空間異質性對大曲微生物群落的影響

唐慧芳，黃 鈞，周榮清,2,*，秦 輝，張宿義，董 異，王 超，王小軍，母 雨，潘強林

（1.四川大學輕工科學與工程學院，四川 成都 610065；2.國家固態釀造工程技術研究中心，四川 瀘州 646699；3.瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646699）

大曲在我國傳統白酒的生產中具有重要作用，一直都是行業關注的熱點。大曲是由未滅菌大麥、小麥或豌豆等原料在開放的環境中，籍以源于兩者的微生物群落，在驅動因素的脅迫作用下，形成包含功能菌群、粗酶制劑、揮發性物質及前體代謝成分等頗具特色的必需釀酒原料之一[1-5]。這些驅動因子包括環境溫度、濕度、曲心溫度、水分含量和酸度。后三者可通過適度調節前二者進行調控[6]，因此將前兩者視為環境因子，后三者視為內生因子。這些驅動因子調控曲坯微生態體系中種（株）間互作關系、營養網絡等成為影響大曲屬性的主要因素[5]。

因所使用原料及發酵過程峰值溫度的差異，可將大曲分為3 種不同的類型，峰值溫度在62～65、60～62 ℃及50 ℃左右的分別是高溫、中高溫和低溫大曲，這些大曲分別用于醬香型、濃香型和清香型白酒的生產[7-8]。高溫大曲以Kroppenstedtia、Saccharopolyspora、Bacillus、Weissella和Lactobacillus為主要優勢細菌屬，真菌則以Thermoascus、Thermomyces和Aspergillus為主[9]。中溫大曲優勢真菌屬主要包括Issatchenkia、Thermoascus、Trichocladium、Aspergillus、Rhizopus和Rhizomucor，優勢細菌屬為Weissella和Lactobacillus[10]。低溫大曲中優勢細菌屬包括Bacillus和Lactobacillus，優勢真菌屬包括Rhizopus和Saccharomyces[11]。

近年來，基于功能菌株（群）強化大曲發酵是改善品質的熱門研究方向之一，且已取得良好結果。如Wang Peng等[12]接種了Bacillus licheniformis，既改善了大曲風味特征，又提高了淀粉水解酶活力。He Guiqiang等[13]接種B.velezensis和B.subtilis顯著提高了淀粉水解力和酯化力，也提高了酯類、吡嗪類和醇類等特征成分含量。宇宙射線誘變是一種獨特育種手段，具有效率高、突變范圍寬、周期短等特點，應用于釀酒微生物菌種的選育具有廣闊前景[14]。

本研究以接種太空誘變曲擴培的強化大曲為對象，探討在大型曲房中心位置8 層貨架式曲架的上、中、下層曲（分別為第1～3、4～5、6～8層）在主發酵期中理化性質與微生物群落結構的變化趨勢，研究驅動因子對群落多樣性的影響規律。旨在揭示多層發酵房驅動因子與大曲群落的相關性，為大曲生產過程的自動化調控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大曲樣品取自四川瀘州著名釀酒企業制曲中心。

化學試劑均為分析純，購自成都金山化學試劑有限公司；2×TaqPCR Master Mix、ITS1/ITS4引物、DNase/RNase-free Deionized Water、真菌基因組DNA抽提試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設備

TGL 16M高速冷凍離心機 湘麓離心機儀器公司；S100TMThermal Cycler聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、Gel DocTMXR凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；TU-1901紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；85-2型數顯恒溫磁力攪拌器 上海 雙捷實驗設備有限公司；TES1360A溫濕度測試儀 泰仕電子工業股份有限公司；TP3001電子探針溫度計 天津凱士達儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備與收集

生產流程及設施簡圖如圖1所示。

圖1 架子曲生產流程（A）與曲房布局（B）Fig.1 Flow chart of the production process of Daqu (A) and layout of Daqu fermentation room (B)

大曲生產是接種1%（m/m）的母曲，按照DB 5105/T 36—2020《地理標志產品 瀘州老窖系列曲藥（久香牌）生產技術規范》[15]和Zheng Xiaowei等[16]所述過程及參數控制進行。母曲是搭載在神州11號太空艙并在太空誘變1 個月曲粉逐級擴大的陳曲。翻曲是為了通風散熱，調節曲塊水分，為曲坯發酵提供適宜的溫、濕度環境[17]，架子曲以空氣導流調控裝置調節室內溫、濕度與大曲曲心溫度，模擬人工翻曲，實現無翻曲的生產工藝。

取樣：分別從曲房中心曲架的上、中、下層隨機取2 塊大曲，粉碎混勻后堆積成錐型，分別從曲粉堆的四周與中心點5 點共取樣300 g，再次混勻后分為兩份，其中一份280 g置于4 ℃保藏用于理化檢測，另一份20 g則置于-80 ℃保藏用于微生物群落結構分析。樣品名稱及相應信息如表1所示。

表1 取樣點的信息及編號Table 1 Information and codes of sampling sites

1.3.2 微生物群落組成檢測

總DNA提取：使用Fast DNA SPIN kit，按照供應商提供操作程序提取后，分別經1%瓊脂糖凝膠電泳和Nano Drop ND-1000分光光度計檢測其純度和含量。分別使用引物338F/806R和ITS5/ITS1 PCR擴增細菌的16S rRNA V3～V4區和真菌的ITS1區域。擴增體系25 μL：5×reaction buffer和5×GC buffer各5 μL，0.25 μL DNA聚合酶（5 U/μL，Q5 High-Fidelity），2 μL dNTPs（2.5 mmol/L），正反引物各1 μL（10 μmol/L），2 μL DNA模板，8.75 μL ddH2O。細菌擴增程序：98 ℃預熱2 min，98 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，經過25 個循環，最后72 ℃保持5 min。真菌擴增程序：95 ℃預熱3 min，95 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，經32 個循環，最后72 ℃保持10 min。PCR產物瓊脂糖凝膠電泳進行目的片段純化回收。純化樣品后委托派森諾生物科技有限公司在Illumina NovaSeq平臺完成DNA片段進行雙端（Paired-end，2×300）測序。

DADA2序列去噪：首先調用QIIME切除序列的引物片段，棄去未匹配引物的序列；然后調用DADA2進行質控、去噪、拼接、去嵌合體獲得擴增子序列變體（amplicon sequence variants，ASV）。接著通過Greengenes/UNITE數據庫，將ASV特征序列與數據庫中的參考序列相比對，獲取每個ASV所對應的分類學信息，去噪后，合并ASV特征序列和ASV表格，并去除singletons ASV。

1.3.3 理化性質的檢測

參照QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》[18]所述方法和步驟測定水分、酸度、液化力、糖化力、發酵力和酯化力。環境溫度與濕度使用溫濕度測試儀測定，曲心溫度使用電子探針溫度計測定。所有實驗均進行3 次重復。

1.4 數據處理

使用OriginPro 2022對驅動因子以及大曲酶特性進行可視化。使用派森諾基因云平臺（https://www.genescloud.cn/home）對微生物群落進行主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）、冗余分析（redundancy analysis，RDA）以及基于average的層次聚類分析（hierarchical clustering analysis，HCA）。使用基迪奧生信云平臺（https://www.omicshare.com/tools/home/task/index.html）和圖圖云平臺（https://www.cloudtutu.com/#/login）對驅動因子和優勢微生物屬（相對豐度＞1%）分別進行普氏分析與Mantel檢驗。使用IBM SPSS Statistics 25軟件對優勢微生物屬通過Spearman算法（r＞0.70，P＜0.05）構建共現網絡，經Cytoscape可視化。

2 結果與分析

2.1 發酵過程空間異質性驅動因子的變化趨勢

如圖2所示，上、中、下三層大曲的水分含量逐步降低，到10 d均降低至15%以下，達到轉房標準[19]。不同層次環境溫度、濕度及大曲曲心溫度的變化趨勢類似。發酵起始2 d后，因菌群繁殖與代謝釋放大量熱，曲坯的水分大量散發[20]，曲房濕度陡增，熱量跟隨水蒸氣上升，導致下層溫度、濕度低于上、中層。隨著發酵過程的進行，中、下層大曲的曲心溫度略高于上層大曲，可能與環境溫、濕度和微生物群落組成有關。發酵初期，曲坯水分、溫度適合產酸微生物繁殖，所以大曲酸度陡升[21]，尤其是上層曲坯酸度高達1.7 mmol/10 g，隨后又下降直至達到穩定的狀態。同期上層曲坯的酸度略高于中、下層曲，可能與上層大曲高溫、高濕環境的周期更長，從而產酸更多有關[22]。

圖2 驅動因子的變化趨勢Fig.2 Changes in driving factors during fermentation

2.2 發酵過程酶活力的變化

由圖3A可知，發酵前2 d，各層樣品均未檢出液化力。第3天時略升，第8天時上層、中層液化力趨于穩定。下層曲的液化力8 d后速增，可能是下層溫度偏低，菌群生長緩慢，高濕度環境更適合霉菌生長所致。3 個不同層次大曲的糖化力變化趨勢相同，但強度不同（圖3B）。糖化酶活力起伏振蕩波動后在6 d后逐漸趨于穩定的趨勢，類似邢鋼等[23]報道的結果。這是原料所含內源酶被激活、后遇高溫失活，同時因微生物菌群分泌糖化酶隨生物量增高而提高，并伴隨高溫和酸脅迫影響的綜合結果。類似前述的不同層次間溫度變化趨勢，糖化力也是上層曲的波動程度最大，下層曲的波動最小。且下層曲糖化力明顯高于中層和上層曲，可能與下層前期溫度低且升溫緩、濕度適宜密切相關。

圖3 發酵過程中不同層次大曲酶活力的變化趨勢Fig.3 Changes in enzymatic activities in different layers of Daqu during fermentation

上、中、下三層曲的發酵力也類似陳曉茹等[24]報道的結果，顯著降后陡然升，又降低至趨于平穩的趨勢（圖3C），與酸度的變化趨勢相反（圖1）。發酵力表征的是大曲中的酶利用糖轉化為CO2與乙醇的能力，與酵母菌的活力密切相關[23]。發酵力的變化趨勢類似溫度。而酯化力的變化趨勢則與液化力類似（圖3D）。酯化力同樣與霉菌和酵母的繁殖代謝密切相關[25-27]，霉菌和酵母發酵前期生長較為緩慢，隨后生長旺盛[27]，酯化力則陡增，隨后趨于穩定，且在發酵后期，上、下層樣品的酯化酶活力顯著高于中層大曲。

2.3 微生物群落結構的差異

樣品中檢出真菌和細菌有效序列分別是53111～88490和67181～115456，其高質量序列是52943～88244和45465～101691。3 層大曲微生物群落的α多樣性指數均呈現波動增加的趨勢（圖4）。上層、下層大曲細菌的α多樣性指數均在8 d達到頂峰，中層則是在6 d，且明顯低于上、中層樣品。3 層大曲真菌的α多樣性指數波動相似，僅上層第8天樣品有差異。

圖4 不同層次對微生物群落α多樣性的影響Fig.4 Effects of different layers on the α-diversity of microbial communities in Daqu

微生物群落主要由Firmicutes和Proteobacteria 2 個細菌門及Ascomycota、Mucoromycota和Basidiomycota 3 個真菌門組成，包括56 個細菌屬和59 個真菌屬，平均相對豐度大于1%的優勢菌屬包括Lactobacillus、Weissella、Bacillus、Kosakonia、Staphylococcus、Thermoactinomyces等12 個細菌屬（圖5A）和Pichia、Thermoascus、Rhizomucor等7 個真菌屬（圖6A）。不同空間位置環境溫度、濕度等參數及其變化顯著影響生產過程曲坯的微生物多樣性和豐富度[21]。如中層和下層的Firmicutes相對豐度始終在85.16%～99.03%之間，上層曲則是前5 d都是Firmicutes占絕對優勢，而從6 d起，Proteobacteria豐度陡增，占據主導地位。

圖6 不同層次對真菌群落結構和組成的影響Fig.6 Structure and composition of fungal community in different layers of Daqu

如圖5A所示，整個過程中，Weissella和Lactobacillus在發酵過程中的相對豐度交替變化，如0 d 曲坯中Weissella相對豐度高達81.77%，隨著發酵過程的進行，其在各層曲的豐度迅速降低至2%后逐漸增高，然后又降至約1%，類似Zhu Min等[28]報道的結果。Lactobacillus經1 d發酵就達到峰值，上、中層曲中相對豐度分別是92.44%和90.08%，隨之漸降，8 d降至1%以下，而下層在4 d才達到峰值（約為70%），結束時降至42.89%。這些趨勢同發酵過程中酸度增高，水分逐步降低，適合Lactobacillus繁殖密切相關[28]。0 d曲坯中Bacillus相對豐 度低于1%，發酵前期，除1 d下層樣品外，中層和上層相對豐度都在1%左右，在發酵后期相對豐度提升，因為Bacillus可產耐熱芽孢，可以承受高達60～62 ℃高溫[29]，故在發酵8 d中、下層曲中豐度分別達到了57.53%、39.39%，在上層曲中雖不占主導，但也穩定在10%左右。

初始曲坯中，Kosakonia相對豐度僅為8.24%，空間位置顯著影響其相對豐度，主發酵結束時，上、中、下層曲相對豐度分別為30%、2.19%和5.38%。Staphylococcus在發酵過程中最高相對豐度分別達5.18%、15.79%、9.75%。類似地，在發酵結束時中層和下層曲中Thermoactinomyces相對豐度分別是27.84%和8.96%，而Pantoea和Kroppenstedtia僅在上層和中層分別約為20%和22%，在其余層次中的相對豐度則小于1%，是非優勢屬。

細菌群落基于Bray-Curtis距離的PCoA結果表明，大曲微生物群落時空特征差異顯著（圖5B）。具體地，0 d樣品獨聚一簇，上層曲1～5 d和6～10 d兩個階段成簇，且相距較遠，表明群落結構差異顯著。中層和下層曲均聚類成3 簇，前者是1～5、6 d和8～10 d分別成簇，前兩簇距離較近；下層則是8 d和10 d分別單獨成簇，兩者距離較遠，1～6 d結構相似且距離緊密。發酵前5 d的3 層曲細菌群落各自聚類在同簇，隨著發酵的進行，空間位置則顯著影響群落結構，聚類距離趨遠。這些結果也被HCA驗證，顯示出與PCoA相似的群集模式（圖5C）。

Pichia、Thermoascus、Rhizomucor等7 個屬為優勢菌（圖6A）。整個主發酵期間，Ascomycota始終占優勢，其相對豐度最高可達99.93%。起始時（0 d），Pichia相對豐度高達99.38%，前5 d的3 個層次大曲Pichia相對豐度都維持在96.70%～99.82%之間。6 d后，上層和中層曲中Pichia相對豐度便逐步下降，而下層曲直到8 d，Pichia相對豐度仍高達97.40%，10 d才降至68.88%。后期，中層曲Pichia相對豐度較下層曲低，但仍在60%以上；上層曲則降至10.76%。在上、中層和下層大曲分別經6 d和8 d的發酵后，Thermoascus、Rhizomucor與Rhizopus都成為優勢菌。上層曲因中后期溫度較高，環境濕度和曲坯水分顯著降低，抑制酵母菌和霉菌等熱敏真菌繁殖[21,30]，所以Thermoascus[10]和Thermomyces[31]等嗜熱真菌[32]變為優勢菌，與Xiao Chen等[30]報道的結果相符。

基于真菌多樣性的PCoA和HCA都表明（圖6B、C），發酵前期曲坯的真菌群落結構均相似，上層和中層發酵0～5 d曲坯聚類成簇、下層則是0～8 d聚集一簇，6～8 d中層曲聚類成另一簇，上、中、下3 層發酵10 d曲坯單獨成簇。

2.4 變量對群落結構的驅動作用

使用普氏分析與Mantel檢驗研究驅動因子對微生物群落演替的貢獻（圖7）。普氏分析表明驅動因子對細菌群落的貢獻顯著，而對真菌貢獻不顯著。Mantel檢驗顯示曲坯水分含量與環境濕度顯著影響上層曲坯的微生物組成，而酸度與曲心溫度則次之。同時，水分含量與酸度均顯著影響中層曲坯的微生物群落，環境濕度對其真菌組成影響較細菌群落大。而在下層大曲中，水分含量對細菌和真菌均有顯著影響，而酸度僅對細菌群落影響顯著。結合普氏分析與Mantel檢驗的結果表明，驅動因子對細菌群落的貢獻更顯著。

圖7 微生物群落與環境因子間的普氏分析（A、B）和 Mantel檢驗（C～E）Fig.7 Procrustes analysis (A,B) and Mantel test (C–E) between microbial communities and driving factors

通過方差分解分析（variance partitioning analysis，VPA）辨析內生因子與環境因子對微生物群落的影響強度，如表2所示。驅動因子對上層大曲的細菌群落結構影響顯著，中層次之，而下層大曲細菌結構僅受內生因子的顯著影響；僅中層大曲真菌群落受驅動因子顯著影響。另外，在上層曲中，內生因子對真菌群落影響強于細菌，而環境因子僅對細菌群落影響顯著。在中層大曲中，驅動因子對真菌和細菌群落的貢獻度相同，其中內生因子的貢獻度略大于環境因子。而在下層大曲中僅內生因子對微生物群落貢獻顯著，且對細菌和真菌群落的貢獻度相同。其結果與普氏分析和Mantel檢驗一致。

表2 驅動因子與微生物的VPATable 2 VPA between driving factors and microbial communities

使用RDA明確驅動因子與具體優勢菌屬的相關性。如圖8所示，水分和酸度均與Lactobacillus和Pichia呈正相關。而酸度與Bacillus和Rhizopus等呈負相關，不同于Zhu Min等[28]的研究，可能與其優勢微生物相對豐度以及生產工藝不同有關。上層曲心溫度和室溫呈負相關，而在中、下層兩者呈強正相關，這可能由上、中、下層空氣流動程度不同等條件差異導致。在上層大曲中，曲心溫度與Pantoea、Bacillus、Kosakonia、Staphylococcus、Rhizomucor、Thermoascus等呈正相關。中層大曲曲心溫度與Thermoactinomyces、Kroppenstedtia、Scopulibacillus、Kosakonia、Pantoea等呈正相關，下層大曲曲心溫度Pichia、Thermomyces、Rhizomucor、Thermoascus等呈正相關。這些結果很好證明了Bacillus、Rhizomucor、Thermoascus、Thermomyces等耐高溫能力強[30,33]。

圖8 微生物群落與驅動因子間的RDAFig.8 RDA between microbial communities and driving factors

2.5 微生物間相關性

如圖9所示，在上層大曲中存在81 對互作關系，其中53 對為正相關；在中層大曲與下層大曲中分別存在55 對和43 對互作關系，其中正相關關系分別為35 對和36 對。上、中、下層大曲中共享的僅有10 對關系，包括Lactobacillus與Acinetobacter、Rhizomucor這兩對負相關，以及Bacillus與Acinetobacter、Thermoascus、Rhizomucor，Enterobacter與Kosakonia、Pantoea，Pantoea與Kosakonia，Rhizomucor與Thermoascus、Rhizopus這8 對正相關。Lactobacillus與Rhizomucor呈負相關可能是因為乳桿菌生產乳酸能力強，高酸度環境不利于Rhizomucor這類不耐酸菌屬生長[34]，在前期Lactobacillus相對豐度高，抑制了Rhizomucor繁殖，后期Lactobacillus相對豐度降低，酸度也下降，提高了Rhizomucor的豐度。Bacillus和Thermoascus呈正相關可能與它們都是耐熱菌有關[4,30]。除此之外，8 對相同的關系在上層和中層曲中，上層與下層大曲和中層與下層大曲中分別存在18 對和5 對相同的關系。綜上所述，不同層次大曲微生物群落結構差異顯著的同時，微生物間的共生共斥關系亦不同，表明不同層次間驅動因素的差異可能也導致微生物間的互作關系發生改變，從而共同促進大曲群落形成。

圖9 微生物共現網絡在不同層次間的差異Fig.9 Differences in microbial co-occurrence networks among different layers of Daqu

3 結論

以多層貨架式工藝生產的主發酵期上、中、下3 層大曲為對象，探討了其驅動因子和酶活力的變化過程，以及驅動因子對大曲微生物群落的貢獻。結果表明，3 層曲的水分均在10 d內逐步降低至15%以下，達到轉房標準。不同層間環境溫度、濕度及曲心溫度的變化程度不同，但波動趨勢相同。同期的上層曲坯酸度略高于中層和下層，酶活力則反之。在大曲微生態體系中，微生物群落的時空性特征顯著，尤其是發酵中后期，PCoA和HCA也揭示了其規律性。VPA、普氏分析和Mantel檢驗都表明，驅動因子顯著影響細菌群落組成，但不同驅動因子對不同層次大曲的影響程度不同。具體地，驅動因子均顯著影響上、中層曲的微生物群落結構，而下層曲僅受內生因子的影響顯著。另外，內生因子對上層曲的真菌群落貢獻強于細菌，而在中、下層曲中貢獻度相同。環境因子僅對上層細菌群落和中層微生物群落具有顯著影響。其中，水分和酸度均與Lactobacillus和Pichia呈正相關，但不同層次驅動因子間相關性不同。同時，不同層次大曲中微生物間相互作用也有差異。綜上，多層貨架式工藝生產大曲過程中，不同層次間大曲酶特性及群落結構的差異與驅動因子顯著相關，可通過調控發酵過程中驅動因子從而對大曲質量進行調控，這為大曲的智能制造提供了科學依據。