復合香型白酒糧醅機械化和傳統堆積發酵過程中微生物群落結構的對比分析

程 偉，陳雪峰，陳興杰，周 端，李 娜，潘天全，薛錫佳

（1.陜西科技大學食品科學與工程學院，陜西 西安 710021；2.安徽金種子酒業股份有限公司，安徽 阜陽 236023；3.陜西農產品加工技術研究院，陜西 西安 710021）

糧醅的高溫堆積是醬香、芝麻香等香型白酒重要的釀造工藝，堆積過程可網羅和富集釀造環境中的微生物，并形成獨特且豐富的微生物菌群，進而產生多種酶類和風味及其前體物質。高溫堆積過程可通過美拉德反應或微生物代謝形成并積累特殊香氣成分，進而形成酒體的“醬香、芝麻香”等香氣特征[1]。糧醅堆積發酵過程中富集的各類微生物對白酒釀造均具有重要作用；其中，細菌產生的蛋白酶可分解蛋白質及淀粉，為美拉德反應提供前體物質，對酒體“焦香”的形成具有重要作用[2]；酵母菌主要產乙醇、酯類及其他多種風味物質；霉菌可產生糖化酶、液化酶等酶類，有利于原料的利用和特殊產香微生物的生長[3]。對糧醅堆積發酵過程中微生物群落結構的研究有利于明確固態發酵過程中特殊產香微生物的菌群來源，對優化糧醅堆積發酵工藝具有重要意義。傳統白酒釀造的機械化是白酒行業的發展趨勢，對白酒傳統和機械化釀造在微生物多樣性、風味差異等方面的解析，有助于實現白酒機械化釀造的穩定優質生產。

近年來，采用高通量測序技術對糧醅堆積發酵過程中的微生物群落結構進行了較多研究[4-5]。如張瀚之等[6]采用高通量測序及其數理分析對醬香型白酒機械化釀造7 個輪次堆積發酵酒醅的真菌菌群結構進行分析，結果表明Thermomyces、Thermoascus、Aspergillus、Torulaspora、Byssochlamys、Candida和Wickerhamomyces是醬香型白酒機械化堆積過程中重要的真菌屬。復合香等香型白酒的釀造也普遍采用糧醅堆積發酵工藝[7]；然而，關于復合香型白酒糧醅堆積發酵過程中微生物群落結構的研究還鮮有報道，尤其是關于糧醅機械化和傳統堆積發酵過程中微生物群落結構特征的比較研究較少。本研究以復合香型白酒機械化和傳統堆積發酵過程中的糧醅為樣品，采用高通量測序技術對微生物群落結構進行分析，全面解析機械化堆積發酵過程中糧醅微生物群落結構和主導菌群的變化特征，有利于揭示糧醅機械化堆積的微生物群落結構組成及差異，旨在為持續優化復合香型白酒的機械化釀造工藝及原酒品質提升提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糧醅樣品：分別取自安徽金種子酒業股份有限公司的機械化和傳統釀酒車間，在糧醅堆積過程中的0（堆積開始）、12、24 h和48 h（堆積結束）分為表層和內部分別取樣，同時檢測不同取樣點的溫度并取平均值；其中，機械化堆積的表層樣品命名為AS1、AS2、AS3和AS4，內部樣品命名為AI1、AI2、AI3和AI4；傳統堆積的表層樣品命名為TS1、TS2、TS3和TS4，內部樣品命名為TI1、TI2、TI3和TI4。

環境及工藝條件：于2022年5月中旬進行并取樣，釀酒廠區的環境溫度在18～30 ℃左右，環境濕度在50%～60%左右。在用糧和用曲的質量、種類和比例以及配糟和蒸煮等工藝條件均基本相同的情況下，糧醅在機械化車間進行配料、蒸煮、攤涼并加曲后，再分別進行機械化堆積（機械化釀酒車間）和傳統堆積（轉運到傳統釀酒車間），其堆積時間均為48 h。

氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（均為分析純）天津市永大化學試劑有限公司；飽和酚、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）-Na2、十六烷基三甲基溴化銨（cetrimonium bromide，CTAB）（均為分析純）北京索萊寶科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）（分析純）美國Sigma-Aldrich公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒 美國Qiagen公司。

1.2 儀器與設備

TGL-20M高速冷凍離心機、超低溫冰箱 上海盧湘儀離心機儀器有限公司；MX.S型可調式混勻儀 美國SCILOGEX公司；GeneAmp?9700型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國ABI公司；QuantiFluor型-ST藍色熒光定量系統 美國Promega公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

在糧醅堆表層（3～5 cm）和內部（80～100 cm）的5 個不同位置分別取樣后混合，并隨機取3 個平行樣本，再平均分別分為兩份；其中1 份在無菌環境下將3 個平行樣品分別單獨等量混合后，保存于無菌袋中，置于-80 ℃冰箱備微生物群落結構分析；另1 份將3 個平行樣品分別保存于普通樣品袋中，置于4 ℃冰箱備理化指標檢測。

如圖1所示，機械化堆積明顯區別于傳統堆積，機械化堆積的糧醅置于堆積床內相對密閉的空間，糧醅與車間環境的接觸較少（堆積高度100 cm，寬度120 cm，長度660 cm）；傳統堆積將糧醅置于車間空曠的場地內進行堆積（堆積高度150 cm，底部四周寬度280 cm，頂部四周寬度120 cm）。

1.3.2 DNA提取

糧醅微生物總DNA 提取的前處理方法與參照 文獻[4,8]，參考土壤DNA提取試劑盒（E.Z.N.A.Soil DNA Kit）操作說明書進行糧醅總DNA的提取。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，最后向離心管中加入200 μL無菌雙蒸水使DNA沉淀溶解，并貯于-20 ℃備用。

1.3.3 PCR擴增

PCR擴增定量：以稀釋后的基因組DNA為模板，根據測序區域的選擇，使用帶Barcode的特異引物（Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer: New England Biolabs）和高效高保真酶進行PCR，確保擴增效率和準確性。細菌多樣性鑒定：正向引物515F（GTGYCAGCMGCCGCGGTAA）和反向引物806R（GGACTACNVGGGTWTCTAAT）擴增16S V3～V4（b）序列結構域。真菌多樣性鑒定：正向引物ITS5-1737F（GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG）和反向引物ITS2-2043R（GCTGCGTTCTTCATCGATGC）擴增ITS1（a）序列區域。

PCR 條件：將樣品均勻稀釋至20 n g/μ L，當樣品不足時直接使用原溶液；同時，根據樣品的實際情況進行稀釋調整；擴增體系（25 μ L）：5×reaction buffer 5 μL，5×GC buffer 5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，Forward primer（10 μmol/L）1 μL，Reverse primer（10 μmol/L）1 μL，DNA Template 2 μL，ddH2O 8.75 μL，Q5 DNA聚合酶0.25 μL；放大參數：98 ℃初始變性2 min，98 ℃變性15 s，55 ℃滾轉30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃最終延伸5 min，10 ℃保持25～30 個循環。

PCR產物的純化和混樣：PCR產物使用2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，對檢測合格的PCR產物進行磁珠純化；采用酶標定量，根據PCR產物濃度進行等量混樣，充分混勻后使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，對目的條帶使用膠回收試劑盒回收產物。

1.3.4 文庫構建和上機測試

使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建，構建好的文庫經過Qubit和Q-PCR定量，文庫合格后使用NovaSeq6000進行上機測序。建庫與測序在上海派森諾生物科技股份有限公司完成。

1.3.5 理化指標的測定

糧醅的水分測定采用烘干法，酸度測定采用酸堿滴定法，淀粉和還原糖的測定采用斐林試劑法，具體參照DB 34/T 2264—2014《固態發酵酒醅分析方法》。

1.4 數據處理及繪圖

高通量測序完成后進行數據分析與序列優化，將序列相似性大于等于97%分歸為同一分類操作單元（operational taxonomic unit，OTU），將所有序列與Silva（SILVA_138.1）庫比對，得到序列的分類學信息。基于Illumina MiSeq測序平臺中的R語言繪制群落組成圖和Heatmap圖。通過計算微生物之間的Spearman相關系數，再選取|ρ|＞0.8且P＜0.05的作為互作對象，然后使用Cytoscape 3.4.0（http://www.cytoscape.org）對微生物與微生物之間的相互關系進行可視化關聯網絡分析，以表征微生物與微生物之間的共現性關系。

2 結果與分析

2.1 糧醅堆積發酵過程中的理化指標及溫度變化分析

對不同堆積方式而言，開始堆積時糧醅表層和內部的理化指標及溫度基本相同。如圖2所示，不同堆積方式下，堆積過程中糧醅的水分、酸度和還原糖均有平緩增加的趨勢，淀粉含量有減小的趨勢；其中，機械化堆積過程中，水分含量的增加較為平緩，酸度的增加明顯高于傳統堆積，這可能與機械化密閉式的堆積環境明顯區別于傳統開放式的堆積環境有關。機械化堆積方式下，糧醅堆積48 h后表層的水分、酸度、淀粉和還原糖分別為50.12%、1.97 nmol/10 g、19.62%、2.74%，堆積內部的水分、酸度、淀粉和還原糖分別為50.58%、2.02 nmol/10 g、18.53%、2.89%，這可能是由于堆積過程中糧醅表層和內部環境條件、微生物菌群等因素的不同所導致。

糧醅酸度主要來源于產酸菌的有機酸代謝，有機酸在防止雜菌污染的同時，可作為白酒的主要風味物質及生成酯類物質的前體物質[9]。糧醅理化參數在影響微生物群落演替的同時也受到微生物代謝的影響。糧醅的淀粉含量變化能有效反映出原料淀粉是否利用及糧醅是否進行初步發酵。還原糖由淀粉酶、糖化酶等分解淀粉而生成，是微生物發酵的主要能量來源，堆積糧醅中還原糖的含量變化在一定程度上可以反映堆積發酵情況。綜上表明，不同堆積方式下，糧醅中淀粉均得到一定程度的利用，同時糧醅的堆積有利于為固態發酵提供有機酸、還原糖等物質基礎。

不同堆積方式下，糧醅表層和內部的溫度均有不同程度的升高（圖2e、f），其中糧醅堆積48 h后內部的溫度均高于表層。機械化堆積方式下，糧醅堆積48 h后表層和內部的溫度分別為54.8 ℃和56.9 ℃，明顯低于傳統堆積方式的56.3 ℃和58.6 ℃，這可能與機械化堆積糧醅的高度低于傳統堆積等因素有關。研究表明，糧醅堆積過程的高溫是功能微生物代謝活動旺盛的表現，更是堆積過程中微生態結構調整的推動力[10]。另外，傳統堆積的表面積大于機械化堆積，糧醅與車間環境接觸較多，并受環境溫度、濕度和通風等因素的影響較大，因此糧醅表層各局部整體上接觸（接種）環境微生物的面積也較大。

2.2 糧醅堆積發酵過程中的微生物群落結構分析

2.2.1 序列統計、有效性與α多樣性分析

對各樣品的DNA進行測序，測序序列經質控過濾后分別得到95111～121170 條細菌的有效序列，其平均長度為101～374 bp，聚類分析共產生7620 個OTU分類；測序序列經質控過濾后分別得到58636～96930 條真菌的有效序列，其平均長度為17～438 bp，聚類分析共產生1504 個OTU分類。α多樣性分析可以反映微生物群落的豐度和多樣性[11]，由圖3α多樣性指數可知，各組樣品的覆蓋率均大于0.999，Chao1指數的P值分別為0.018和0.33。綜上表明，本次測序各樣品文庫的覆蓋率較高，樣品序列基本被完全測出，各樣品的測序結果較可靠。

圖3 不同堆積方式下糧醅微生物的α多樣性分析Fig.3 Analysis of microbial α-diversity in fermented grains

覆蓋率在99%的OTU水平進行Chao1指數計算以估計物種數目（即OTU數目）。由圖3a可知，AI組的Chao1指數高于其他樣品組，表明AI組的細菌物種總數高于其他樣品組；同樣，由圖3b可知，TI組的Chao1指數高于其他樣品組，表明TI組的真菌物種總數高于其他樣品組。Shannon指數和Simpson指數均能表現出樣品中物種的多少、均勻度及多樣性[12]。由圖3a可知，AI組的Shannon指數和Simpson指數均高于其他樣品組，表明AI組細菌物種的均勻度及多樣性高于其他樣品組；同樣，由圖3b可知，TI組的Shannon指數和Simpson指數均高于其他樣品組，表明TI組的真菌物種的均勻度及多樣性高于其他樣品組。對不同堆積方式而言，由圖3a可知，AS組和AI組的Shannon指數和Simpson指數均分別高于TS組和TI組；由圖3b可知，AS組和AI組的Shannon指數和Simpson指數均低于TS組和TI組；綜上表明，機械化堆積方式下，糧醅的細菌多樣性明顯高于傳統堆積，而糧醅的真菌多樣性明顯低于傳統堆積。另外，由圖3a可知，AS組的Shannon指數和Simpson指數均低于AI組；由圖3b可知，AS組的Shannon指數和Simpson指數均高于AI組；綜上表明，機械化堆積方式下，糧醅表層的細菌多樣性低于糧醅內部，而糧醅表層的真菌多樣性高于糧醅內部。

2.2.2 OTU分布的Venn分析

對不同堆積方式下糧醅微生物的OTU進行分類統計，并對不同樣品組之間相對共有及獨有的OTU數進行疊加，有利于直觀地比較OTU數目組成，并可以推測樣品組中的微生物多樣性及豐度[13]。由圖4a可知，不同樣品組的共有細菌OTU為191 個，占樣品組總OTU的6.00%；其中，AI組的特有OTU數最大為1156 個，占樣品組總OTU的36.30%，表明AI組的細菌多樣性最高。另外，AS組的細菌OTU數低于AI組，表明機械化堆積方式下，糧醅表層的細菌多樣性低于糧醅內部，這與Shannon指數和Simpson指數的分析結果一致。由圖4b可知，不同樣品組的共有真菌OTU為64 個，占樣品組總OTU的14.48%；其中，TI組的特有OTU數最大為112 個，占樣品組總OTU的25.34%，表明TI組的真菌多樣性最高。

圖4 不同堆積方式下糧醅微生物OTU分布的Venn分析Fig.4 Venn analysis of microbial OTUs in fermented grains between mechanized and traditional stack fermentation

2.2.3 基于門水平的微生物群落結構分析

將各類OTU的代表序列與Unite的數據庫比對，得到每個OTU在不同分類水平的物種分類信息。高通量測序顯示所有糧醅中的細菌種群可歸屬于21 個門，如圖5a所示，不同堆積方式下糧醅微生物可歸為Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes 4 個主要細菌門，其相對豐度均大于1.00%；其中，Firmicutes和Proteobacteria的相對豐度均大于22.00%，是堆積糧醅中的優勢細菌門。不同堆積方式下，糧醅表層和內部的微生物基于門水平的細菌群落結構分布差異并不明顯，同樣以上述4 個細菌門為主。

圖5 不同堆積方式下糧醅微生物基于門水平的群落結構分布圖Fig.5 Microbial community structure at the phylum level in fermented grains

高通量測序顯示所有糧醅中的真菌種群可歸屬于10 個門，如圖5b所示，不同堆積方式下糧醅微生物可歸為Ascomycota和Mucoromycota 2 個主要真菌門，其相對豐度均大于1.00%；其中，Ascomycota為絕對優勢真菌門，其在不同樣品中的相對豐度均大于60.00%。另外，堆積結束后糧醅中Ascomycota的相對豐度均大于95.00%（AS4、AI4、TS4和TI4）。研究表明，Ascomycota是醬香[14]、清香[15]、濃香[16]等香型白酒酒醅中的主要真菌門，該菌門是白酒發酵過程中的關鍵真菌門。不同堆積方式下，糧醅表層和內部基于門水平的真菌群落結構分布有所差異，尤其是堆積結束后糧醅的真菌群落結構明顯差異于堆積前。

2.2.4 基于屬水平的微生物群落結構分析

如圖6a所示，不同堆積方式下糧醅微生物可歸為Bacillus、Weissella、Acetobacter和Ralstonia4 個主要細菌屬，其相對豐度均大于1.00%。其中，Bacillus具有較強的分泌蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶能力，具有耐高溫、產酶、產香的功能，其主要代謝產物包括吡嗪類、酮類、丙酸、1,3-丁二醇、乙酸、甲酯等風味物質[17]。Weissella在白酒發酵過程中可代謝產生乳酸、乙酸等有機酸類物質，Acetobacter在白酒發酵過程中能將乙醇轉化為乙酸，酸類物質是白酒中重要的風味物質及酯類合成的前體物質。不同堆積方式下，堆積結束后糧醅內部Bacillus相對豐度明顯高于糧醅表層，這可能與糧醅堆內部的溫度高于表層有關。與機械化堆積方式相比，傳統堆積糧醅Acetobacter相對豐度明顯較高；同時，傳統堆積糧醅表層Acetobacter相對豐度明顯高于內部，這可能與糧醅表層的溫度低于內部有關。

圖6 不同堆積方式下糧醅微生物基于屬水平的群落結構分布圖Fig.6 Microbial community structure at the genus level in fermented grains

如圖6 b 所示，不同堆積方式下糧醅微生物可歸為Aspergillus、Lichtheimia、Candida、Pichia、Wickerhamomyces、Saccharomyces6 個主要真菌屬，其相對豐度均大于1.00%；同時，隨著堆積時間延長，Pichia和Saccharomyces相對豐度逐漸增高。機械化堆積過程中Aspergillus的相對豐度逐漸降低，Pichia相對豐度逐漸增高；同樣，傳統堆積也表現出相似的規律。堆積結束后糧醅中Pichia相對豐度均大于54.00%（AS4、AI4、TS4和TI4），其在糧醅表層和內部的相對豐度差異不明顯。機械化堆積方式下，堆積結束后糧醅表層和內部Pichia相對豐度均大于90.00%（AS4、AI4），明顯高于傳統堆積。傳統堆積方式下，堆積結束后糧醅表層和內部Wickerhamomyces相對豐度均大于2.00%（TS4、TI4）并明顯高于機械化堆積，Saccharomyces相對豐度均明顯高于機械化堆積。研究表明，Wickerhamomyces和Pichia在釀酒中主要起到產香的作用，同時具有產酒代謝能力，Saccharomyces是酒醅中主要的產酒酵母[18]。

2.3 基于物種分類屬水平的微生物群落演替Heatmap分析

糧醅堆積過程中大曲、糧醅和環境微生物相互影響，不同堆積深度的溫度、空氣、糧醅營養狀況等均存在差異；同時，機械化堆積環境相對封閉，導致不同堆積時間或深度的優勢菌群存在差異。如圖7所示屬水平上豐度前20的微生物群落Heatmap圖，顏色越接近綠色表示該菌屬的相對豐度越高，顏色越接近棕色表示該菌屬的相對豐度越低。

圖7 不同堆積方式下糧醅微生物基于屬水平的Heatmap圖Fig.7 Heatmap of microbial community at the genus level in fermented grains

由圖7a可知，機械化堆積方式下，AS1、AS2、AS3、AS4區域中相對豐度大于1.00%的微生物分別對應有9、12、12、13 種。不同堆積方式下，不同堆積時間的糧醅中沒有共有的優勢細菌屬，其中至少有2 個區域相對豐度均較高的細菌屬，包括Lactobacillus、Sphingomonas、Acinetobacter、Rhodococcus和Pseudomonas。Bacillus在AS1、AS2、AS3、AS4區域中的相對豐度均較高，分別為 18.1%、19.46%、22.59%、7.47%；同樣，Bacillus在TS1、TS2、TS3、TS4區域中的相對豐度也較高，分別為 11.87%、18.51%、17.45%、4.69%。綜上表明，由于細菌類群的耐受性、適應性更強，對糧醅表面而言，機械化堆積方式下Bacillus的相對豐度均高于傳統堆積；對糧醅內部而言，Bacillus、Weissella、Ralstonia3 個細菌屬在AI4的相對豐度均大于TI4。

由圖7b可知，機械化堆積方式下，AS1、AS2、AS3、AS4區域中相對豐度大于1.00%的微生物分別對應有5、4、5、3 種。不同堆積方式下，不同堆積時間的糧醅中沒有共有的優勢真菌屬，其中至少有2 個區域相對豐度均較高的真菌屬有Pichia、Aspergillus、Rhizopus、Lichtheimia和Candida。在TS1、TS2、TS3、TS4區域中分別對應有9、8、10、6 種相對豐度大于1.00%的真菌屬，其中至少有2 個區域相對豐度均較高的真菌屬有Pichia、Aspergillus、Rhizopus、Saccharomyces、Byssochlamys、Thermomyces、Lichtheimia、Millerozyma、Wickerhamomyces、Candida和Rhizomucor，上述真菌屬是復合香型糧醅機械化堆積過程中的重要真菌屬。其中，Aspergillus能產生多種酶類，對大曲和酒醅的糖化力、酯化力、液化力等起到積極的調控作用；同時，該菌屬可通過代謝有機酸和脂肪酸，以促成芳香酯類物質的生成，有利于提升和改善酒體風味[19-20]。

對糧醅內部而言，Pichia、Byssochlamys在AI4的相對豐度明顯大于TI4；同時，Saccharomyces、Hyphopichia、Millerozyma、Dipodascus、Wickerhamomyces5 個真菌屬在AI4的相對豐度均低于TI4。研究表明，Wickerhamomyces是重要的生香酵母，其具有耐高酸度和產酯能力強的特點，發酵糧醅中該菌屬主要來源于大曲的添加[6]。多種酵母菌屬能在酯酶的作用下合成酯類及其他風味物質，從而賦予酒體濃郁的芳香，對酒體的豐滿也具有重要作用，該菌屬是影響白酒風味和質量的重要因素[21]。綜上表明，堆積過程中存在釀酒微生物的交換、演替和富集，具有網絡環境中酵母菌的作用，同時還可能直接產生豐富的呈香呈味物質及其前體物質。有研究表明，在堆積發酵過程中控制適宜的微生物種類和數量對出酒率和原酒質量都具有重要影響[22]；同時，穩定有效地調控糧醅堆積過程，有利于為入窖發酵提供合適的微生物及代謝產物基礎；因此，糧醅微生物的富集情況、相互作用及環境因素影響還需要深入研究。

2.4 基于物種分類屬水平的微生物關聯網絡分析

關聯網絡分析主要用于尋找特定微生物群落在時空變化或環境過程驅動下所呈現的共現或互斥的固有模式，進而分析環境差異或實驗處理所導致的群落物種裝配差異，并尋找撬動群落組成變化的關鍵菌群或物 種[23]。如圖8所示，其中節點代表樣本中的擴增子序列變異或OTU，節點大小與其豐度呈正比，選擇按物種組成比例注釋節點；節點間連線表示被連接的兩個節點之間存在相關性，紅色線條表示不同物種之間存在負相關，綠色線條表示不同物種之間存在正相關。

圖8 不同堆積方式下糧醅微生物基于屬水平的共現性關聯網絡圖Fig.8 Cooccurrence network diagram of microbial communities at the genus level in fermented grains

在白酒固態發酵過程中，核心及關鍵微生物菌群的結構組成及其功能決定了白酒的風格及品質[14,24]。由圖8a可知，Bacillus、Lactobacillus、Staphylococcus等細菌屬與其他細菌屬的正相關性比較密切，屬于堆積糧醅中的核心細菌菌群；同時，Bacillus和Lactobacillus之間存在明顯的負相關。由圖8b可知，Aspergillus、Pichia、Lichtheimia等真菌屬與其他真菌屬的正相關性比較密切，屬于堆積糧醅中的核心真菌菌群；同時，Lichtheimia和Saccharomyces之間以及Pichia和Saccharomyces、Thermomyces之間均存在明顯的正相關。綜上表明，上述6 個菌屬所組成的核心微生物菌群是糧醅堆積發酵過程中的關鍵菌群。

機械化堆積方式對環境因子的影響以及微生物的相互作用，導致了真菌類群在種類和相對豐度上的差異，如Pichia、Aspergillus等真菌屬得以富集；同樣，對細菌類群也存在一定影響，如Bacillus、Weissella等細菌屬得以富集。糧醅堆積發酵過程中的Pichia主要來源于釀造環境，其具有較好的熱耐受性及較強的競爭效應[25]。研究表明，酸度、還原糖和溫度是釀造過程中細菌群落變化的決定因素，在真菌群落演替過程中釀酒酵母占據主導地位[26]。傳統堆積方式下，糧醅堆積過程中微生物得以不斷馴化和富集，如Acetobacter等細菌屬，Saccharomyces、Byssochlamys、Wickerhamomyces等真菌屬，其中的Saccharomyces與主要醇類、酯類和醛類的含量密切相關[27]。由于稻殼、大曲、糧食（堆積糧醅）等的不斷補充和循環發酵，導致白酒發酵體系內外存在微生物的交換、演替和富集，并且空氣流動、配糟發酵、物料交換等因素也導致不同釀造環節之間的微生物相互影響[7]。糧醅堆積過程中形成了獨特的微生物菌群結構，富集的微生物菌群代謝產生豐富的發酵酶類和風味物質，對酒體風味的形成具有重要作用[28-29]。

3 結論與討論

本研究通過高通量測序技術解析糧醅機械化和傳統堆積發酵過程中的微生物群落結構變化，得到的結論主要有：1）不同堆積方式下的糧醅微生物可歸為Bacillus、Weissella、Acetobacter和Ralstonia4 個主要細菌屬，Aspergillus、Lichtheimia、Candida、Pichia、Wickerhamomyces和Saccharomyces6 個主要真菌屬；2）機械化堆積方式下，細菌屬的多樣性明顯高于傳統堆積，真菌屬的多樣性明顯低于傳統堆積；同時，糧醅表層的細菌多樣性低于糧醅內部，而糧醅表層的真菌多樣性高于糧醅內部；3）不同堆積方式下，不同堆積時間的優勢微生物類群存在差異，堆積過程中存在釀酒微生物的交換、演替和富集；4）Bacillus、Lactobacillus、Staphylococcus細菌屬，以及Aspergillus、Pichia、Lichtheimia真菌屬，上述6 個菌屬所組成的核心微生物菌群是糧醅堆積發酵過程中的關鍵菌群。

糧醅堆積發酵過程中的內源性理化因子，如乙醇、水分、酸度以及溫度等因素都會由于發酵過程中的微生物代謝方式或活性的改變而發生改變，進而影響微生物的群落組成[30]。由于糧醅堆積表層和內部存在空氣、溫度及濕度等條件的差異，同時糧醅堆積表面積不同導致糧醅與環境微生物的交換情況也存在差異，均有可能導致不同堆積方式下糧醅表層和內部微生物種類及豐度的差異。機械化車間和傳統車間在使用年限、車間環境等方面的不同導致環境微生物存在差異[31]，同時糧醅堆積過程中差異性地網羅了環境中的功能優勢菌屬[32]，也是導致堆積糧醅微生物結構差異的重要原因。環境微生物是發酵菌群的重要來源，在驅動白酒發酵微生物的演替和代謝過程中具有重要作用[33]。本研究有利于揭示糧醅機械化堆積的微生物群落結構組成及差異，為持續優化復合香型白酒的機械化釀造工藝提供依據。由于機械化堆積和傳統堆積在工藝和環境等方面的差異，導致糧醅微生物多樣性及優勢微生物菌群的篩選、富集也有所差異。本研究中發現的糧醅差異微生物菌屬，對釀造環境的應答特性、遷移規律以及對白酒釀造的影響最終會影響原酒感官品質，因此還需后續進一步深入分析和跟蹤研究。