熱處理香榧種子油中美拉德產物的生成及其對兩種總酚測定方法的影響

許曉君，羅 凡，方學智，杜孟浩，胡立松，龍奇志，鐘海雁

（1.中國林業科學研究院亞熱帶林業研究所，浙江 杭州 311400；2.中南林業科技大學食品科學與工程學院，湖南 長沙 410004）

酚類物質可清除或減少自由基、螯合過渡金屬離子、抑制氧化應激酶活性并促進抗氧化劑發揮作用，具有抗氧化和抗癌等功效[1]，是植物油等食品中的功能活性成分之一，也是維持油脂氧化穩定性的關鍵成分。目前酚化合物的測定主要基于分光光度法、光譜法、比色法、酶法、電化學法和色譜技術等，其中基于分光光度法的福林-酚法在總酚測定中應用廣泛。福林-酚法測定總酚的基本原理是：在堿性條件下，福林-酚試劑（磷鉬酸-磷鎢酸）被酚羥基還原，生成藍色化合物，后者在堿性環境中可被氧化成醌類化合物，該物質在765 nm波長處可被紫外-可見分光光度計檢出[2]。由于福林-酚法操作簡單且反應迅速，橄欖油[3]、葵花籽油[4]、花生油[5]及茶油[6]等植物油的總酚定量多采用該法進行。然而，該法選擇性較差，試樣中除酚化合物外的蛋白質、氨基酸、糖類、不飽和脂肪酸、維生素、醛、酮等物質都可能會干擾測定結果。Kanzler等[7]發現美拉德反應的中間產 物——二羰基化合物具有還原福林-酚試劑的潛力，但目前針對活性美拉德產物干擾植物油總酚含量及方法改良的研究尚少。

研究[8-9]發現固藍BB鹽（fast blue BB，FBBB）的重氮基團與帶活性羥基的芳香環可耦合生成穩定的偶氮衍生物，該物質在420 nm波長處可被紫外-可見分光光度計檢出，由此開發出了一種新的酚化合物定量方 法——FBBB法?；谠摲ǖ臏y定原理，食品基質中VC和還原糖等物質的存在不會對總酚定量造成干擾，說明FBBB法的選擇性更優、定量準確可靠。Nowak[10]和López-Froilán[11]等的研究結果皆證實了FBBB法不受VC干擾的觀點，發現了該法在水果飲料總酚測定上的應用潛力。Lester等[12]在測定添加了VC和果葡糖漿飲料的總酚時發現，FBBB法測得的沒食子酸當量值高于福林-酚法，體現了FBBB法測定總酚的高靈敏度。Pico等[13]比較了兩法在豆類、谷物、水果、堅果和植物種子的總酚測定中受干擾的程度，發現FBBB法不易受影響。然而，目前FBBB法主要應用于水相基質的總酚測定中，Siano等[14]研究了FBBB法直接測定不同橄欖油總酚的可能性，發現相較于福林-酚法，FBBB法的測定結果更接近于液相色譜法，但該法在其他食用植物油中的應用研究仍有欠缺。

香榧籽是紅豆杉科榧屬常綠喬木香榧（Torreya grandiscv.Merrilli）的果實，其含油率高且油脂的營養和活性成分豐富、經濟價值高。熱處理是香榧種子油制備工藝中必不可少的加工環節，不僅可以降低水分還可以提高出油率并賦予油脂特征風味。Shi Longkai等[15]還發現熱壓香榧種子油比冷壓油具有更強的抗氧化能力。

本研究以分析兩種方法（福林-酚法與FBBB法）在測定相同熱預處理香榧種子油總酚時存在差異的原因為切入點，通過測定油脂褐變指數及3-脫氧葡萄糖醛酮（3-deoxyglucosone，3-DG）、丙酮醛（methylglyoxal，MGO）和5-羥甲基糠醛（5-(hydroxymethyl)furfural，5-HMF）3 種常見美拉德產物含量驗證美拉德反應的發生，隨后進一步考察3 種產物對福林-酚法和FBBB法測定總酚的影響，為美拉德產物對福林-酚法測定油脂中總酚的影響研究提供依據，也為總酚測定方法的科學選擇提供一定支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香榧籽購自杭州富陽洪鑫農業開發有限公司，經自然晾干后置于鼓風干燥箱內，分別在0、60、90、120、150 ℃加熱0、30、60、90、120 min后取出。冷卻、脫殼后液壓制油，香榧種子油經過濾后于4 ℃貯藏備用。

福林-酚試劑、MGO（純度98%）、鄰苯二胺（純度99.5%）上海麥克林生化科技有限公司；FBBB、沒食子酸（純度99%）、5-HMF（純度98%）美國Sigma-Aldrich公司；3-DG（純度75%）加拿大Toronto Research Chemicals公司；正己烷、甲醇（均為色譜純）、冰醋酸（分析純）、碳酸鈉、氫氧化鈉 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

DGG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海森信實驗儀器有限公司；源豐液壓榨油機 洛陽市佳源機械有限公司；S-114電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司；XW-80A旋渦混合儀 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；HWS-26電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司；UV-2550紫外分光光度計 日本島津 公司；Q-101平行蒸發儀 瑞士Büchi公司；V-500多管真空固相萃取裝置、LC-10AT型液相色譜系統（配有可變波長紫外檢測器和CDS A.02.19色譜工作站）美國 安捷倫公司；二醇基固相萃取柱（500 mg，3 mL）美國Agela公司；有機相針式濾器（13 mm，0.22 μm）上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 香榧種子油總酚的提取與測定

1.3.1.1 香榧種子油總酚提取液的制備

參考Flores等[16]的方法并略作修改。用10 mL甲醇和10 mL正己烷先后淋洗二醇基固相萃取柱，活化后備用。分別稱取2 g不同加熱條件所制香榧種子油（1.1節）溶于5 mL正己烷中，混合均勻后過已活化的二醇基固相萃取柱，用10 mL正己烷過柱清洗后再用10 mL甲醇洗脫固相萃取柱。收集洗脫液，于40 ℃蒸干，用50%甲醇復溶后得香榧種子油總酚提取液。

1.3.1.2 福林-酚法測定總酚

參考Huang Zhiting等[17]的方法并略作修改。取1 mL 1.3.1.1節中制備的香榧種子油總酚提取液，加入0.5 mL福林-酚試劑，反應3 min后加入1 mL 20%碳酸鈉溶液，定容至10 mL后顯色90 min，于765 nm波長處測定吸光度。以沒食子酸為標準樣品繪制標準曲線，總酚含量以每克樣品中沒食子酸當量表示（μg/g）。

1.3.1.3 FBBB法測定總酚

參考Medina[9]的方法并略作修改。取1 mL 1.3.1.1節中制備的香榧種子油總酚提取液，加入8 mL去離子水與0.5 mL 0.1% FBBB試劑，充分混合后加入0.5 mL 5%氫氧化鈉溶液，混勻后顯色90 min，于420 nm波長處測定吸光度。以沒食子酸為標準樣品繪制標準曲線，總酚含量以每克樣品中沒食子酸當量表示（μg/g）。

1.3.2 香榧種子油褐變指數與美拉德產物的測定

1.3.2.1 褐變指數測定

參考Zhang Nana等[18]的方法并略作修改。分別稱取0.5 g不同預熱條件所制香榧種子油，用正己烷（1∶10，g/mL）溶解稀釋，分別于294、420 nm波長處測定吸光度。

1.3.2.2 3-DG、MGO測定

參考楊楠等[19]的方法并略作修改。分別稱取0.5 g不同加熱條件所制香榧種子油，用甲醇萃取3 次后定容至10 mL得美拉德產物提取液，冷藏備用。取2 mL美拉德產物提取液與1 mL 0.25 mg/mL的鄰苯二胺溶液混合，用氫氧化鈉溶液調節體系pH值至9后置于60 ℃水浴鍋中反應4 h，衍生處理樣液過0.45 μm濾膜后應用高效液相色譜儀測定。標準品溶于甲醇后的處理與測定同上。

色譜條件：ZORBAX SB-Aq色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；柱溫40 ℃；進樣量10 μL；流速0.8 mL/min；流動相：A為0.1%冰醋酸溶液，B為甲醇；梯度洗脫程序：0.01～15 min，72%～57% A、28%～43% B；15.01～31 min，57%～25% A、43%～75% B；31.01～38 min，25%～72% A、75%～28% B；38.01～60 min，72% A、28% B；紫外檢測器；檢測波長314 nm。

1.3.2.3 5-HMF測定

取2 mL 1.3.2.2節所制備的美拉德產物提取液，過0.45 μm濾膜后應用高效液相色譜儀測定。標準品溶于甲醇后的處理與測定同上。

色譜條件：ZORBAX SB-Aq色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；柱溫40 ℃；進樣量10 μL；以50%甲醇溶液為流動相；洗脫時間15 min；流速0.7 mL/min；紫外檢測器；檢測波長280 nm。

1.3.3 美拉德產物對總酚測定的影響

1.3.3.1 福林-酚法、FBBB法測定3-DG、MGO及5-HMF溶液

用甲醇分別溶解MGO、3-DG和5-HMF，配制成質量濃度梯度為0、42.4、84.8、127.2、169.6、212 μg/mL的溶液，分別替代1.3.1.2、1.3.1.3節中的總酚提取液進行福林-酚法與FBBB法的總酚測定。

1.3.3.2 3-DG的存在對沒食子酸溶液總酚測定的影響

3-DG對不同質量濃度沒食子酸溶液總酚測定的影響：配制100 μg/mL 3-DG甲醇溶液，分別與0、40、80、100、160、200、300 μg/mL沒食子酸溶液等體積混合，配制成不同質量濃度比（沒食子酸∶3-DG＝0～3）的復合溶液。將復配溶液分別替代1.3.1.2、1.3.1.3節中的總酚提取液進行福林-酚法與FBBB法的總酚測定。

不同質量濃度3-DG對沒食子酸溶液總酚測定的影響：配制100 μg/mL沒食子酸甲醇溶液，分別與0、20、50、100、200、300、500、600 μg/mL 3-DG甲醇溶液等體積混合，配制成不同質量濃度比（3-DG∶沒食子酸＝0～6）的復合溶液備用。將復配溶液分別替代1.3.1.2、1.3.1.3節中的總酚提取液進行福林-酚法與FBBB法的總酚測定。

1.4 數據處理

實驗數據為3 次重復平均值。分別采用Microsoft Excel 2010軟件與Origin Pro 9.1軟件進行數據處理與作圖，使用SPSS 21.0軟件對數據進行差異顯著性分析（P＜0.05，差異顯著）。

2 結果與分析

2.1 加熱處理對香榧種子油總酚含量的影響

圖1A顯示，福林-酚法測定下，香榧籽在60 ℃與120 ℃處理60～90 min、150 ℃處理時間超過60 min時，油樣中總酚含量顯著升高（P＜0.05），這與羅凡等[20]對油茶籽油的研究結果一致。一些酚類物質往往與蛋白質結合，加熱條件下蛋白質可能發生變性，導致這部分結合酚釋放[21]；還可能是因為加熱抑制了脂氧合酶的活性，減少了自由基的生成，從而延緩了酚含量的下降。除上述原因外，香榧籽加熱引發美拉德反應產生的某些還原性物質可能參與酚類物質和福林-酚試劑的反應導致總酚測定結果偏大。與未經熱處理香榧種子油相比，加熱引起油樣中總酚含量普遍下降，最大降幅為67%（60 ℃、120 min）。這可能是因為酚類物質具有熱不穩定性，高溫破壞羥基酸等物質的結構，造成總體含量下降[22]；還可能與還原性美拉德產物發生降解，而降解產物不具有還原酮等抗氧化基團結構[23]有關。

圖1 福林-酚法（A）、FBBB法（B）測定熱處理香榧種子油的總酚含量Fig.1 Total phenolic contents of heat-treated Torreya grandis cv.Merrilli seed oil determined by Folin-Ciocalteu (A) and Fast Blue BB assays (B)

圖1B顯示，FBBB法測定中，香榧籽在150 ℃熱處理90～120 min時，總酚含量隨加熱時間的延長顯著減小（P＜0.05），這與相同條件下福林-酚法的測定結果相反，該差異可能與美拉德產物對兩法的干擾程度不同有關。多數美拉德產物不具有帶活性羥基的芳香環結構，無法與FBBB試劑的重氮基團耦合生成穩定的偶氮衍生物，FBBB法不受這類美拉德產物的干擾。此外，還發現采用兩種方法測定相同的酚提取液，FBBB法測得的沒食子酸當量值總體高于福林-酚法，這與Lester等[12]的研究結果一致，可能與沒食子酸在不同反應體系中的響應存在差異有關。

2.2 熱處理香榧種子油中美拉德產物的測定

2.2.1 加熱處理對香榧種子油褐變指數的影響

圖2A顯示，在294 nm波長處，相同預處理時間下香榧種子油的吸光度總體隨加熱溫度的升高而增大。低溫（60、90 ℃）預處理下，90 min后香榧種子油在294 nm波長處的吸光度明顯增大；而在高溫（120、150 ℃）預處理下，香榧種子油的吸光度更早地開始逐步升高，表明低溫長時熱處理及高溫處理皆會促進美拉德中間產物的形成。Haase等[23]的研究也發現溫度改變會顯著影響二羰基化合物等美拉德中間產物的形成和積累。圖2B顯示，在420 nm波長處，60 ℃低溫下香榧種子油吸光度隨加熱時間的延長變化不顯著（P＞0.05），經90 ℃處理油脂在加熱60 min后吸光度顯著升高（P＜0.05），而在120、150 ℃油脂吸光度升高的時間點皆有所提前，分別為30 min和0 min。此外，油脂在90、120 ℃下加熱超過90 min后吸光度顯著下降（P＜0.05），這可能與長時熱處理下美拉德產物的降解速率大于生成速率有關。150 ℃高溫處理下，香榧種子油的吸光度在加熱超過60 min后持續升高，推測有美拉德反應終產物大量形成。上述現象表明，對香榧籽進行一定程度的熱處理會促進油脂中美拉德產物的形成，且其濃度受加熱溫度和時間的影響。

圖2 不同熱處理香榧種子油在294（A）、420 nm（B）波長處的吸光度Fig.2 Absorbance at 294 (A) and 420 nm (B) of heat-treated T.grandis cv.Merrilli seed oil

2.2.2 熱處理香榧種子油中3-DG、MGO及5-HMF的測定

課題組前期研究已發現在經二醇基小柱萃取所得的總酚提取液中有多種美拉德產物的存在。因此對不同溫度、時間預處理香榧種子油中3-DG、MGO及5-HMF的含量進行測定并計算其在總酚提取液中的質量濃度，如表1所示。

表1 不同熱處理香榧種子油中3-DG、MGO及5-HMF的含量及其在 酚提取液中的質量濃度Table 1 Contents of 3-DG,MGO and 5-HMF in heat-treated T.grandis cv.Merrilli seed oil and concentrations of 3-DG,MGO and 5-HMF in phenolic extract from the oil

MGO是活性C6-α-二羰基化合物裂解形成的短鏈α-二羰基化合物[24]，在各加熱條件的香榧油樣中皆有檢出，含量范圍為0.67～1.73 μg/g，略高于同條件下油茶籽油[25]中檢出的MGO含量，這可能與不同油料種子中糖類與氨基酸的組成與含量存在差異、MGO前體物質的積累等因素有關。3-DG屬于二羰基類化合物，是影響食品基質中美拉德產物組成的重要前體物質[26-27]，5-HMF是其主要降解產物[28]。兩種物質僅在經150 ℃熱處理的油樣中檢出，且含量隨加熱時間的延長而不斷增加，含量范圍分別為0.21～0.47、0.06～0.40 μg/g，這可能是因為適當提高加熱強度能促進3-脫氧半乳糖等同類二羰基化合物向3-DG轉化[29]；還能加速糖類物質的脫水或同質異構化，促進了5-HMF的產生。上述結果表明，在本實驗條件下，香榧種子中的3-DG或同類活性二羰基化合物主要裂解形成了短鏈α-二羰基化合物，而在高溫長時下還會發生降解，產物經榨油工藝轉移至香榧種子油中。

2.3 美拉德產物對總酚測定的影響

2.3.1 美拉德產物對福林-酚法及FBBB法測定總酚的影響

圖3A顯示，在0～212 μg/mL質量濃度范圍內，福林-酚法測定下3-DG組的吸光度隨質量濃度增大呈線性升高（相關系數（R2）＝0.998），且在765 nm波長處的響應強于其他兩組。MGO組的吸光度雖隨質量濃度增大呈線性升高（R2＝0.966），但升高幅度不大，說明α-二羰基化合物及其復合物解聚后還原能力減弱。5-HMF 組的吸光度隨質量濃度增大變化不顯著（P＞0.05），表明α-二羰基化合物降解后基本失去對福林-酚試劑的還原能力。結果表明，MGO和3-DG的存在會對福林-酚法測定樣品總酚造成一定的干擾，且3-DG的影響最大，而5-HMF的影響不明顯。圖3B顯示，在相同質量濃度范圍內，FBBB法測定下3 種美拉德產物在420 nm波長處測得的吸光度變化不顯著（P＞0.05）。結合2.2.2節中3-DG、MGO分別在150 ℃油樣、所有油樣中檢出，圖1中兩法在150 ℃、90 min后總酚測定結果的差異可能與MGO和3-DG的存在對福林-酚法的干擾有關，但由于兩種產物在香榧種子油總酚提取液中濃度較低，其對測定的干擾程度仍有待探究。

圖3 3 種美拉德產物對福林-酚法（A）、FBBB法（B）測定總酚的影響Fig.3 Effects of three MRPs on the quantification of total phenolics by Folin-Ciocalteu (A) and Fast Blue BB assays (B)

2.3.2 3-DG對總酚測定的影響

2.3.1 節的研究結果表明，3 種美拉德產物中3-DG對福林-酚法測定樣品總酚的影響最大，進一步考察該物質對不同質量濃度沒食子酸體系總酚測定的影響及其質量濃度變化對兩種總酚測定方法的干擾，結果分別如 圖4、5所示。

圖4 3-DG對福林-酚法（A）、FBBB法（B）測定不同質量濃度 沒食子酸體系總酚的影響Fig.4 Effects of 3-DG on the quantification of total phenolics in gallic acid systems by Folin-Ciocalteu (A) and Fast Blue BB assays (B)

圖4顯示，在兩法測定下，單一組和復合組的總酚含量與沒食子酸質量濃度線性關系均良好，福林-酚法R2分別為0.997和0.995，FBBB法R2分別為0.989和0.996。相同沒食子酸添加質量濃度下福林-酚法測定復合組總酚含量高于單一組，測定差值隨沒食子酸質量濃度變化差異不顯著（P＞0.05），表明3-DG的存在會造成福林-酚法測定結果偏大且干擾程度與樣品總酚含量無關，樣品中總酚含量越低，測定結果誤差越大。此外，福林-酚法對兩組總酚的測定差值大于FBBB法，說明3-DG對前者的影響較大，該發現與2.3.1節的研究結果一致。因此，針對鷹嘴豆[30]、燕麥[31]及植物油[32]等這類加工過程可能經歷膨化、焙烤及熱預處理等工藝而總酚含量又相對較低的食品，選擇FBBB法進行總酚定量可有效減小因美拉德產物存在而引起的誤差。

圖5A顯示，添加3-DG質量濃度不小于25 μg/mL情況下，福林-酚法測定復合組的總酚含量顯著大于沒食子酸組（P＜0.05），且隨著3-DG質量濃度的增大，總酚含量呈線性增大趨勢（R2＝0.998），表明3-DG對該法測定總酚的影響具有濃度依賴性。Nederal等[33]研究發現，南瓜籽經加熱后榨取的油脂中美拉德活性產物濃度與總酚含量提升明顯，并將后者歸因于結合態酚向游離態酚的轉變；本研究結果說明，該現象還可能與美拉德活性產物引起福林-酚法定量誤差有關。圖5B顯示，FBBB法測定下，隨著3-DG質量濃度的增大，復合組的總酚含量與沒食子酸組相比皆無顯著變化（P＞0.05），表明在此實驗體系下3-DG質量濃度改變對FBBB法的干擾有限。

圖5 3-DG質量濃度變化對福林-酚法（A）、FBBB法（B）測定總酚的影響Fig.5 Effect of 3-DG concentration on the quantification of total phenolics by Folin-Ciocalteu (A) and Fast Blue BB assays (B)

3 結論

香榧籽在150 ℃熱處理90～120 min時，福林-酚法測得油脂總酚含量上升，而FBBB法測定結果與之相反。對香榧種子油褐變指數進行測定，發現低溫長時熱處理及高溫處理皆會引起香榧種子油在294 nm波長處吸光度上升，指示美拉德中間產物的形成。在經高溫（150 ℃）處理的油樣中檢出了3-DG（0.21～0.47 μg/g）與5-HMF（0.06～0.40 μg/g），在各預熱條件的油樣中皆檢出了MGO（0.67～1.73 μg/g）。進一步考察3 種美拉德產物對兩種方法測定總酚的影響時發現，福林-酚法測定下3-DG、MGO在765 nm波長處的吸光度皆隨質量濃度增大呈線性升高，同質量濃度3-DG、MGO與5-HMF在此波長處的響應排序為3-DG＞MGO＞5-HMF，3-DG的存在會造成福林-酚法測定結果偏大且干擾程度與樣品總酚含量無關，而與其本身質量濃度呈正相關；FBBB法測定下，3 種美拉德中間產物在420 nm波長處的吸光度變化皆不顯著。因此，針對加工過程中易形成3-DG、MGO的食品基質，選擇FBBB法替代福林-酚法測定總酚可降低這兩種物質對定量的干擾。