。同理，化合物41在質譜上存在m/z為167.0334 [M-H]-的分子片段，在二級質譜中，負離子模式下二級質譜提供的碎片離子分別為m/z152.0110 [M-H-·CH3]-、122.9337 [M-H-CO2]-和108.0225 [M-H-CH3-CO2]-。結合以上信息，最終鑒定該化合物為香草酸（41）。結合文獻[38]參考質譜數據，對香豆酸（45）中的片段m/z119.0471 [M-H-CO2]-是由于損失一分子甲基產生的。反式阿魏酸（49）在m/z117.0324處的特征產物離子表明分子中羧基[HCOOH]-的損失。沒食子酸（36）二級譜圖顯示m/z125.0242處有典型的子離子，對應CO2的損失。結合文獻[49]鑒定，化合物66為芥子酸，其正離子準分子離子峰為m/z225.075 [M＋H]＋，碎片離子為m/z119.0488 [M＋H-CH3COOH-H2O]＋。

2.2.4 非揮發性組分差異

如圖5、6和表2所示，南康組特有的非揮發性組分有4 個：催吐蘿芙木定（88）、5-phenyl-3-[3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxypentanoic acid（111）、2-acetoxy-4-pentadecylbenzoic acid（138）、1-palmitoyl-lysophosphatidylcholine（139）；瑞金組特有的非揮發性組分有4 個：甲硫腺苷（47）、Lactarorufin B（73）、rac-橙皮素（90）、1-(9Z,12Z,15Zoctadecatrienoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine（133）；信豐組特有的非揮發性組分有6 個：榼藤子苷（43）、deoxyphomalone（51）、梔子苷b（60）、矢車菊-3-O-2G-葡萄糖蕓香糖苷（63）、桉脂素（108）、2-(beta-D-glucopyranosyloxy)-7-(alpha-L-rhamnopyranosyloxy)-5-hydroxy-4′-methoxyflavone（116），安遠、南康、瑞金、信豐的共同非揮發性組分有102 個。

表2 采用UPLC-QTOF-MS的臍橙的非揮發性成分鑒定Table 2 Information about non-volatile compounds of navel oranges identified by UPLC-QTOF-MS

圖5 采用UPLC-QTOF-MS方法得到臍橙果肉總離子流圖Fig.5 Total ion current chromatograms of volatile components of

圖6 采用UPLC-QTOF-MS方法得到臍橙非揮發性成分Venn圖Fig.6 Venn diagram of non-volatile components of navel oranges identified by UPLC-QTOF-MS

3 結論

本研究通過聯合HS-SPME-GC-MS和UPLC-QTOFMS對贛南臍橙的化學成分進行分析。采用HPLC-QTOFMS方法，通過對其代謝物進行提取和分析，分別在正離子模式和負離子模式下采集數據，比對數據庫和文獻鑒定非揮發性化合物148 種。其中黃酮類化合物54 種、有機酸20 種、糖苷類化合物20 種、氨基酸14 種、酚酸類化合物12 種、其他類28 種。采用HS-SPME-GC-MS結合NIST 17數據庫對97 種揮發性化合物進行鑒定，這些化合物包括46 種烯烴類（包含40 種萜烯）、醇類13 種、醛類12 種、萜類9 種、羧酸6 種、酮類4 種、脂類4 種、酯類2 種、芳香烴1 種。本研究檢測到的化合物不僅為贛南臍橙的潛在應用提供科學依據，而且為贛南臍橙的進一步開發提供基礎，具有一定的指導意義。